Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Demonstration af DNA-fiberanalysen til undersøgelse af DNA-skader og reparationsdynamik induceret af nanopartikler

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64903
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Biomedical Sciences, University of Illinois College of Medicine Rockford, 2Department of Health Sciences Education, University of Illinois College of Medicine Rockford

Summary

Metoden hjælper med analysen af variation i DNA-replikationsdynamik i nærvær af nanopartikler. Forskellige metoder kan vedtages baseret på cytotoksicitetsniveauet af materialet af interesse. Derudover gives en beskrivelse af billedanalysen for at hjælpe med DNA-fiberanalyse.

Abstract

Eksponering for nanomaterialer kan forårsage replikationsstress og genomisk ustabilitet i celler. Graden af ustabilitet afhænger af nanomaterialernes kemi, størrelse og koncentration, eksponeringstidspunktet og den eksponerede celletype. Flere etablerede metoder er blevet brugt til at belyse, hvordan endogene / eksogene stoffer påvirker global replikation. Imidlertid er analyser på replicon-niveau, såsom DNA-fiberassayet, afgørende for at forstå, hvordan disse midler påvirker replikationsinitiering, termineringer og replikationsgaffelprogression. Når man ved dette, kan man bedre forstå, hvordan nanomaterialer øger chancerne for mutationsfiksering og genomisk ustabilitet. Vi brugte RAW 264.7 makrofager som modelceller til at studere replikationsdynamikken under grafenoxid nanopartikeleksponering. Her demonstrerer vi den grundlæggende protokol for DNA-fiberassayet, som inkluderer pulsmærkning med nukleotidanaloger, cellelyse, spredning af de pulsmærkede DNA-fibre på dias, fluorescerende immunfarvning af nukleotidanalogerne i DNA-fibrene, billeddannelse af replikationsmellemprodukterne i DNA-fibrene ved hjælp af konfokalmikroskopi og replikationsmellemanalyse ved hjælp af en computerassisteret scorings- og analysesoftware (CASA).

Introduction

Under hver cellecyklus sikrer DNA-replikation nøjagtig genomduplikering1. Eukaryot kromosomal replikation afhænger i det væsentlige af tre faktorer: tidspunktet for affyring af flere replikationsoprindelser, hastigheden af gaflerne, der kommer ud af den fyrede oprindelse, og afslutningen af replikationsprocessen, når to replikationsgafler fra tilstødende oprindelse opfylder2. For high-fidelity-transmission af genetisk information til datterceller samt bevarelse af genetisk integritet er nøjagtig DNA-replikation afgørende. Midler, der udvikler sig fra regelmæssig metabolisme eller skyldes kunstige eller naturlige miljømaterialer, angriber konstant genomet. Disse endogene og eksogene midler får replikationsgafler til at bremse eller stoppe på grund af at støde på DNA-skader forårsaget af disse midler, og gaflerne, der midlertidigt bremser eller stopper som reaktion på disse vanskeligheder, kaldes replikationsstress3. Som reaktion på replikationsstress har celler udviklet flere molekylære veje, der opretholder stabiliteten af de forstyrrede replikationsgafler og giver dem mulighed for at genstarte4. Med hensyn til genetisk stabilitet, celleoverlevelse og menneskelig sygdom har disse replikationsstressresponsmekanismer vist sig at være nøglefaktorerne for at opretholde et sundt genom, sikre celleoverlevelse og mindske sandsynligheden for sygdomsdannelse5.

Et af de eksogene midler, der er i stand til at producere replikationsstress, er nanopartikler. Nanopartikler er partikler, der varierer i størrelse fra 1 nm til 100 nm6. På grund af deres høje overfladearealer, karakteristiske former og unikke kemiske egenskaber anvendes nanopartikler i forskellige medicinske, farmaceutiske, miljømæssige og industrielle applikationer 7,8. Mens nanopartikler har mange potentielle fordele, kan nogle af dem (på grund af deres arvelige natur eller levetid) blive giftige. Nanopartikler kan også dannes på grund af det naturlige slid på medicinske implantater og frigives i det periprotetiske område 9,10.

På grund af menneskers eksponering for et utal af nanopartikler, der produceres til forskellige anvendelser, er forskningen inden for nanopartikeltoksicitet steget enormt i løbet af de sidste 10 år11. Mens disse forskningsbestræbelser har afsløret oplysninger i overflod om den potentielle trussel, som nanopartikler udgør for menneskers sundhed, er viden om nanopartiklers potentiale til at forårsage genotoksicitet stadig begrænset. Hvad der hidtil er blevet opdaget er, at disse nanopartikler fysisk kan interagere med DNA'et, fremme DNA-skader og beskadige eller forstyrre de proteiner, der er ansvarlige for reparation eller replikering af DNA12. For at opdage, hvordan de forstyrrer DNA-replikation, anvendes DNA-fiberkæmning, radioresistent DNA-syntese (RDS) og DNA-fiberanalyse typisk13,14,15,16.

DNA-fiberkæmningsmetoden er fleksibel og giver information om replikationsgaffeldynamik på enkeltmolekyleniveau17. I det væsentlige trækkes en saltet dæksel forsigtigt ud af DNA-opløsningen, når DNA-enderne binder sig til den. DNA-molekylerne rettes og justeres af opløsningens menisk. Homogeniteten, afstanden og justeringen af DNA-fibrene understøtter nøjagtige og pålidelige målinger af fiberkanallængden. Ved at justere længden og rækkefølgen af behandlingerne og de lægemidler, der bruges til at forårsage stress eller skade, kan mange aspekter af gaffelfremskridt overvåges ved hjælp af denne applikation. I denne metode anvendes et dobbelt mærkningssystem, hvorigennem replikationsgaffelens hastighed og progression vurderes17,18. På den anden side udnytter 2D-gelelektroforese det faktum, at forgrenings-DNA-strukturer i agarosegelelektroforese bevæger sig langsommere end lineære DNA-molekyler med samme masse, hvilket muliggør ren adskillelse af de to i en 2D-kørsel. Faktisk undersøges denne metode til at adskille DNA-molekyler baseret på deres masse i første løb og baseret på deres form i det andet ortogonale løb. Efter genomisk DNA-fragmentering udvikler de usædvanlige replikations- og rekombinationsmellemprodukter en forgreningsform, og de kan skelnes fra de mere almindelige lineære molekyler i 2D-gel19.

RDS-metoden bruges til at bestemme, hvordan global DNA-syntese påvirkes. I denne metode bestemmes graden af hæmning af global replikation ved at sammenligne mængden af inkorporerede radioaktivt mærkede nukleotider, såsom [14C] thymidin, i ubehandlede versus behandlede celler14,20. Den procentvise forskel i radioaktiv mærkning mellem de ubehandlede og behandlede celler repræsenterer i hvilken grad det DNA-skadelige middel påvirker DNA-syntesen. I lighed med dette bruger en anden metode cellernes evne til at integrere nukleotidanaloger som BrdU (5-brom-2′-deoxyuridin) til flowcytometri til måling af de samlede hastigheder af DNA-syntese21,22. Mens disse metoder demonstrerer, hvordan DNA-skadelige stoffer påvirker global DNA-syntese, viser de ikke, hvordan individuelle replicons påvirkes. Faktisk er analyser på replicon-niveau afgørende for bedre at forstå initieringen og omfanget af genomisk ustabilitet i tilfælde af eksponering for toksiske partikler (nanomateriale). DNA-fiberautoradiografi og elektronmikroskopi er nogle metoder, der bruges til at bestemme denne23,24,25,26.

Begreberne replikationsbobler og tovejsreplikation fra ujævnt fordelte kilder blev først udviklet ved hjælp af enkeltmolekyletest som elektronmikroskopi og DNA-fiberautoradiografi27,28. Den direkte observation af forgreningsreplikationsmellemprodukter på specifikke molekyler spredt over et kulstofbelagt gitter lettes i høj grad ved elektronmikroskopi. Denne metode, som stadig er i brug i dag til at spore patologiske skift ved replikationsgafler, blev brugt til at lokalisere den første eukaryote oprindelse af DNA-replikation28. Fiber autoradiografi er centreret omkring begrebet autoradiografisk identifikation af nyligt replikerede områder og pulsmærkning af kromosomer med tritieret thymidin. Den første kvantitative evaluering af oprindelsestætheder og replikationsgaffel i metazoan genomiske sekvenser blev muliggjort af DNA-fiber autoradiografi29.

I øjeblikket har fiberfluorografimetoder taget plads til autoradiografi, hovedsageligt fordi fiberfluorografi er meget hurtigere end autoradiografi. I fiberfluorografi inkorporeres to halogenerede nukleotidderivater, såsom brom- (Br), chlor- (Cl) eller iododeoxyuridin (IdU), sekventielt i frisk replikeret DNA og identificeres derefter ved indirekte immunofluorescens ved anvendelse af antistoffer30. Mikroskopisk visning af det spirende DNA, der har inkorporeret en eller begge analoger, muliggøres ved immunfarvning af en af analogerne i en farve og den anden analog i en anden farve (f.eks. Immunfarvning spirende DNA med inkorporeret IdU-rød og inkorporeret CldU-grøn) (figur 1)21. Mange forskellige typer replikationsmellemprodukter kan identificeres ved DNA-fiberanalyse. De mest almindeligt undersøgte er individuelle forlængende gafler, initieringer og afslutninger. Individuelle forlængende gafler har et replikationsmønster af rød efterfulgt af grøn (rødgrøn; Figur 2A). 13 Længderne af disse mellemprodukter anvendes ofte til at måle gaffelhastigheden (dvs. gaffellængde/pulstid) eller den eksonukleolytiske nedbrydning af spirende DNA gennem sporforkortelse (figur 2E)30,31,32. I en undersøgelse af Mimitou et al. blev det konstateret, at ved langvarig eksponering for hydroxyurea, en replikationsgift, der forårsager dobbeltstrengsbrud i DNA'et, blev RE11 rekrutteret33. MRE11 er en eksonuklease kendt for sin 3'-5' eksonukleaseaktivitet, og den er i stand til at skære enderne af DNA til reparation. Derfor kan man, når man udsættes for toksiske stoffer, observere eksonukleolytisk nedbrydning af spirende DNA, hvilket er forkortelsen af DNA-strengen på grund af eksponering for et DNA-skadeligt middel34.

Replikationsgaffelbrud forårsaget af fysiske forhindringer (DNA-proteinkomplekser eller DNA-læsioner), kemiske hindringer eller mutationer kan stoppe replikation og nødvendiggøre homolog rekombination for at genstarte den. Dette er kendt som nedsat gaffelprogression. Talrige in vitro- og in vivo-undersøgelser har vist, at transkription lejlighedsvis kan forhindre fremskridt med replikationsgaflen på denne måde35.

Indvielser er replikationsoprindelser, der starter og affyres under den første eller anden puls. Oprindelser, der affyres under den første puls og har replikationsgafler, der fortsat er aktive, har et grøn-rød-grønt mønster (figur 2B, nederst). Oprindelser, der starter under den anden puls, har et kun grønt mønster (figur 2B, øvre) og kaldes undertiden nyligt initieret oprindelse, så disse oprindelser kan skelnes fra dem, der starter under den første puls. Sammenligningen af de relative procentdele af nyligt brændt oprindelse mellem to eksperimentelle betingelser gør det muligt at forstå, hvordan en celle reagerer på et DNA-skadeligt middel eller tilstedeværelsen eller fraværet af et protein. Afslutninger oprettes, når to replikeringsgafler fra tilstødende replicons smelter sammen, og de har et rød-grøn-rødt mønster (figur 2D)30.

Baseret på de ovenfor beskrevne fakta betragtes DNA-fiberanalyse i øjeblikket som en foretrukken metode til at studere variationen i DNA-replikationsdynamik forårsaget af giftige stoffer såsom nanomaterialer. Forskere har nu en god forståelse af og viden om dynamikken i genom-dækkende DNA-replikation i eukaryoter, både kvantitativt og kvalitativt, på grund af opdagelsen af denne teknologi36. Baseret på udfaldsvariablerne kan flere metoder anvendes. Nogle eksempler på metoder til at studere variationerne i DNA-skader induceret af eksterne stoffer/nanopartikler er vist i figur 3. Det overordnede mål med DNA-fiberanalysemetoden beskrevet i denne undersøgelse er at bestemme, hvordan nanopartikler påvirker replikationsprocessen in vitro , og hvordan de forskelligt påvirker forskellige væv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af antistoffer og buffer

  1. Forbered den primære antistofopløsning, muse-anti-BrdU ved en 1:300 fortynding i 5% BSA og rotte anti-BrdU ved en 1:500 fortynding i 5% BSA.
  2. Forbered den sekundære antistofopløsning, alexafluor 594 kanin-antimus ved en 1:300 fortynding i 5% BSA og alexafluor 488 kyllingeanti-rotte ved en 1:500 fortynding i 5% BSA.
  3. Forbered den tertiære antistofopløsning, alexafluor 594 ged antikanin ved en 1:1.000 fortynding i 5% BSA og alexafluor 488 ged anti-kylling ved en 1:1.000 fortynding i 5% BSA.
  4. Forbered 10 ml lysisbuffer i ddH 2 O med2ml 1M Tris (pH 7,4), 1 ml 0,5 M EDTA og 0,5 ml 10% SDS.

2. Forberedelse til fiberanalysen

  1. Dag 1: Cellekultur og nanomaterialebehandling til fiberanalysen
    1. Plade RAW 264.5 makrofagceller eller cellerne af interesse, så cellerne er i logfasen af deres vækst på forsøgsdagen. For RAW-celler tilsættes 5 x 104 celler/brønd til plader med 24 brønde for hver tilstand. Oprethold cellerne i en 37 °C inkubator med 5% CO2 og 98% fugtighed. Tabel 1 beskriver bestanddelene i de anvendte medier. Lad cellerne vokse til 75% -80% sammenløb17,37.
    2. Når cellerne når niveauet 75% -80% sammenløb, fjernes mediet fra pladerne, tager halvdelen af mediet og reserverer det til CldU-pulsen (CldU-reserven) og tilsæt 5 μL IdU til den anden halvdel ved en slutkoncentration på 50 μM. Bland og tilsæt det IdU-holdige medium tilbage til pladerne. Placer cellerne med IdU i inkubatoren i 20 min.
    3. CldU-reservesubstratet anbringes ved 37 °C for at holde det forvarmet. Tilføj CldU til dette medium lige før CldU-pulsen.
    4. Efter 20 minutter aspireres IdU-mediumblandingen, og cellerne vaskes forsigtigt med 500 μL fosfatbufret saltvand (PBS, pH 7,4) ved forsigtigt at dreje pladen. Kassér PBS.
    5. Behandl cellerne med forskellige koncentrationer af nanopartikler i 500 μL af mediet, og inkuber i yderligere 30 minutter. Til denne undersøgelse skal du bruge behandlede grafenoxidnanopartikler i en koncentration på 25 μg / ml.
    6. Opsug blandingen af behandlingsmediet, og vask forsigtigt cellerne med 500 μL PBS ved forsigtigt at dreje pladen. Kassér PBS. Der tilsættes 5 μL CldU (100 μM endelig
    7. koncentration) til CldU-reservemediet og dække cellerne med CldU-reservemediet. Placer celler i inkubatoren i løbet af CldU-pulsen i 20 minutter.
    8. Vask cellerne med PBS, skrab eller trypsiniser i 3-4 min, og tilsæt derefter 5 ml medium til pladen, og saml cellerne.
    9. Spin ved 264 x g i 4 min. Fjern mediet, og resuspender cellerne i 1 ml iskold PBS. Bestem cellenumrene ved hjælp af et trypanblåt assay (hæmocytometertælling), og fortynd derefter cellerne til ~ 200-400 celler / μL. Hold cellesuspensionen på is under celletællingen.
      BEMÆRK: Begræns om muligt den tid, cellerne sidder på isen. Dette kan hjælpe med at opnå en perle af celleopløsning langs toppen af diaset. Hvis de holdes på is, skal du holde dem på i mindre end 30 minutter.
  2. Dag 1: Fremstilling af DNA-fibrene
    1. Brug en blyant til at mærke diasene (glasglas, 75 mm x 25 mm) med eksperimentel tilstand og dato.
    2. Tag 2 μL celler i en pipette, hold pipetten i en ~45° vinkel, placer pipetten ca. 1 cm under diasetiketten, og flyt pipetten vandret til diasetiketten. Når pipetten bevæger sig hen over diaset, frigøres lidt af celleopløsningen ad gangen. Lav flere linjer med celler på hvert dias (kritisk trin).
      BEMÆRK: Der skal være en vandret linje med celleophæng på tværs af diaset. Hvis cellesuspensionen perler op, tilsættes 5-10 μL cellemedium til beholderen, der har cellesuspensionen, da dette kan hjælpe opløsningen med at klæbe til diaset, når den påføres igen.
    3. Lad opløsningen med cellerne fordampe, indtil opløsningen ser klæbrig og klæbrig ud. På dette tidspunkt er noget væske forbundet med cellerne, men ikke meget. Dette trin tager fra 8-20 min og varierer afhængigt af hvor meget fugtighed der er i luften.
      BEMÆRK: Sørg for, at al opløsningen ikke er fordampet, da dette gør det meget svært at opnå lige og justerede DNA-fibre, da det meste, hvis ikke alt, af DNA'et vil sidde fast sammen og ikke være i stand til at adskille.
    4. Når opløsningen er klæbrig, overlejres cellerne med 15 μL spredningsbuffer (lysis) pr. cellelinje, og pas på, at pipettespidsen ikke berører diaset. Vent i 10 min. Vip lysbilledet i en vinkel på 25°, og placer diasets etiket vandret mod kanten af en rørholder (den nederste del af etiketten skal flugte med kanten af rørstativet).
    5. Lad DNA-spredningerne lufttørre i mindst 4 timer fra det tidspunkt, hvor de sidste dias blev lavet.
      BEMÆRK: En periode på 4 timer til 12 timer er god til tørring. Lad dem dog ikke tørre natten over. Hvis det får lov til at tørre natten over, vil der være meget afslappet DNA, men meget få lige og justerede DNA-fibre.
  3. Dag 1: Fastgørelse af DNA-fibrene og frysning
    1. Når lysbillederne er tørret, fastgøres diasene med methanol:eddikesyre (3:1) ved at nedsænke diasene i 2 min. Udfør dette trin under en hætte, og lad rutsjebanerne tørre natten over i et område med begrænset lyseksponering, eller dæk diasene med et sølvpapirtelt.
  4. Dag 2
    1. Placer lysbillederne i en glasglideholder. Objektglassene anbringes ved -20 °C i mindst 24 timer. Dette trin forbedrer billedets opløsning eller skarphed.

3. Udførelse af DNA-fiberanalysen

  1. Denaturering af DNA'et
    1. Forbered et befugtet kammer ved hjælp af små pipettespidsbokse med låg. Beholderne fyldes halvt med vand, og de anbringes i et 37 °C vandbad i mindst 1 time.
    2. Tag diasene ud fra -20 °C, og optø dem i et par sekunder. Placer gliderne forsigtigt i en Coplin-krukke, der indeholder deioniseret (DI) vand, så de belagte overflader ikke rører krukkens vægge. Inkuber diaset i 20 s, og hæld derefter forsigtigt vandet ud.
    3. Tilsæt 2,5 M HCL til Coplin-krukken, så den dækker alle diasene. Vent i 80 min. Dette er et kritisk skridt i protokollen. En ændring i tiden kan ændre resultatet af billedet.
    4. Vask diasene 1x med PBS plus Tween (PBS + 0,1% Tween [endelig koncentration]) og derefter 2x med PBS i 3 minutter hver ved stuetemperatur (RT).
  2. Immunfarvning
    1. Opbevar lysbillederne i det befugtede kammer i følgende trin. Bloker diasene i 5% BSA i PBS i 30 minutter ved RT, og dæk dem med coverslips, coverslips lavet af en Western blot-pose eller gennemsigtige plastplader.
    2. Efter blokering skal du forsigtigt fjerne dæksedlen, fjerne blokeringsopløsningen og tørre diaset på et køkkenrulle (bank på diaset på håndklædet) for at fjerne den overskydende blokeringsopløsning.
    3. Der tilsættes 100 μL af den primære antistofopløsning langs diaslængden. Tilføj et nyt plastikdæksel, og vent i 2 timer. Når du tilføjer dæksedlen, skal du sikre dig, at der ikke dannes bobler.
    4. Efter 2 timer bankes antistofopløsningen af, og objektglassene skylles i en PBS-fyldt Coplin-krukke 2x ved RT. Brug frisk PBS hver gang til at vaske diasene.
    5. Bloker diasene igen ved at tilføje 200 μL (tre til fire dråber) 5% BSA langs hvert dias, og tilføj en plastikdæksel. Vent i 15 min.
    6. Tag dækslet af, bank det overskydende BSA af på et køkkenrulle, og tilsæt 100 μL af den sekundære antistofopløsning langs diasens længde. Tilføj et nyt plastikdæksel, og vent i 1 time.
    7. Tag dækslet af, bank den overskydende BSA af på et køkkenrulle, og vask diasene 2x i PBS på RT.
    8. Bloker diasene igen ved at tilføje 200 μL (tre til fire dråber) 5% BSA langs hvert dias, og tilføj en plastikdæksel. Vent i 15 min.
    9. Fjern om nødvendigt dæksedlen, fjern overskydende BSA på et køkkenrulle, og tilsæt 100 μL tertiær antistofopløsning langs diasens længde. Tilføj nye plastikdæksedler, og vent i 30 minutter.
    10. Vask diasene med PBS 3x. Fjern overskydende PBS, og lad dem tørre helt af.
    11. Når det er tørt, tilsættes monteringsmediet, og glasdækslerne (24 mm x 60 mm) placeres forsigtigt over monteringsmediet, så bobler undgås. Mærk diasene igen, og lad dem stå i mørke natten over.

4. Optagelse af billeder

  1. Visualiser de immunfarvede DNA-fibre ved hjælp af et immunofluorescerende mikroskop udstyret med et kamera, et 60x mål og passende filtersæt til påvisning af alexafluor 488 og 594 farvestoffer.
  2. Tag billeder til analysen i områder, hvor fibrene er godt adskilt og ikke sammenfiltret. Det er vigtigt at tage billeder i forskellige områder langs diaset, da det at tage billeder i kun en del af diaset muligvis ikke giver repræsentative data vedrørende alle replikeringsmellemprodukter, der findes på diaset.
  3. Hvis det er muligt, skal du hente fiberbilleder fra 20 forskellige regioner på et dias. Brug kun én kanal til at vælge de områder, hvor der skal tages billeder, for at undgå bias.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter at have opnået nok billeder (fra 20-100 billeder pr. Tilstand), skal replikationsmellemprodukterne identificeres, måles og tælles. Uanset om man analyserer fibrene manuelt eller automatisk via et program38, er det nødvendigt klart at definere, hvilke egenskaber en fiber skal have, for at den kan tælles eller scores (eller ikke tælles eller måles)39. For eksempel kan følgende spørgsmål overvejes. (1) Skal man kun måle og tælle fibre med 100% immunfluorescens i hele fiberen, eller kan de indeholde nogle regioner uden immunofluorescens (f.eks. Skal alle mellemprodukterne i figur 4Ai, ii, iii analyseres eller bare en delmængde af dem?)? Hvis man analyserer fibre med signaltab, hvad er det maksimale signaltab, der er acceptabelt inden for en fiber, og hvad er det maksimale antal kontinuerlige pixels i fiberen, der kan være blottet for noget signal (f.eks. Vil figur 3Aiv betragtes som et rødgrønt eller kun rødt mellemprodukt?)? (2) Hvad skal minimum og maksimum fiberbredder/længder være? (3) Hvad skal signal-støj-forholdet (S: N) være, når man beslutter, om man skal måle en fiber eller ej (f.eks. Hvor mange fibre skal vælges i figur 4B til analyse?)? (4) Hvor tæt på billedkanten skal en fiber være, før den ikke tælles eller måles? (5) Hvis et fluorescerende signal er gult, tæller man det så som rødt eller grønt (skal den gule del af replikationsmellemproduktet i figur 4C tælles som rødt eller grønt?)? (6) Hvor lang tid skal et farvesegment være for at blive talt som et sandt signal (f.eks. Er replikeringsmellemproduktet i figur 4D kun et grønt spor, et grøn-rød-grønt spor eller et grøn-rødt spor?)? (7) Hvis du bruger et automatiseret fiberanalyseprogram, hvor sikkert er programmet i den måling / tælling, som det lige har udført? (8) Hvis fibrene analyseres manuelt, hvor konsistent skal analysen være over tid og mellem individer?

Typisk er de parametre, der anvendes til DNA-fiberanalyse, følgende:
Signal-støj-forhold: 3 (fiberintensitet er tre gange større end baggrundsintensiteten)
Fibertykkelse: ≤8 pixels i bredden
Minimal størrelse: kun rød eller grøn og 10 pixels; rødgrønne spor med hvert segment ≥10 pixels; rød-grøn-rød eller grøn-rød-grøn spor med hvert segment ≥10 pixels.
Kontinuitet i det fluorescerende signal: mindst 80% og ingen huller i signalet større end 6 pixels.
Tillid til vurdering: Konfidensværdier skal ligne hinanden i et billede og mellem billeder.

Ud over de ovennævnte parametre er et andet vigtigt kriterium udvælgelsen af en klar fiber, der ikke overlapper andre fibre under billeddannelse og analyse.

Figur 5A viser repræsentative billeder af kontrol- (figur 5Ai) og grafenoxidnanopartikelbehandlet makrofag-DNA (figur 5Aii,iii). Billedet viser en stigning i skrivebeskyttede spor (afslutninger) og et fald i nyligt brændt oprindelse i grafenoxidbehandlede celler sammenlignet med kontrollen (figur 5C). Det er også vigtigt at overveje antallet af billeder og placeringen af diaset, hvorfra billederne tages. Som vist i figur 5Aiii,C blev der observeret en variation i mønsteret af replikationsmellemprodukter (en stigning i ny oprindelse sammenlignet med kontrol) i et andet område af samme tilstand. Selv om nogle få af disse observationer måske ikke påvirker det samlede resultat, skal man være omhyggelig med at afbilde diaset ved at inkludere alle de repræsentative områder. Det ville være ideelt at opdele det samlede areal af diaset i fem til seks regioner og tage flere billeder fra hver region (eksempel: 10 billeder) for at finde afgørende fiberdata for hvert dias. Det er ideelt at vælge omkring 500 mellemprodukter (figur 5B) fra flere dias / betingelser. Med disse variationer i replikation kan mellemliggende kvantificering fra DNA-fiberanalyse bruges til at undersøge variationen i DNA-replikationsdynamik forårsaget af grafenoxidnanopartikler eller genotoksiciteten af andre nanomaterialer. Derfor kan der opnås både en kvalitativ og kvantitativ forståelse af dynamikken i genom-dækkende DNA-replikation gennem denne nye metode sammenlignet med andre analyser, der er nævnt i indledningen.

Figure 1
Figur 1: DNA-fiberanalyse. Skematisk gengivelse af analysen med en oversigt over de vigtigste trin i DNA-fiberanalysen. Skala: 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Immunfarvning af DNA-replikationsmellemprodukterne. Skematisk repræsentation af forskellige replikationsmellemprodukter identificeret ved sekventiel pulsmærkning med IdU (rød) og CldU (grøn). Skala: 5 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Eksponering for nanopartikler. Forskellige metoder til at studere variationer i nanopartikelinduceret DNA-skade. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Karakteristik af DNA-fibre, der skal scores. Eksempler på replikeringsmellemprodukter i et billede. a) huller i immunfluorescensen i) 0 % immunfluorescenssignaltab over replikationsmellemproduktet (ii) ~ 7% signaltab; iii) 50 % signaltab og (iv) >90% signaltab. (B) Et område med mange overlappende replikationsmellemprodukter (pilen angiver regionen med klar fiberoverlapning). (C) En DNA-fiber med en gul region. (D) Et replikationsmellemprodukt, der er åbent for fortolkning (pilen angiver hullerne i fiberen). Skala: 5 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: DNA-fiberanalyse og fortolkning. (A) Repræsentative DNA-fiberbilleder fra (i) kontrolmakrofagceller og (ii,iii) makrofagceller behandlet med nanopartikler i 20 minutter ved en koncentration på 25 μg/ml. Billeder ii og iii blev taget fra forskellige områder af diaset. B) Repræsentativ automatiseret softwareanalyse af kontrol- og nanopartikelbehandlede tilstande. Til denne analyse brugte vi det automatiserede DNA-fibersporings- og måleprogram udviklet af Wang et al.38. Tallene i figuren viser antallet af analyserede DNA-spor. (C) Grafisk gengivelse af softwareanalysen af kontrol- og nanopartikelbehandlede tilstande. NP repræsenterer nanopartikler. Den relative procentdel af mellempopulationen (f.eks. kun for rødt) beregnes ud fra de samlede analyserede mellemprodukter. Sammenligner man NP-behandlet billede 1 med billede 2, er der store forskelle mellem de to billeder. Det er derfor vigtigt at få mange billeder i hele diaset for at forstå, hvordan en eksperimentel tilstand påvirker replikationsprocessen. Forkortelser: R = rød; G = grøn. Skala: 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Mediekomposition
10% føtalt bovin serum
1% Penicillin-Streptomycin opløsning (10000 enheder/ml)
1% L glutamin (200 mM)
Dulbeccos modificerede ørns mellemhøje glukose

Tabel 1: Mediesammensætning anvendt til makrofagcellekulturen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi diskuterer her en metode til at hjælpe med analysen af variationen i DNA-replikationsdynamik i nærvær af nanopartikler gennem DNA-fiberassayet. De vigtigste kritiske trin, der er involveret i standardanalysen, er beskrevet i protokollen (trin 2.2.2 og trin 3.1.3). Det anbefales altid at bruge et område med begrænset eksponering for ovenlys og konstant luftstrøm for at forhindre lysinducerede DNA-brud i diasene samt for at forbedre reproducerbarheden. Der kræves omhyggelig opmærksomhed på varigheden af tørring af cellelysatet på diasene. Overdrypning vil påvirke fiberspredningen negativt. Det andet kritiske trin er fiberdenaturering ved hjælp af en syreopløsning. Varigheden af syrevasken skal holdes ens for alle dias i samme eksperiment. Fejlfinding for disse to trin for at finde optimale forhold (lysetid, volumen lysat på diaset, tørretid og syrevasketid) anbefales til forskellige celletyper og laboratoriemiljøer.

Som diskuteret i figur 3 kan eksponeringsvarigheden af nanopartikler varieres til kvantitativ bestemmelse af ændring i DNA-replikationsdynamik induceret af nanopartiklerne. For at bestemme den indledende virkning af replikationsdynamik ville en kortvarig eksponering såsom 1 min, 20 min eller 30 min med forskellige doser være passende. Forskellen i replikationsmønstre (som vist i figur 2) efter cellernes langvarige eksponering for nanomaterialerne kan bestemmes ved at sammenligne mønstrene for IdU- og CIdU-eksponering (20 minutter hver) før og efter nanopartikelbehandlingen. Denne fremgangsmåde kan anvendes til at bestemme gaffelstandsning, gaffelsænkning og forskel i oprindelsesaffyring på forskellige eksponeringstidspunkter, hvilket kan fortolkes som virkningerne af akut og kronisk eksponering for nanomaterialer39,40.

Der er flere lovende teknikker til rådighed til at detektere variationen i DNA-replikation, såsom DNA-kæmning og RDS-metoden; I sammenligning med disse metoder er DNA-fiberanalysen imidlertid praktisk og omkostningseffektiv uden behov for dyre instrumenter til analyse41. Begrænsningerne ved denne metode er den eksperimentelle varighed, den tid, der kræves for at tage nok billeder til kvantificering, samt softwareanalysen. Denne tilgang vil dog bestemt støtte nanotoksikologisk forskning i bestemmelsen af genomisk ustabilitet forårsaget af partikler i cellelinjer såvel som i forskellige vævsprøver og mellem forskellige arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender økonomisk støtte fra Blazer Foundation, Medical Biotechnology Program ved Biomedical Sciences, UIC Rockford, og Department of Health Science Education, UIC Rockford. Forfatterne takker Ananya Sangineni og James Bradley for deres bidrag til projektet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well plate Fisher brand FB012929
Acetic Acid  Sigma Aldrich 695092
Alexa flour 594 goat anti-rabbit  Invitrogen A11037
Alexa fluor 488 chicken anti-rat   Invitrogen A21470
Alexa fluor 488 goat anti-chicken  Invitrogen A11039
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse  Invitrogen A11062
BSA Sigma Aldrich A2153
CldU Sigma Aldrich 50-90-8
Coverslips (22 x 50 mm) Fisher brand 12-545-EP
EDTA Fisher Scientific 15575020
Frosted Microscope Slides Fisher brand 12-550-11
Hydrochloric Acid Sigma Aldrich 320331
IdU  Sigma Aldrich 54-42-2
Methanol Fisher Scientific A454-4
Mouse Anti-BrdU  BD Biosciences 347580
Phosphate Buffer Saline Gibco 10010072
Rat anti-BrdU  Abcam BU1--75(ICR1)
Raw 264.5 macrophage cells  ATCC TIB-71
SDS Sigma Aldrich L3771
Silane-Prep slides Sigma Aldrich S4651-72EA 
Superfrost gold plus slides Fischer scientific 22-035813
Tris pH 7.4 Sigma Aldrich 77861
Tween 20 Sigma Aldrich P9416

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waga, S., Stillman, B. The DNA replication fork in eukaryotic cells. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 721-751 (1998).
  2. Gambus, A. Termination of eukaryotic replication forks. DNA Replication. 1042, 163-187 (2017).
  3. Berti, M., Cortez, D., Lopes, M. The plasticity of DNA replication forks in response to clinically relevant genotoxic stress. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 633-651 (2020).
  4. Carr, A. M., Lambert, S. Replication stress-induced genome instability: The dark side of replication maintenance by homologous recombination. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4733-4744 (2013).
  5. Berti, M., Vindigni, A. Replication stress: Getting back on track. Nature Structural and Molecular Biology. 23 (2), 103-109 (2016).
  6. Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12 (1), 47-53 (2010).
  7. Khan, I., Saeed, K., Khan, I. Nanoparticles: Properties, applications and toxicities. Arabian Journal of Chemistry. 12 (7), 908-931 (2019).
  8. Ealia, S. A. M., Saravanakumar, M. P. A review on the classification, characterisation, synthesis of nanoparticles and their application. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 263 (3), 032019 (2017).
  9. Bijukumar, D. R., et al. Differential toxicity of processed and non-processed states of CoCrMo degradation products generated from a hip simulator on neural cells. Nanotoxicology. 12 (9), 941-956 (2018).
  10. Bijukumar, D., Segu, A., Chastain, P., Mathew, M. T. Implant-derived CoCrMo alloy nanoparticle disrupts DNA replication dynamics in neuronal cells. Cell Biology and Toxicology. 37 (6), 833-847 (2021).
  11. Shekhar, S., et al. Deciphering the pathways for evaluation of nanotoxicity: Stumbling block in nanotechnology. Cleaner Engineering and Technology. 5, 100311 (2021).
  12. Bhabra, G., et al. Nanoparticles can cause DNA damage across a cellular barrier. Nature Nanotechnology. 4 (12), 876-883 (2009).
  13. Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  14. Chastain, P. D., et al. DNA damage checkpoint responses in the S phase of synchronized diploid human fibroblasts. Photochemistry and Photobiology. 91 (1), 109-116 (2015).
  15. Frum, R. A., Deb, S., Deb, S. P. Use of the DNA fiber spreading technique to detect the effects of mutant p53 on DNA replication. p53 Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 147-155 (2013).
  16. Ord, M. G., Stocken, L. A. Studies in synthesis of deoxyribonucleic acid: Radiobiochemical lesion in animal cells. Nature. 182 (4652), 1787-1788 (1958).
  17. Moore, G., Sainz, J. J., Jensen, R. B. DNA fiber combing protocol using in-house reagents and coverslips to analyze replication fork dynamics in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (2), 101371 (2022).
  18. Blin, M., et al. Transcription-dependent regulation of replication dynamics modulates genome stability. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 58-66 (2019).
  19. Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. 2D gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast. DNA Electrophoresis. , Humana. New York, NY. 43-59 (2020).
  20. Painter, R. B. Radioresistant DNA synthesis: An intrinsic feature of ataxia telangiectasia. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 84 (1), 183-190 (1981).
  21. Aten, J. A., Bakker, P. J. M., Stap, J., Boschman, G. A., Veenhof, C. H. N. DNA double labelling with IdUrd and CldUrd for spatial and temporal analysis of cell proliferation and DNA replication. The Histochemical Journal. 24 (5), 251-259 (1992).
  22. Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo-and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
  23. Huberman, J. A., Riggs, A. D. Autoradiography of chromosomal DNA fibers from Chinese hamster cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 55 (3), 599-606 (1966).
  24. Ockey, C. H. Differences in replicon behavior between X-irradiation-sensitive L5178Y mouse lymphoma cells and AT fibroblasts using DNA fiber autoradiography. Radiation Research. 94 (2), 427-438 (1983).
  25. Brayner, R. The toxicological impact of nanoparticles. Nano Today. 3 (1-2), 48-55 (2008).
  26. Mendez-Bermudez, A., et al. Genome-wide control of heterochromatin replication by the telomere capping protein TRF2. Molecular Cell. 70 (3), 449-461 (2018).
  27. Vindigni, A., Lopes, M. Combining electron microscopy with single molecule DNA fiber approaches to study DNA replication dynamics. Biophysical Chemistry. 225, 3-9 (2017).
  28. Herrick, J., Bensimon, A. Single molecule analysis of DNA replication. Biochimie. 81 (8-9), 859-871 (1999).
  29. Taylor, J. H., Miner, P. Units of DNA replication in mammalian chromosomes. Cancer Research. 28 (9), 1810-1814 (1968).
  30. Nieminuszczy, J., Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. The DNA fibre technique-tracking helicases at work. Methods. 108, 92-98 (2016).
  31. Lemaçon, D., et al. MRE11 and EXO1 nucleases degrade reversed forks and elicit MUS81-dependent fork rescue in BRCA2-deficient cells. Nature Communications. 8, 860 (2017).
  32. Vindigni Lab. Replication Fork Protection. Washington University School of Medicine. , https://vindignilab.wustl.edu/research/replication-fork-protection (2020).
  33. Mimitou, E. P., Symington, L. S. DNA end resection: Many nucleases make light work. DNA Repair. 8 (9), 983-995 (2009).
  34. Schlacher, K., et al. Double-strand break repair-independent role for BRCA2 in blocking stalled replication fork degradation by MRE11. Cell. 145 (4), 529-542 (2011).
  35. Prado, F., Aguilera, A. Impairment of replication fork progression mediates RNA polII transcription-associated recombination. The EMBO Journal. 24 (6), 1267-1276 (2005).
  36. Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: Evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
  37. Halliwell, J. A., Gravells, P., Bryant, H. E. DNA fiber assay for the analysis of DNA replication progression in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 115 (2020).
  38. Wang, Y., et al. Automated DNA fiber tracking and measurement. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 1349-1352 (2011).
  39. Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
  40. Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  41. Martins, D. J., Tirman, S., Quinet, A., Menck, C. F. Detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the DNA fiber assay. Journal of Visualized Experiments. (180), e63448 (2022).

Tags

Biologi nr. 193
Demonstration af DNA-fiberanalysen til undersøgelse af DNA-skader og reparationsdynamik induceret af nanopartikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patel, S., Chastain, P., Bijukumar,… More

Patel, S., Chastain, P., Bijukumar, D. Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles. J. Vis. Exp. (193), e64903, doi:10.3791/64903 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter