Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Demonstratie van de DNA-vezeltest voor het onderzoeken van DNA-schade en reparatiedynamiek geïnduceerd door nanodeeltjes

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64903
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Biomedical Sciences, University of Illinois College of Medicine Rockford, 2Department of Health Sciences Education, University of Illinois College of Medicine Rockford

Summary

De methodologie helpt bij de analyse van variatie in DNA-replicatiedynamiek in de aanwezigheid van nanodeeltjes. Verschillende methodologieën kunnen worden aangenomen op basis van het cytotoxiciteitsniveau van het materiaal van belang. Daarnaast wordt een beschrijving van de beeldanalyse gegeven om te helpen bij DNA-vezelanalyse.

Abstract

Blootstelling aan nanomaterialen kan replicatiestress en genomische instabiliteit in cellen veroorzaken. De mate van instabiliteit hangt af van de chemie, grootte en concentratie van de nanomaterialen, het tijdstip van blootstelling en het blootgestelde celtype. Verschillende gevestigde methoden zijn gebruikt om op te helderen hoe endogene/exogene agentia de wereldwijde replicatie beïnvloeden. Testen op repliconniveau, zoals de DNA-vezeltest, zijn echter noodzakelijk om te begrijpen hoe deze middelen de replicatie-initiatie, beëindigingen en replicatievorkprogressie beïnvloeden. Als je dit weet, kan men beter begrijpen hoe nanomaterialen de kans op mutatiefixatie en genomische instabiliteit vergroten. We gebruikten RAW 264.7-macrofagen als modelcellen om de replicatiedynamiek onder blootstelling aan grafeenoxide nanodeeltjes te bestuderen. Hier demonstreren we het basisprotocol voor de DNA-vezeltest, waaronder pulslabeling met nucleotide-analogen, cellyse, het verspreiden van de pulsgelabelde DNA-vezels op dia's, fluorescerende immunostaining van de nucleotide-analogen in de DNA-vezels, beeldvorming van de replicatie-tussenproducten in de DNA-vezels met behulp van confocale microscopie en replicatie-intermediaire analyse met behulp van een computerondersteunde scoring en analyse (CASA) -software.

Introduction

Tijdens elke celcyclus zorgt DNA-replicatie voor nauwkeurige genoomduplicatie1. Eukaryote chromosomale replicatie hangt in wezen af van drie factoren: de timing van het afvuren van meerdere replicatieoorsprongen, de snelheid van de vorken die uit de gebakken oorsprong komen en de beëindiging van het replicatieproces wanneer twee replicatievorken van aangrenzende oorsprong elkaar ontmoeten2. Voor de high-fidelity overdracht van genetische informatie naar dochtercellen, evenals het behoud van genetische integriteit, is nauwkeurige DNA-replicatie cruciaal. Middelen die zich ontwikkelen uit een regelmatig metabolisme of te wijten zijn aan kunstmatige of natuurlijke omgevingsmaterialen vallen het genoom voortdurend aan. Deze endogene en exogene agentia zorgen ervoor dat replicatievorken vertragen of stoppen als gevolg van het tegenkomen van DNA-schade veroorzaakt door deze middelen, en de vorken die tijdelijk vertragen of stoppen als reactie op deze problemen wordt replicatiestressgenoemd 3. Als reactie op replicatiestress hebben cellen verschillende moleculaire routes ontwikkeld die de stabiliteit van de verstoorde replicatievorken behouden en hen in staat stellen opnieuw op te starten4. In termen van genetische stabiliteit, celoverleving en menselijke ziekte, zijn deze replicatiestressresponsmechanismen naar voren gekomen als de belangrijkste factoren voor het behoud van een gezond genoom, het waarborgen van celoverleving en het verminderen van de kans op ziektevorming5.

Een van de exogene agentia die replicatiestress kunnen produceren, zijn nanodeeltjes. Nanodeeltjes zijn deeltjes die in grootte variëren van 1 nm tot 100 nm6. Vanwege hun grote oppervlakken, onderscheidende vormen en unieke chemische eigenschappen worden nanodeeltjes gebruikt in verschillende medische, farmaceutische, milieu- en industriële toepassingen 7,8. Hoewel nanodeeltjes veel potentiële voordelen hebben, kunnen sommige (vanwege hun erfelijke aard of levensduur) giftig worden. Nanodeeltjes kunnen zich ook vormen als gevolg van de natuurlijke slijtage van medische implantaten en worden vrijgegeven in het peri-prothetische gebied 9,10.

Vanwege de blootstelling van mensen aan een groot aantal nanodeeltjes geproduceerd voor verschillende toepassingen, is het onderzoek op het gebied van nanodeeltjestoxiciteit de afgelopen 10 jaar enorm toegenomen11. Hoewel deze onderzoeksinspanningen informatie in overvloed hebben onthuld over de potentiële bedreiging die nanodeeltjes vormen voor de menselijke gezondheid, is de kennis over het potentieel voor nanodeeltjes om genotoxiciteit te veroorzaken nog steeds beperkt. Wat tot nu toe is ontdekt, is dat deze nanodeeltjes fysiek kunnen interageren met het DNA, DNA-schade kunnen bevorderen en de eiwitten die verantwoordelijk zijn voor het repareren of repliceren van DNA kunnen beschadigen of verstoren12. Om te detecteren hoe ze interfereren met DNA-replicatie, worden DNA-vezelkammen, radioresistente DNA-synthese (RDS) en DNA-vezelanalyse meestal gebruikt13,14,15,16.

De DNA-vezelkammethode is flexibel en geeft informatie over replicatievorkdynamica op het single-molecule niveau17. In wezen wordt een verzilte coverslip voorzichtig uit de DNA-oplossing getrokken zodra het DNA zich eraan bindt. De DNA-moleculen worden rechtgetrokken en uitgelijnd door de meniscus van de oplossing. De homogeniteit, afstand en uitlijning van de DNA-vezels ondersteunen nauwkeurige en betrouwbare vezelkanaallengtemetingen. Door de lengte en volgorde van de behandelingen en de medicijnen die worden gebruikt om stress of schade te veroorzaken aan te passen, kunnen veel aspecten van de vorkvoortgang worden gevolgd met behulp van deze applicatie. Bij deze methode wordt een dubbel labelsysteem gebruikt, waarmee de snelheid en progressie van de replicatievork worden beoordeeld17,18. Aan de andere kant maakt 2D-gel-elektroforese gebruik van het feit dat, bij agarose-gel-elektroforese, vertakkende DNA-structuren langzamer reizen dan lineaire DNA-moleculen van dezelfde massa, waardoor de twee in een 2D-run kunnen worden gescheiden. In feite wordt deze methode onderzocht om DNA-moleculen te scheiden op basis van hun massa in de eerste run en op basis van hun vorm in de tweede orthogonale run. Na genomische DNA-fragmentatie ontwikkelen de ongewone replicatie- en recombinatietussenproducten een vertakkende vorm en kunnen ze worden onderscheiden van de meer gebruikelijke lineaire moleculen in de 2D-gel19.

De RDS-methode wordt gebruikt om te bepalen hoe de wereldwijde DNA-synthese wordt beïnvloed. Bij deze methode wordt de mate van remming van globale replicatie bepaald door de hoeveelheid geïncorporeerde radioactief gelabelde nucleotiden, zoals [14C] thymidine, in onbehandelde versus behandelde cellen te vergelijken14,20. Het procentuele verschil in radiolabeling tussen de onbehandelde en behandelde cellen vertegenwoordigt de mate waarin het DNA-beschadigende agens de DNA-synthese beïnvloedt. Vergelijkbaar hiermee gebruikt een andere methode het vermogen van cellen om nucleotide-analogen zoals BrdU (5-broom-2′-deoxyuridine) te integreren voor flowcytometrie om de totale snelheden van DNA-synthese te meten21,22. Hoewel deze methoden aantonen hoe DNA-beschadigende stoffen de wereldwijde DNA-synthese beïnvloeden, laten ze niet zien hoe individuele replicons worden beïnvloed. Inderdaad, replicon-niveau assays zijn noodzakelijk om de initiatie en omvang van genomische instabiliteit in het geval van blootstelling aan toxische deeltjes (nanomateriaal) beter te begrijpen. DNA-vezelautoradiografie en elektronenmicroscopie zijn enkele methoden die worden gebruikt om deze23,24,25,26 te bepalen.

De concepten van replicatiebellen en bidirectionele replicatie van ongelijk verdeelde bronnen werden voor het eerst ontwikkeld met behulp van single-molecule tests zoals elektronenmicroscopie en DNA-vezelautoradiografie27,28. De directe waarneming van vertakkende replicatie-tussenproducten op specifieke moleculen verspreid over een met koolstof bedekt raster wordt aanzienlijk vergemakkelijkt door elektronenmicroscopie. Deze methode, die vandaag de dag nog steeds wordt gebruikt om pathologische verschuivingen bij replicatievorken te volgen, werd gebruikt om de eerste eukaryote oorsprong van DNA-replicatiete lokaliseren 28. Vezelautoradiografie is gecentreerd rond het concept van de autoradiografische identificatie van nieuw gerepliceerde gebieden en de pulslabeling van chromosomen met tritiated thymidine. De eerste kwantitatieve evaluatie van oorsprongsdichtheden en replicatievorksnelheden in metazoaire genomische sequenties werd mogelijk gemaakt door DNA-vezelautoradiografie29.

Momenteel hebben vezelfluorografiemethoden de plaats ingenomen van autoradiografie, vooral omdat vezelfluorografie veel sneller is dan autoradiografie. In vezelfluorografie worden twee gehalogeneerde nucleotidederivaten, zoals broom- (Br), chloor- (Cl) of iododeoxyuridine (IdU), achtereenvolgens opgenomen in vers gerepliceerd DNA en vervolgens geïdentificeerd door indirecte immunofluorescentie met behulp van antilichamen30. Microscopisch kijken van het ontluikende DNA dat een of beide analogen heeft opgenomen, wordt mogelijk gemaakt door immunostaining van een van de analogen in één kleur en de andere analoog in een andere kleur (bijvoorbeeld immunostaining nascent DNA met opgenomen IdU-rood en opgenomen CldU-groen) (figuur 1) 21. Veel verschillende soorten replicatie-tussenproducten kunnen worden geïdentificeerd door DNA-vezelanalyse. De meest bestudeerde zijn individuele rekvorken, initiaties en beëindigingen. Individuele langwerpige vorken hebben een replicatiepatroon van rood gevolgd door groen (rood-groen; Figuur 2A). 13 De lengtes van deze tussenproducten worden vaak gebruikt om de vorksnelheid (d.w.z. vorklengte/pulstijd) of de exonucleolytische afbraak van ontluikend DNA door spoorverkorting te meten (figuur 2E)30,31,32. In een studie van Mimitou et al. werd gevonden dat bij langdurige blootstelling aan hydroxyurea, een replicatiegif dat dubbelstrengsbreuken in het DNA veroorzaakt, RE11 werd gerekruteerd33. MRE11 is een exonuclease die bekend staat om zijn 3'-5' exonuclease-activiteit en het is in staat om de uiteinden van DNA te knippen voor reparatie. Daarom kan men bij blootstelling aan toxische agentia exonucleolytische afbraak van ontluikend DNA waarnemen, wat de verkorting van de DNA-streng is als gevolg van blootstelling aan een DNA-beschadigend agens34.

Replicatievorkbreuken veroorzaakt door fysieke obstructies (DNA-eiwitcomplexen of DNA-laesies), chemische belemmeringen of mutaties kunnen de replicatie stoppen en homologe recombinatie vereisen om het opnieuw op te starten. Dit staat bekend als verminderde vorkprogressie. Talrijke in vitro en in vivo onderzoeken hebben aangetoond dat transcriptie soms de vooruitgang van replicatievorken op deze manier kan voorkomen35.

Inwijdingen zijn replicatie-oorsprongen die initiëren en vuren tijdens de eerste of tweede puls. Oorsprongen die tijdens de eerste puls vuren en replicatievorken hebben die actief blijven, hebben een groen-rood-groen patroon (figuur 2B, lager). Oorsprongen die tijdens de tweede puls initiëren, hebben een groen-only patroon (figuur 2B, boven) en worden soms nieuw geïnitieerde oorsprongen genoemd, zodat die oorsprongen kunnen worden onderscheiden van die welke tijdens de eerste puls worden geïnitieerd. De vergelijking van de relatieve percentages van nieuw afgevuurde oorsprong tussen twee experimentele omstandigheden maakt het mogelijk om te begrijpen hoe een cel reageert op een DNA-beschadigend agens of de aan- of afwezigheid van een eiwit. Beëindigingen worden gemaakt wanneer twee replicatievorken van aangrenzende replicons samensmelten en ze een rood-groen-rood patroon hebben (figuur 2D)30.

Op basis van de hierboven beschreven feiten wordt DNA-vezelanalyse momenteel beschouwd als een voorkeursmethode om de variatie in DNA-replicatiedynamiek veroorzaakt door toxische stoffen zoals nanomaterialen te bestuderen. Onderzoekers hebben nu een goed begrip en kennis van de dynamiek van genoombrede DNA-replicatie in eukaryoten, zowel kwantitatief als kwalitatief, dankzij de ontdekking van deze technologie36. Op basis van de uitkomstvariabelen kunnen verschillende methodieken worden gehanteerd. Enkele voorbeelden van methoden om de variaties in DNA-schade veroorzaakt door externe agentia/nanodeeltjes te bestuderen, zijn weergegeven in figuur 3. Het algemene doel van de DNA-vezelanalysemethode die in deze studie wordt beschreven, is om te bepalen hoe nanodeeltjes het replicatieproces in vitro beïnvloeden en hoe ze differentieel verschillende weefsels beïnvloeden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van antilichamen en buffer

  1. Bereid de primaire antilichaamoplossing, muis anti-BrdU bij een verdunning van 1:300 in 5% BSA en rat anti-BrdU bij een verdunning van 1:500 in 5% BSA.
  2. Bereid de secundaire antilichaamoplossing, alexafluor 594 konijn anti-muis bij een verdunning van 1:300 in 5% BSA en alexafluor 488 kip anti-rat bij een verdunning van 1:500 in 5% BSA.
  3. Bereid de tertiaire antilichaamoplossing, alexafluor 594 geitenantikonijn met een verdunning van 1:1.000 in 5% BSA en alexafluor 488 geitenantikip met een verdunning van 1:1.000 in 5% BSA.
  4. Bereid 10 ml lysisbuffer in ddH 2 O met2ml 1M Tris (pH 7,4), 1 ml 0,5 M EDTA en 0,5 ml 10% SDS.

2. Voorbereiding voor de vezeltest

  1. Dag 1: Celkweek en nanomateriaalbehandeling voor de vezeltest
    1. Plaat RAW 264.5 macrofaagcellen of de cellen van belang, zodat de cellen zich op de dag van het experiment in de logfase van hun groei bevinden. Voeg voor RAW-cellen 5 x 104 cellen / put toe aan 24-putplaten voor elke aandoening. Bewaar de cellen in een incubator van 37 °C met 5% CO2 en 98% vochtigheid. Tabel 1 beschrijft de bestanddelen van de gebruikte media. Laat de cellen groeien tot 75%-80% confluency17,37.
    2. Nadat de cellen het niveau van 75% -80% confluentie hebben bereikt, verwijdert u het medium van de platen, neemt u de helft van het medium en reserveert u het voor de CldU-puls (CldU-reserve) en voegt u 5 μL IdU toe aan de andere helft bij een eindconcentratie van 50 μM. Meng en voeg het IdU-bevattende medium terug toe aan de platen. Plaats de cellen met IdU gedurende 20 minuten in de couveuse.
    3. Plaats het CldU-reservemedium op 37 °C om het voorverwarmd te houden. Voeg CldU toe aan dit medium net voor de CldU-puls.
    4. Zuig na 20 minuten het IdU-mediummengsel op en was de cellen voorzichtig met 500 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) door de plaat voorzichtig te draaien. Gooi de PBS weg.
    5. Behandel de cellen met verschillende concentraties nanodeeltjes in 500 μL van het medium en incubeer nog eens 30 minuten. Gebruik voor deze studie behandelde grafeenoxide nanodeeltjes in een concentratie van 25 μg/ml.
    6. Zuig het mengsel van het behandelingsmedium op en was de cellen voorzichtig met 500 μL PBS door de plaat voorzichtig te draaien. Gooi de PBS weg. Voeg 5 μL CldU toe (100 μM finale
    7. concentratie) naar het CldU-reservemedium en bedek de cellen met het CldU-reservemedium. Plaats cellen in de incubator voor de duur van de CldU-puls gedurende 20 minuten.
    8. Was de cellen met PBS, schraap of trypsiniseer gedurende 3-4 minuten en voeg vervolgens 5 ml medium toe aan de plaat en verzamel de cellen.
    9. Draai op 264 x g gedurende 4 min. Verwijder het medium en resuspensie van de cellen in 1 ml ijskoude PBS. Bepaal de celnummers met behulp van een trypan blue assay (hemocytometer counting) en verdun de cellen vervolgens tot ~ 200-400 cellen / μL. Houd de celsuspensie op ijs tijdens de celtelling.
      OPMERKING: Beperk indien mogelijk de tijd dat de cellen op het ijs zitten. Dit kan helpen bij het verkrijgen van een kraal van celoplossing langs de bovenkant van de dia. Als ze op ijs worden gehouden, houd ze dan minder dan 30 minuten aan.
  2. Dag 1: Bereiding van de DNA-vezels
    1. Label met een potlood de dia's (glasplaat, 75 mm x 25 mm) met de experimentele staat en datum.
    2. Neem 2 μL cellen in een pipet, houd de pipet in een hoek van ~45°, plaats de pipet ongeveer 1 cm onder het dialabel en verplaats de pipet horizontaal naar het dialabel. Terwijl de pipet over de dia beweegt, laat u een beetje van de celoplossing tegelijk los. Maak meerdere regels cellen op elke dia (kritieke stap).
      OPMERKING: Er moet een horizontale lijn van celophanging over de dia zijn. Als de celsuspensie parelt, voeg dan 5-10 μL celmedium toe aan de container met de celsuspensie, omdat dit de oplossing kan helpen zich aan de dia te hechten wanneer deze opnieuw wordt aangebracht.
    3. Laat de oplossing met de cellen verdampen totdat de oplossing er plakkerig en plakkerig uitziet. Op dit punt wordt wat vloeistof geassocieerd met de cellen, maar niet veel. Deze stap duurt 8-20 minuten en varieert afhankelijk van hoeveel vochtigheid er in de lucht is.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat alle oplossing niet is verdampt, omdat dit het erg moeilijk maakt om rechte en uitgelijnde DNA-vezels te verkrijgen, omdat de meeste, zo niet alle, DNA-vezels aan elkaar vastzitten en niet in staat zijn om te scheiden.
    4. Wanneer de oplossing plakkerig is, bedekt u de cellen met 15 μL spreidingsbuffer (lysis) per elke lijn cellen, waarbij u ervoor zorgt dat de pipetpunt de dia niet raakt. Wacht 10 min. Kantel de schuif in een hoek van 25° en plaats het label van de schuif horizontaal tegen de rand van een buizenrek (het onderste deel van het etiket moet in lijn liggen met de rand van het buizenrek).
    5. Laat de DNA-spreads minimaal 4 uur aan de lucht drogen vanaf het moment dat de laatste dia's zijn gemaakt.
      LET OP: Een periode van 4 uur tot 12 uur is goed om te drogen. Laat ze echter niet 's nachts drogen. Als het 's nachts wordt gedroogd, zal er veel ontspannen DNA zijn, maar heel weinig rechte en uitgelijnde DNA-vezels.
  3. Dag 1: Fixeren van de DNA-vezels en bevriezen
    1. Zodra de dia's zijn opgedroogd, bevestigt u de dia's met methanol: azijnzuur (3:1) door de dia's gedurende 2 minuten onder te dompelen. Voer deze stap uit onder een motorkap en laat de dia's een nacht drogen in een gebied met beperkte blootstelling aan licht, of bedek de dia's met een tent van tinfolie.
  4. Dag 2
    1. Plaats de dia's in een glazen platendrager. Plaats de dia's op −20 °C gedurende minimaal 24 uur. Deze stap verbetert de resolutie of scherpte van de afbeelding.

3. Het uitvoeren van de DNA-vezeltest

  1. Denaturatie van het DNA
    1. Bereid een bevochtigde kamer voor met behulp van kleine pipetpuntdozen met deksels. Vul de containers voor de helft met water en plaats ze gedurende ten minste 1 uur in een waterbad van 37 °C.
    2. Haal de dia's eruit vanaf −20 °C en ontdooi ze enkele seconden. Plaats de dia's voorzichtig in een Coplin-pot met gedeïoniseerd (DI) water, zodat de gecoate oppervlakken de wanden van de pot niet raken. Incubeer de glijbaan gedurende 20 s en giet vervolgens voorzichtig het water uit.
    3. Voeg 2,5 M HCL toe aan de Coplin-pot zodat deze alle dia's bedekt. Wacht 80 min. Dit is een cruciale stap in het protocol. Een verandering in de tijd kan de uitkomst van de afbeelding veranderen.
    4. Was de dia's 1x met PBS plus Tween (PBS + 0,1% Tween [eindconcentratie]) en vervolgens 2x met PBS gedurende 3 minuten elk op kamertemperatuur (RT).
  2. Immunostaining
    1. Bewaar de dia's in de bevochtigde kamer voor de volgende stappen. Blokkeer de dia's in 5% BSA in PBS gedurende 30 minuten bij RT en bedek ze met coverslips, coverslips gemaakt van een Western blot bag of transparante plastic vellen.
    2. Verwijder na het blokkeren voorzichtig de dekslip, verwijder de blokkerende oplossing en dep de dia op een papieren handdoek (tik op de dia op de handdoek) om de overtollige blokkerende oplossing te verwijderen.
    3. Voeg 100 μL van de primaire antilichaamoplossing toe over de lengte van de dia. Voeg een nieuwe plastic coverslip toe en wacht 2 uur. Zorg er bij het toevoegen van de coverslip voor dat er geen bubbels ontstaan.
    4. Klop na 2 uur de antilichaamoplossing af en spoel de dia's 2x af in een met PBS gevulde Coplin-pot bij RT. Gebruik elke keer verse PBS om de dia's te wassen.
    5. Blokkeer de dia's opnieuw door 200 μL (drie tot vier druppels) 5% BSA langs elke dia toe te voegen en voeg een plastic coverslip toe. Wacht 15 min.
    6. Verwijder de dekslip, klop de overtollige BSA op een papieren handdoek en voeg 100 μL van de secundaire antilichaamoplossing toe over de lengte van de dia. Voeg een nieuwe plastic coverslip toe en wacht 1 uur.
    7. Haal de coverslip eraf, klop de overtollige BSA op een papieren handdoek en was de dia's 2x in PBS bij RT.
    8. Blokkeer de dia's opnieuw door 200 μL (drie tot vier druppels) 5% BSA langs elke dia toe te voegen en voeg een plastic coverslip toe. Wacht 15 min.
    9. Verwijder indien nodig de coverslip, verwijder het overtollige BSA op een papieren handdoek en voeg 100 μL tertiaire antilichaamoplossing toe over de lengte van de dia. Voeg nieuwe plastic coverslips toe en wacht 30 minuten.
    10. Was de dia's met PBS 3x. Verwijder de overtollige PBS en laat ze volledig afdrogen.
    11. Eenmaal droog, voeg het montagemedium toe en plaats voorzichtig glazen afdekplaten (24 mm x 60 mm) over het montagemedium, zodat bellen worden vermeden. Label de dia's opnieuw en laat ze een nacht in het donker staan.

4. Beeldacquisitie

  1. Visualiseer de immunogekleurde DNA-vezels met behulp van een immunofluorescente microscoop uitgerust met een camera, een 60x-objectief en geschikte filtersets om alexafluor 488- en 594-kleurstoffen te detecteren.
  2. Maak afbeeldingen voor de analyse in regio's waar de vezels goed gescheiden zijn en niet verstrengeld. Het is belangrijk om afbeeldingen vast te leggen in verschillende gebieden langs de dia, omdat het maken van afbeeldingen in slechts één deel van de dia mogelijk geen representatieve gegevens oplevert over alle replicatietussenproducten die op de dia worden aangetroffen.
  3. Verkrijg indien mogelijk vezelafbeeldingen uit 20 verschillende regio's op een dia. Gebruik slechts één kanaal om de gebieden te selecteren voor het maken van afbeeldingen om vooringenomenheid te voorkomen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Na het verkrijgen van voldoende afbeeldingen (van 20-100 afbeeldingen per aandoening), moeten de replicatie-tussenproducten worden geïdentificeerd, gemeten en geteld. Of het nu gaat om het handmatig analyseren van de vezels of automatisch via een programma38, het is noodzakelijk om duidelijk te definiëren welke kenmerken een vezel moet hebben om te worden geteld of gescoord (of niet geteld of gemeten)39. Zo kunnen bijvoorbeeld de volgende vragen aan de orde komen. (1) Moet men alleen vezels meten en tellen met 100% immunofluorescentie in de hele vezel, of kunnen ze sommige regio's zonder immunofluorescentie bevatten (moeten bijvoorbeeld alle tussenproducten in figuur 4Ai, ii, iii worden geanalyseerd of slechts een subset ervan?)? Bij het analyseren van vezels met signaalverlies, wat is het maximale signaalverlies dat acceptabel is binnen een vezel, en wat is het maximale aantal continue pixels in de vezel dat kan worden verstoken van enig signaal (bijv. Zou de figuur 3Aiv worden beschouwd als een rood-groen of rood-alleen tussenproduct?)? (2) Wat moeten de minimale en maximale vezelbreedtes/-lengtes zijn? (3) Wat moet de signaal-ruisverhouding (S:N) zijn bij de beslissing of men een vezel moet meten of niet (bijv. Hoeveel vezels moeten in figuur 4B worden gekozen om te analyseren?)? (4) Hoe dicht bij de beeldrand moet een vezel zijn voordat deze niet wordt geteld of gemeten? (5) Als een fluorescerend signaal geel is, telt men dat dan als rood of groen (moet bijvoorbeeld het gele deel van het replicatietussenproduct in figuur 4C als rood of groen worden geteld?)? (6) Hoe lang moet een kleursegment zijn om als een echt signaal te worden geteld (is de replicatietussenpersoon in figuur 4D bijvoorbeeld een groen spoor, een groen-rood-groen spoor of een groen-rood spoor?)? (7) Als u een geautomatiseerd vezelanalyseprogramma gebruikt, hoe zeker is het programma dan van de meting / telling die het zojuist heeft uitgevoerd? (8) Als de vezels handmatig worden geanalyseerd, hoe consistent moet de analyse dan in de loop van de tijd en tussen individuen zijn?

Meestal zijn de parameters die worden gebruikt voor DNA-vezelanalyse de volgende:
Signaal-ruisverhouding: 3 (vezelintensiteit is drie keer groter dan de achtergrondintensiteit)
Vezeldikte: ≤8 pixels in de breedte
Minimale grootte: alleen rood of groen en 10 pixels; rood-groene tracks met elk segment ≥10 pixels; rood-groen-rood of groen-rood-groen tracks met elk segment ≥10 pixels.
Continuïteit van het fluorescerende signaal: minimaal 80% en geen gaten in het signaal groter dan 6 pixels.
Vertrouwen in beoordeling: betrouwbaarheidswaarden moeten vergelijkbaar zijn met elkaar in een afbeelding en tussen afbeeldingen.

Naast de hierboven genoemde parameters is een ander belangrijk criterium de selectie van een heldere vezel die niet overlapt met andere vezels tijdens de beeldvorming en analyse.

Figuur 5A toont representatieve beelden van controle-DNA (figuur 5Ai) en met grafeenoxide met nanodeeltjes behandeld macrofaag-DNA (figuur 5Aii,iii). De afbeelding toont een toename van de alleen-lezen sporen (beëindigingen) en een afname van nieuw gebakken oorsprong in de met grafeenoxide behandelde cellen in vergelijking met de controle (figuur 5C). Het is ook belangrijk om rekening te houden met het aantal afbeeldingen en de positie van de dia van waaruit de afbeeldingen zijn genomen. Zoals te zien is in figuur 5Aiii,C, werd een variatie in het patroon van replicatietussenproducten (een toename van nieuwe oorsprong in vergelijking met controle) waargenomen op een ander gebied van dezelfde toestand. Hoewel een paar van dergelijke observaties mogelijk geen invloed hebben op de algehele uitkomst, moet ervoor worden gezorgd dat de dia in beeld wordt gebracht door alle representatieve gebieden op te nemen. Het zou ideaal zijn om de totale oppervlakte van de dia in vijf tot zes regio's te verdelen en meerdere afbeeldingen van elke regio te maken (bijvoorbeeld 10 afbeeldingen) om sluitende vezelgegevens voor elke dia te vinden. Het is ideaal om ongeveer 500 tussenliggende producten (figuur 5B) te selecteren uit meerdere dia's / omstandigheden. Met deze variaties in replicatie kan tussentijdse kwantificering van DNA-vezelanalyse worden gebruikt om de variatie in DNA-replicatiedynamiek veroorzaakt door grafeenoxide-nanodeeltjes of de genotoxiciteit van andere nanomaterialen te onderzoeken. Daarom kan zowel een kwalitatief als kwantitatief begrip van de dynamiek van genoombrede DNA-replicatie worden verkregen door deze nieuwe methodologie in vergelijking met andere analyses die in de inleiding worden genoemd.

Figure 1
Figuur 1: DNA-vezeltest. Schematische weergave van de test met een overzicht van de belangrijkste stappen in de DNA-vezelanalyse. Schaal: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Immunostaining van de DNA-replicatietussenproducten. Schematische weergave van verschillende replicatietussenproducten geïdentificeerd door sequentiële pulslabeling met IdU (rood) en CldU (groen). Schaal: 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Blootstelling aan nanodeeltjes. Verschillende methodologieën om variaties in door nanodeeltjes geïnduceerde DNA-schade te bestuderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Te scoren kenmerken van DNA-vezels. Voorbeelden van replicatietussenproducten in een afbeelding. a) hiaten in immunofluorescentie; i) 0% immunofluorescentiesignaalverlies over het replicatietussenproduct; (ii) ~ 7% signaalverlies; iii) 50% signaalverlies; en (iv) >90% signaalverlies. (B) Een gebied met veel overlappende replicatietussenproducten (de pijl geeft het gebied aan met duidelijke vezeloverlapping). (C) Een DNA-vezel met een geel gebied. (D) Een replicatietussenproduct dat openstaat voor interpretatie (de pijl geeft de openingen in de vezel aan). Schaal: 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: DNA-vezelanalyse en -interpretatie. (A) Representatieve DNA-vezelbeelden van (i) controlemacrofaagcellen en (ii,iii) macrofaagcellen behandeld met nanodeeltjes gedurende 20 minuten bij een concentratie van 25 μg/ml. Afbeeldingen ii en iii zijn genomen uit verschillende delen van de dia. (B) Representatieve geautomatiseerde software-analyse van de controle- en nanodeeltjesbehandelde omstandigheden. Voor deze analyse gebruikten we het geautomatiseerde DNA-vezelvolg- en meetprogramma ontwikkeld door Wang et al.38. De cijfers in de figuur tonen het aantal geanalyseerde DNA-sporen. (C) Grafische weergave van de software-analyse van de controle- en nanodeeltjesbehandelingsomstandigheden. NP staat voor nanodeeltjes. Het relatieve percentage van de tussenliggende populatie (bijvoorbeeld alleen voor rood) wordt berekend op basis van de totale geanalyseerde tussenproducten. Als we np-behandelde afbeelding 1 vergelijken met afbeelding 2, zijn er grote verschillen tussen de twee afbeeldingen. Het is dus belangrijk om veel afbeeldingen op de dia te verkrijgen om te begrijpen hoe een experimentele toestand het replicatieproces beïnvloedt. Afkortingen: R = rood; G = groen. Schaal: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Mediasamenstelling
10% foetaal runderserum
1% Penicilline-Streptomycine oplossing (10000 eenheden/ml)
1% L Glutamine (200 mM)
Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high Glucose

Tabel 1: Mediasamenstelling gebruikt voor de macrofaagcelcultuur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We bespreken hier een methode om te helpen bij de analyse van de variatie in DNA-replicatiedynamiek in de aanwezigheid van nanodeeltjes via de DNA-vezeltest. Belangrijke kritische stappen in de standaardtest worden beschreven in het protocol (stap 2.2.2 en stap 3.1.3). Het wordt altijd aanbevolen om een gebied te gebruiken met beperkte blootstelling aan bovenlicht en een constante luchtstroom om door licht geïnduceerde DNA-breuken in de dia's te voorkomen en de reproduceerbaarheid te verbeteren. Zorgvuldige aandacht is vereist voor de tijdsduur voor het drogen van het cellysaat, op de dia's. Overdroging zal een negatieve invloed hebben op de vezelverspreiding. De tweede kritische stap is vezeldenaturatie met behulp van een zure oplossing. De duur van de zure wassing moet gelijk worden gehouden voor alle dia's in hetzelfde experiment. Probleemoplossing voor deze twee stappen om optimale omstandigheden te vinden (lysistijd, volume lysaat op de dia, droogtijd en zuurwastijd) wordt aanbevolen voor verschillende celtypen en laboratoriumomgevingen.

Zoals besproken in figuur 3, kan de blootstellingsduur van nanodeeltjes worden gevarieerd voor de kwantitatieve bepaling van verandering in DNA-replicatiedynamica geïnduceerd door de nanodeeltjes. Om de initiële impact van replicatiedynamiek te bepalen, zou een kortdurende blootstelling zoals 1 min, 20 min of 30 min met verschillende doseringen geschikt zijn. Het verschil in replicatiepatronen (zoals weergegeven in figuur 2) na langdurige blootstelling van de cellen aan de nanomaterialen kan worden bepaald door de patronen van IdU- en CIdU-blootstelling (elk 20 minuten) voor en na de behandeling met nanodeeltjes te vergelijken. Deze benadering kan worden gebruikt om het afslaan van de vork, het vertragen van de vork en het verschil in oorsprong te bepalen op verschillende tijdstippen van blootstelling, wat kan worden geïnterpreteerd als de effecten van acute en chronische blootstelling aan nanomaterialen39,40.

Er zijn verschillende veelbelovende technieken beschikbaar om de variatie in DNA-replicatie te detecteren, zoals DNA-kammen en de RDS-methode; in vergelijking met die methoden is de DNA-vezeltest echter handig en kosteneffectief zonder de noodzaak van dure instrumenten voor analyse41. De beperkingen van deze methode zijn de experimentele duur, de tijd die nodig is om voldoende foto's te maken voor kwantificering, evenals de software-analyse. Deze benadering zal echter zeker nanotoxicologisch onderzoek ondersteunen bij het bepalen van de genomische instabiliteit veroorzaakt door deeltjes in cellijnen, evenals in verschillende weefselmonsters en tussen verschillende soorten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Acknowledgments

De auteurs erkennen financiële steun van de Blazer-stichting, het Medical Biotechnology Program bij Biomedical Sciences, UIC Rockford en het Department of Health Science Education, UIC Rockford. De auteurs bedanken Ananya Sangineni en James Bradley voor hun bijdragen aan het project.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well plate Fisher brand FB012929
Acetic Acid  Sigma Aldrich 695092
Alexa flour 594 goat anti-rabbit  Invitrogen A11037
Alexa fluor 488 chicken anti-rat   Invitrogen A21470
Alexa fluor 488 goat anti-chicken  Invitrogen A11039
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse  Invitrogen A11062
BSA Sigma Aldrich A2153
CldU Sigma Aldrich 50-90-8
Coverslips (22 x 50 mm) Fisher brand 12-545-EP
EDTA Fisher Scientific 15575020
Frosted Microscope Slides Fisher brand 12-550-11
Hydrochloric Acid Sigma Aldrich 320331
IdU  Sigma Aldrich 54-42-2
Methanol Fisher Scientific A454-4
Mouse Anti-BrdU  BD Biosciences 347580
Phosphate Buffer Saline Gibco 10010072
Rat anti-BrdU  Abcam BU1--75(ICR1)
Raw 264.5 macrophage cells  ATCC TIB-71
SDS Sigma Aldrich L3771
Silane-Prep slides Sigma Aldrich S4651-72EA 
Superfrost gold plus slides Fischer scientific 22-035813
Tris pH 7.4 Sigma Aldrich 77861
Tween 20 Sigma Aldrich P9416

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waga, S., Stillman, B. The DNA replication fork in eukaryotic cells. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 721-751 (1998).
  2. Gambus, A. Termination of eukaryotic replication forks. DNA Replication. 1042, 163-187 (2017).
  3. Berti, M., Cortez, D., Lopes, M. The plasticity of DNA replication forks in response to clinically relevant genotoxic stress. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 633-651 (2020).
  4. Carr, A. M., Lambert, S. Replication stress-induced genome instability: The dark side of replication maintenance by homologous recombination. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4733-4744 (2013).
  5. Berti, M., Vindigni, A. Replication stress: Getting back on track. Nature Structural and Molecular Biology. 23 (2), 103-109 (2016).
  6. Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12 (1), 47-53 (2010).
  7. Khan, I., Saeed, K., Khan, I. Nanoparticles: Properties, applications and toxicities. Arabian Journal of Chemistry. 12 (7), 908-931 (2019).
  8. Ealia, S. A. M., Saravanakumar, M. P. A review on the classification, characterisation, synthesis of nanoparticles and their application. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 263 (3), 032019 (2017).
  9. Bijukumar, D. R., et al. Differential toxicity of processed and non-processed states of CoCrMo degradation products generated from a hip simulator on neural cells. Nanotoxicology. 12 (9), 941-956 (2018).
  10. Bijukumar, D., Segu, A., Chastain, P., Mathew, M. T. Implant-derived CoCrMo alloy nanoparticle disrupts DNA replication dynamics in neuronal cells. Cell Biology and Toxicology. 37 (6), 833-847 (2021).
  11. Shekhar, S., et al. Deciphering the pathways for evaluation of nanotoxicity: Stumbling block in nanotechnology. Cleaner Engineering and Technology. 5, 100311 (2021).
  12. Bhabra, G., et al. Nanoparticles can cause DNA damage across a cellular barrier. Nature Nanotechnology. 4 (12), 876-883 (2009).
  13. Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  14. Chastain, P. D., et al. DNA damage checkpoint responses in the S phase of synchronized diploid human fibroblasts. Photochemistry and Photobiology. 91 (1), 109-116 (2015).
  15. Frum, R. A., Deb, S., Deb, S. P. Use of the DNA fiber spreading technique to detect the effects of mutant p53 on DNA replication. p53 Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 147-155 (2013).
  16. Ord, M. G., Stocken, L. A. Studies in synthesis of deoxyribonucleic acid: Radiobiochemical lesion in animal cells. Nature. 182 (4652), 1787-1788 (1958).
  17. Moore, G., Sainz, J. J., Jensen, R. B. DNA fiber combing protocol using in-house reagents and coverslips to analyze replication fork dynamics in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (2), 101371 (2022).
  18. Blin, M., et al. Transcription-dependent regulation of replication dynamics modulates genome stability. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 58-66 (2019).
  19. Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. 2D gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast. DNA Electrophoresis. , Humana. New York, NY. 43-59 (2020).
  20. Painter, R. B. Radioresistant DNA synthesis: An intrinsic feature of ataxia telangiectasia. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 84 (1), 183-190 (1981).
  21. Aten, J. A., Bakker, P. J. M., Stap, J., Boschman, G. A., Veenhof, C. H. N. DNA double labelling with IdUrd and CldUrd for spatial and temporal analysis of cell proliferation and DNA replication. The Histochemical Journal. 24 (5), 251-259 (1992).
  22. Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo-and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
  23. Huberman, J. A., Riggs, A. D. Autoradiography of chromosomal DNA fibers from Chinese hamster cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 55 (3), 599-606 (1966).
  24. Ockey, C. H. Differences in replicon behavior between X-irradiation-sensitive L5178Y mouse lymphoma cells and AT fibroblasts using DNA fiber autoradiography. Radiation Research. 94 (2), 427-438 (1983).
  25. Brayner, R. The toxicological impact of nanoparticles. Nano Today. 3 (1-2), 48-55 (2008).
  26. Mendez-Bermudez, A., et al. Genome-wide control of heterochromatin replication by the telomere capping protein TRF2. Molecular Cell. 70 (3), 449-461 (2018).
  27. Vindigni, A., Lopes, M. Combining electron microscopy with single molecule DNA fiber approaches to study DNA replication dynamics. Biophysical Chemistry. 225, 3-9 (2017).
  28. Herrick, J., Bensimon, A. Single molecule analysis of DNA replication. Biochimie. 81 (8-9), 859-871 (1999).
  29. Taylor, J. H., Miner, P. Units of DNA replication in mammalian chromosomes. Cancer Research. 28 (9), 1810-1814 (1968).
  30. Nieminuszczy, J., Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. The DNA fibre technique-tracking helicases at work. Methods. 108, 92-98 (2016).
  31. Lemaçon, D., et al. MRE11 and EXO1 nucleases degrade reversed forks and elicit MUS81-dependent fork rescue in BRCA2-deficient cells. Nature Communications. 8, 860 (2017).
  32. Vindigni Lab. Replication Fork Protection. Washington University School of Medicine. , https://vindignilab.wustl.edu/research/replication-fork-protection (2020).
  33. Mimitou, E. P., Symington, L. S. DNA end resection: Many nucleases make light work. DNA Repair. 8 (9), 983-995 (2009).
  34. Schlacher, K., et al. Double-strand break repair-independent role for BRCA2 in blocking stalled replication fork degradation by MRE11. Cell. 145 (4), 529-542 (2011).
  35. Prado, F., Aguilera, A. Impairment of replication fork progression mediates RNA polII transcription-associated recombination. The EMBO Journal. 24 (6), 1267-1276 (2005).
  36. Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: Evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
  37. Halliwell, J. A., Gravells, P., Bryant, H. E. DNA fiber assay for the analysis of DNA replication progression in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 115 (2020).
  38. Wang, Y., et al. Automated DNA fiber tracking and measurement. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 1349-1352 (2011).
  39. Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
  40. Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  41. Martins, D. J., Tirman, S., Quinet, A., Menck, C. F. Detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the DNA fiber assay. Journal of Visualized Experiments. (180), e63448 (2022).

Tags

Biologie Nummer 193
Demonstratie van de DNA-vezeltest voor het onderzoeken van DNA-schade en reparatiedynamiek geïnduceerd door nanodeeltjes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patel, S., Chastain, P., Bijukumar,… More

Patel, S., Chastain, P., Bijukumar, D. Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles. J. Vis. Exp. (193), e64903, doi:10.3791/64903 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter