Summary
この方法論は、ナノ粒子の存在下でのDNA複製ダイナミクスの変動の分析に役立ちます。目的の材料の細胞毒性レベルに基づいて、さまざまな方法論を採用できます。さらに、DNAファイバー解析に役立つように画像解析の説明が提供される。
Abstract
ナノ材料への曝露は、細胞内の複製ストレスとゲノム不安定性を引き起こす可能性があります。不安定性の程度は、ナノ材料の化学的性質、サイズ、濃度、曝露時間、および曝露された細胞の種類によって異なります。内因性/外因性のエージェントがグローバル複製にどのように影響するかを解明するために、いくつかの確立された方法が使用されてきました。ただし、DNAファイバーアッセイなどのレプリコンレベルのアッセイは、これらの薬剤が複製の開始、終了、および複製フォークの進行にどのように影響するかを理解するために不可欠です。これを知ることで、ナノ材料が突然変異の固定とゲノム不安定性の可能性をどのように高めるかをよりよく理解することができます。RAW 264.7マクロファージをモデル細胞として使用し、酸化グラフェンナノ粒子曝露下での複製ダイナミクスを研究しました。ここでは、ヌクレオチド類似体によるパルス標識、細胞溶解、パルス標識DNAファイバーのスライドへの拡散、DNAファイバー内のヌクレオチドアナログの蛍光免疫染色、共焦点顕微鏡を使用したDNAファイバー内の複製中間体のイメージング、およびコンピューター支援スコアリングおよび分析(CASA)ソフトウェアを使用した複製中間体分析を含む、DNAファイバーアッセイの基本プロトコルを示します。
Introduction
各細胞周期において、DNA複製により正確なゲノム複製が保証されます1。真核生物の染色体複製は、基本的に、複数の複製起点の発火のタイミング、発火した起点から出てくるフォークの速度、および隣接する起点からの2つの複製分岐が2を満たしたときの複製プロセスの終了の3つの要因に依存します。娘細胞への遺伝情報の忠実度の高い伝達と遺伝的完全性の維持には、正確なDNA複製が不可欠です。定期的な代謝から発生する、または人工または天然の環境材料に起因する薬剤は、絶えずゲノムを攻撃しています。これらの内因性および外因性の薬剤は、これらの薬剤によって引き起こされるDNA損傷に遭遇するために複製フォークを減速または停止させ、これらの困難に応じてフォークが一時的に減速または停止することは複製ストレスと呼ばれます3。複製ストレスに応答して、細胞は、乱された複製フォークの安定性を維持し、それらが再開することを可能にするいくつかの分子経路を発達させた4。遺伝的安定性、細胞生存、およびヒト疾患の観点から、これらの複製ストレス応答メカニズムは、健康なゲノムを維持し、細胞の生存を確保し、疾患形成の可能性を減らすための重要な要因として浮上しています5。
複製ストレスを生じさせることができる外因性薬剤の1つはナノ粒子である。ナノ粒子は、サイズが1nmから100nmの範囲の粒子である6。ナノ粒子は、その高い表面積、独特の形状、および独自の化学的特性により、さまざまな医療、製薬、環境、および産業用途で利用されています7,8。ナノ粒子には多くの潜在的な利点がありますが、それらのいくつかは(それらの遺伝性または寿命のために)有毒になる可能性があります。ナノ粒子はまた、医療用インプラントの自然な摩耗および裂け目のために形成され、人工関節周囲領域に放出され得る9、10。
さまざまな用途のために製造された無数のナノ粒子に人間がさらされているため、ナノ粒子毒性の分野の研究は過去10年間で大幅に増加しています11。これらの研究努力により、ナノ粒子が人間の健康にもたらす潜在的な脅威に関する情報が豊富に明らかになりましたが、ナノ粒子が遺伝毒性を引き起こす可能性についての知識はまだ限られています。これまでに発見されたことは、これらのナノ粒子がDNAと物理的に相互作用し、DNA損傷を促進し、DNAの修復または複製に関与するタンパク質を損傷または妨害する可能性があることです12。それらがDNA複製をどのように妨害するかを検出するために、DNAファイバーコーミング、耐放射線性DNA合成(RDS)、およびDNAファイバー分析が通常使用されます13、14、15、16。
DNAファイバーコーミング法は柔軟性があり、単一分子レベルでの複製フォークダイナミクスに関する情報を提供します17。本質的に、塩水化されたカバーガラスは、DNA末端がそれに結合すると、DNA溶液から穏やかに引き出されます。DNA分子は、溶液のメニスカスによってまっすぐに整列されます。DNAファイバーの均質性、間隔、およびアライメントは、正確で信頼性の高いファイバートラクト長の測定をサポートします。治療の長さと順序、およびストレスや損傷を引き起こすために使用される薬物を調整することにより、このアプリケーションを使用してフォークの進歩の多くの側面を監視できます。この方法では、複製フォークの速度と進行が評価される二重ラベリングシステムが使用されます17,18。一方、2Dゲル電気泳動では、アガロースゲル電気泳動では、分岐したDNA構造が同じ質量の線状DNA分子よりもゆっくりと移動するため、2Dランで2つを明確に分離できるという事実を利用しています。実際、この方法は、最初の実行では質量に基づいてDNA分子を分離し、2番目の直交実行では形状に基づいてDNA分子を分離するために調査されています。ゲノムDNA断片化後、珍しい複製および組換え中間体は分岐形態を発達させ、それらは2Dゲル19におけるより一般的な線状分子と区別され得る。
RDS法は、グローバルなDNA合成がどのように影響を受けるかを決定するために使用されます。この方法では、全体的な複製の阻害の程度は、未処理細胞と処理細胞に取り込まれた放射性標識ヌクレオチド、例えば[14C]チミジンの量を比較することによって決定される14,20。未処理細胞と処理細胞の間の放射性標識のパーセンテージ差は、DNA損傷剤がDNA合成に影響を与える程度を表します。これと同様に、別の方法では、フローサイトメトリー用のBrdU(5-ブロモ-2′-デオキシウリジン)などのヌクレオチド類似体を組み込む細胞の能力を使用して、DNA合成の全体的な速度を測定します21,22。これらの方法は、DNA損傷剤がグローバルなDNA合成にどのように影響するかを示していますが、個々のレプリコンがどのように影響を受けるかは示していません。実際、レプリコンレベルのアッセイは、有毒粒子(ナノ材料)曝露の場合のゲノム不安定性の開始と程度をよりよく理解するために不可欠です。DNAファイバーオートラジオグラフィーおよび電子顕微鏡法は、これを決定するために使用されるいくつかの方法である23、24、25、26。
不均等な間隔のソースからの複製気泡と双方向複製の概念は、電子顕微鏡やDNAファイバーオートラジオグラフィーなどの単一分子テストを使用して最初に開発されました27,28。炭素被覆グリッド上に分散した特定の分子上の分岐複製中間体の直接観察は、電子顕微鏡法によって非常に容易になります。この方法は、複製フォークでの病理学的変化を追跡するために今日でも使用されており、DNA複製の最初の真核生物起源を特定するために利用されました28。ファイバーオートラジオグラフィーは、新たに複製された領域のオートラジオグラフィー識別と、トリチウム化チミジンによる染色体のパルスタグ付けの概念を中心としています。後生動物のゲノム配列における起源密度と複製フォーク率の最初の定量的評価は、DNAファイバーオートラジオグラフィーによって可能になりました29。
現在、主にファイバー蛍光透視法がオートラジオグラフィーよりもはるかに高速であるため、ファイバー蛍光透視法がオートラジオグラフィーに取って代わりました。ファイバー蛍光透視法では、ブロモ-(Br)、クロロ-(Cl)、ヨードデオキシウリジン(IdU)などの2つのハロゲン化ヌクレオチド誘導体を新たに複製されたDNAに順次組み込んでから、抗体30を用いた間接免疫蛍光法によって同定します。一方または両方の類似体を組み込んだ新生DNAの顕微鏡観察は、一方のアナログを一方の色で、もう一方のアナログを異なる色で免疫染色することによって可能になります(たとえば、IdU赤と組み込まれたCldU緑で新生DNAを免疫染色します)(図1)21。多くの異なるタイプの複製中間体をDNAファイバー分析によって同定することができる。最も一般的に研究されているのは、個々の伸長フォーク、開始、および終了です。個々の伸長フォークには、赤とそれに続く緑(赤-緑;図2A)。13これらの中間体の長さは、フォーク速度(すなわち、フォークの長さ/パルス時間)またはトラック短縮による新生DNAの外核分解を測定するために頻繁に使用されます(図2E)30、31、32。Mimitouらの研究では、DNAの二本鎖切断を引き起こす複製毒であるヒドロキシ尿素に長期間さらされると、RE11が採用されたことがわかりました33。MRE11は、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性で知られるエキソヌクレアーゼであり、修復のためにDNAの末端を切断することができます。したがって、毒性物質に曝露されると、DNA損傷剤への曝露によるDNA鎖の短縮である新生DNAの外核分解が観察される可能性があります34。
物理的な障害(DNA-タンパク質複合体またはDNA病変)、化学的障害、または突然変異によって引き起こされる複製フォークの破損は、複製を停止し、それを再開するために相同組換えを必要とする可能性があります。これは、フォークの進行障害として知られています。多数の インビトロ および インビボ の調査により、転写が複製フォークの進行をこのように妨げる可能性があることが示されています35。
開始は、1 番目または 2 番目のパルス中に開始および起動するレプリケーションの起点です。最初のパルス中に起動し、レプリケーションフォークがアクティブであり続けるオリジンには、緑-赤-緑のパターンがあります(図2B、下)。2番目のパルス中に開始する起点は緑色のみのパターンを持ち(図2B、上)、新しく開始された起点と呼ばれることもあるため、これらの起点は最初のパルス中に開始する起点と区別できます。2つの実験条件間で新たに発火した起源の相対的な割合を比較することで、細胞がDNA損傷剤にどのように反応するか、またはタンパク質の有無を理解することができます。終了は、隣接するレプリコンからの2つのレプリケーションフォークがマージされ、赤-緑-赤のパターンを持つときに作成されます(図2D)30。
上記の事実に基づいて、DNAファイバー分析は現在、ナノ材料などの毒性物質によって引き起こされるDNA複製動態の変動を研究するための好ましい方法と考えられています。研究者は現在、この技術の発見により、真核生物におけるゲノムワイドDNA複製のダイナミクスについて、定量的および定性的の両方で十分な理解と知識を持っています36。結果変数に基づいて、いくつかの方法論を採用できます。外部薬剤/ナノ粒子によって誘発されるDNA損傷の変動を研究する方法のいくつかの例を 図3に示します。この研究で説明されているDNAファイバー分析法の全体的な目標は、ナノ粒子が in vitroでの 複製プロセスにどのように影響するか、およびナノ粒子がさまざまな組織にどのように影響するかを決定することです。
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Protocol
1. 抗体とバッファーの調製
- 一次抗体溶液、5%BSAで1:300希釈でマウス抗BrdU、および5%BSAで1:500希釈でラット抗BrdUを調製します。
- 二次抗体溶液、アレキサフル594ウサギ抗マウスを5%BSAで1:300希釈で、アレキサフルオロ488ニワトリ抗ラットを5%BSAで1:500希釈で調製します。
- 三次抗体溶液、アレキサフル594ヤギ抗ウサギを5%BSAで1:1,000希釈で、アレキサフルオロ488ヤギ抗ニワトリを5%BSAで1:1,000希釈で調製します。
- 2 mLの1M Tris(pH 7.4)、1 mLの0.5 M EDTA、および0.5 mLの10% SDSを含むddH2O中の10 mLの溶解バッファーを調製します。
2. ファイバーアッセイの準備
- 1日目:ファイバーアッセイのための細胞培養とナノ材料処理
- RAW 264.5マクロファージ細胞または目的の細胞をプレートし、細胞が実験当日に増殖の対数期にあるようにします。RAW細胞の場合は、各条件について5 x 104細胞/ウェルを24ウェルプレートに追加します。細胞を5%CO2および98%湿度の37°Cインキュベーター内で維持します。表1は、使用される媒体の成分を説明する。細胞を75%〜80%のコンフルエント17,37まで成長させます。
- 細胞が75%〜80%コンフルエントのレベルに達したら、プレートから培地を取り出し、培地の半分を取り、CldUパルス(CldUリザーブ)用にリザーブし、残りの半分に50μLのIdUを最終濃度50μMで加えます。 IdU含有培地を混合し、プレートに戻します。IdUを含む細胞をインキュベーターに20分間入れます。
- CldUリザーブ培地を37°Cに置き、予熱した状態に保ちます。CldUパルスの直前にこの培地にCldUを追加します。
- 20分後、IdU培地混合物を吸引し、プレートを穏やかに回転させて500 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)で細胞を穏やかに洗浄します。PBS を破棄します。
- 500 μLの培地中のさまざまな濃度のナノ粒子で細胞を処理し、さらに30分間インキュベートします。この研究では、25 μg/mL濃度で処理された酸化グラフェンナノ粒子を使用します。
- 処理培地混合物を吸引し、プレートを穏やかに回転させて細胞を500 μLのPBSで穏やかに洗浄します。PBS を破棄します。5 μL の CldU (100 μM ファイナル
- )をCldU予備培地に、細胞をCldU予備培地で覆う。CldUパルスの持続時間に20分間細胞をインキュベーターに入れます。
- 細胞をPBSで洗浄し、3〜4分間こすり落とすかトリプシン化してから、5 mLの培地をプレートに加え、細胞を回収します。
- 264 x g で4分間回転させます。培地を取り出し、細胞を氷冷PBS1 mLに再懸濁します。トリパンブルーアッセイ(血球計算盤計数)を使用して細胞数を決定し、細胞を~200-400細胞/μLに希釈します。 細胞カウント中は、細胞懸濁液を氷上に保ちます。
注意: 可能であれば、細胞が氷の上に座っている時間を制限してください。これは、スライドの上部に沿って細胞溶液のビーズを得るのに役立つ場合があります。氷上に保管する場合は、30分未満着用してください。
- 1日目:DNAファイバーの準備
- 鉛筆を使用して、スライド(スライドガラス、75 mm x 25 mm)に実験条件と日付のラベルを付けます。
- ピペットで2 μLの細胞を採取し、ピペットを~45°の角度で保持し、ピペットをスライドラベルの約1 cm下に置き、ピペットをスライドラベルまで水平に移動します。ピペットがスライドを横切って移動したら、一度に少量の細胞溶液を放出します。各スライドに複数行のセルを作成します(重要なステップ)。
注:スライドを横切る細胞懸濁液の水平線があるはずです。細胞懸濁液がビーズ状になった場合は、細胞懸濁液を入れた容器に5〜10 μLの細胞培地を加えます。 - 溶液が粘着性で粘着性があるように見えるまで、細胞を含む溶液を蒸発させます。この時点で、いくらかの液体が細胞に関連していますが、それほど多くはありません。このステップには8〜20分かかり、空気中の湿度によって異なります。
注:すべてではないにしてもほとんどのDNAがくっついて分離できないため、まっすぐで整列したDNA繊維を取得するのが非常に困難になるため、すべての溶液が蒸発していないことを確認してください。 - 溶液が粘着性がある場合は、ピペットチップがスライドに触れないように注意しながら、細胞の各ラインごとに15 μLの拡散(溶解)バッファーで細胞を重ねます。10分待ちます。スライドを25°の角度で傾け、スライドのラベルをチューブラックの端に対して水平に置きます(ラベルの下部がチューブラックの端と一直線に並ぶ必要があります)。
- 最後のスライドが作成されてから最低4時間、DNAスプレッドを風乾させます。
注意: 乾燥には4時間から12時間かかります。ただし、一晩乾燥させないでください。一晩乾燥させると、リラックスしたDNAがたくさんありますが、まっすぐで整列したDNA繊維はほとんどありません。
- 1日目:DNAファイバーを固定して凍結する
- スライドが乾いたら、スライドをメタノール:酢酸(3:1)で2分間浸して固定します。フードの下でこの手順を実行し、光への露出が制限された場所でスライドを一晩乾かすか、スライドをブリキ箔テントで覆います。
- 2日目
- スライドガラスキャリアにスライドを置きます。スライドを-20°Cで最低24時間置きます。この手順により、画像の解像度または鮮明さが向上します。
3. DNAファイバーアッセイの実施
- DNAの変性
- 蓋付きの小さなピペットチップボックスを使用して加湿チャンバーを準備します。容器に水を半分満たし、37°Cの水浴に少なくとも1時間入れます。
- スライドを-20°Cから取り出し、数秒間解凍します。スライドを脱イオン(DI)水を含むコプリンジャーに注意深く置き、コーティングされた表面がジャーの壁に触れないようにします。スライドを20秒間インキュベートしてから、慎重に水を注ぎます。
- 2.5 M HCLをコプリンジャーに追加して、すべてのスライドを覆うようにします。80分待ちます。これはプロトコルの重要なステップです。時間を変更すると、画像の結果が変わる可能性があります。
- スライドをPBSとトゥイーン(PBS + 0.1%トゥイーン[最終濃度])で1回洗浄し、次にPBSで2回室温(RT)でそれぞれ3分間洗浄します。
- 免疫染色
- 次の手順のため、スライドを加湿チャンバーに保管してください。スライドをPBS中の5%BSAでRTで30分間ブロックし、カバーガラス、ウエスタンブロットバッグから作られたカバースリップ、または透明なプラスチックシートで覆います。
- ブロッキング後、カバーガラスを慎重に取り外し、ブロッキング溶液を取り除き、ペーパータオルでスライドを拭き取り(タオルのスライドを軽くたたく)、余分なブロッキング溶液を取り除きます。
- スライドの長さに沿って100 μLの一次抗体溶液を追加します。新しいプラスチック製のカバーガラスを追加し、2時間待ちます。カバーガラスを追加するときは、気泡が発生しないようにしてください。
- 2時間後、抗体溶液をノックオフし、RTで2倍のPBS充填コプリンジャーでスライドをすすぎます。 毎回新しいPBSを使用してスライドを洗浄します。
- 各スライドに沿って200 μL(3〜4滴)の5%BSAを加えてスライドを再度ブロックし、プラスチック製のカバーガラスを追加します。15分待ちます。
- カバーガラスを外し、ペーパータオルで余分なBSAをノックオフし、スライドの長さに沿って100 μLの二次抗体溶液を追加します。新しいプラスチック製のカバーガラスを追加し、1時間待ちます。
- カバーガラスを外し、ペーパータオルで余分なBSAをノックオフし、RTでPBSでスライドを2回洗います。
- 各スライドに沿って200 μL(3〜4滴)の5%BSAを加えてスライドを再度ブロックし、プラスチック製のカバーガラスを追加します。15分待ちます。
- 必要に応じて、カバーガラスを取り外し、ペーパータオルで余分なBSAを取り除き、スライドの長さに沿って100 μLの三次抗体溶液を追加します。新しいプラスチック製のカバーガラスを追加し、30分待ちます。
- スライドをPBS 3xで洗浄します。余分なPBSを取り除き、完全に乾かします。
- 乾いたら、封入剤を追加し、気泡が入らないようにガラスカバースリップ(24 mm x 60 mm)を封入媒体の上に慎重に置きます。スライドにラベルを付け直し、一晩暗闇に置いておきます。
4. 画像取得
- カメラ、60倍対物レンズ、およびalexafluor 488および594色素を検出するための適切なフィルターセットを備えた免疫蛍光顕微鏡を使用して、免疫染色されたDNAファイバーを視覚化します。
- 繊維がよく分離され、絡み合っていない領域で分析用の画像を撮影します。スライドの1つの部分だけで画像を撮影すると、スライド上にあるすべての複製中間体に関する代表的なデータが得られない場合があるため、スライドに沿ってさまざまな領域で画像をキャプチャすることが重要です。
- 可能であれば、スライド上の20の異なる領域からファイバー画像を取得します。偏りを避けるために、画像を撮影する領域を選択するには、1つのチャネルのみを使用します。
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Representative Results
十分な画像(条件ごとに20〜100枚の画像)を取得した後、複製中間体を識別、測定、およびカウントする必要があります。プログラム38を介して繊維を手動または自動で分析するかどうかにかかわらず、繊維がカウントまたはスコアリングされる(またはカウントまたは測定されない)ために繊維が持つ必要がある特性を明確に定義する必要があります39。たとえば、次の質問が考えられます。(1)繊維全体で100%の免疫蛍光を有する繊維のみを測定してカウントする必要がありますか、それとも免疫蛍光のない領域を含むことができますか(たとえば、図4Ai、ii、iiiのすべての中間体を分析する必要がありますか、それともそれらのサブセットのみを分析する必要がありますか?信号損失のあるファイバを分析する場合、ファイバ内で許容できる最大信号損失はいくつですか、および信号が欠落する可能性のあるファイバ内の連続ピクセルの最大数はいくつですか(たとえば、図3Aivは赤緑または赤のみの中間と見なされますか?(2)最小および最大の繊維幅/長さはどれくらいにする必要がありますか?(3)ファイバーを測定する必要があるかどうかを判断する際の信号対雑音比(S:N)はどうあるべきですか(たとえば、図4Bで分析するためにいくつのファイバーを選択する必要がありますか?(4)ファイバーがカウントまたは測定されない前に、ファイバーが画像エッジにどれだけ近づく必要がありますか?(5)蛍光シグナルが黄色の場合、それを赤または緑としてカウントしますか(たとえば、図4Cの複製中間体の黄色の部分は赤または緑としてカウントする必要がありますか?(6)カラーセグメントが真の信号としてカウントされるには、どのくらいの長さが必要ですか(たとえば、図4Dの複製中間体は緑のみのトラック、緑-赤-緑のトラック、または緑-赤のトラックですか?(7)自動繊維解析プログラムを使用している場合、プログラムは実行したばかりの測定/カウントにどの程度自信がありますか?(8)繊維を手動で分析する場合、分析は経時的に、個人間でどの程度一貫している必要がありますか?
通常、DNAファイバー分析に使用されるパラメーターは次のとおりです。
信号対雑音比:3(ファイバー強度はバックグラウンド強度の3倍)
ファイバの太さ:幅≤8ピクセル
最小サイズ:赤または緑のみ、10ピクセル。各セグメント≥10ピクセル)の赤緑トラック。赤 - 緑 - 赤または緑 - 赤 - 緑のトラックで、各セグメント ≥10 ピクセル。
蛍光シグナルの連続性:少なくとも80%で、6ピクセルを超えるシグナルにギャップがない。
評価の信頼性: 信頼度の値は、画像内および画像間で互いに類似している必要があります。
上記のパラメータに加えて、別の重要な基準は、イメージングおよび分析中に他の繊維と重複しない透明な繊維の選択である。
図5Aは、コントロール(図5Ai)および酸化グラフェンナノ粒子処理マクロファージDNA(図5Aii、iii)の代表的な画像を示す。この画像は、コントロールと比較して、読み取り専用トラック(終端)の増加と、酸化グラフェン処理セルの新たに発火した起源の減少を示しています(図5C)。また、画像の数と、画像が撮影されたスライドの位置を考慮することも重要です。図5Aiii,Cに示すように、複製中間体のパターンの変動(対照と比較して新しい起源の増加)は、同じ条件の異なる領域で観察されました。このような観察結果のいくつかは全体的な結果に影響しないかもしれませんが、すべての代表的な領域を含めてスライドを画像化するように注意する必要があります。スライドの総領域を5〜6つの領域に分割し、各領域から複数の画像(例:10枚の画像)を取得して、各スライドの決定的なファイバーデータを見つけるのが理想的です。複数のスライド/条件から約500の中間体(図5B)を選択することが理想的です。これらの複製の変動により、DNAファイバー分析からの中間定量を使用して、酸化グラフェンナノ粒子によって引き起こされるDNA複製ダイナミクスの変動または他のナノ材料の遺伝毒性を調べることができます。したがって、ゲノムワイドなDNA複製のダイナミクスの定性的および定量的理解は、冒頭で述べた他の分析と比較して、この新しい方法論によって得ることができます。
図1:DNAファイバーアッセイ。 DNAファイバー解析の主要なステップの概要を含むアッセイの概略図。スケール:10μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:DNA複製中間体の免疫染色。 IdU(赤)およびCldU(緑)によるシーケンシャルパルスラベリングによって識別される異なる複製中間体の概略図。スケール:5μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ナノ粒子の曝露。 ナノ粒子誘発DNA損傷の変動を研究するためのさまざまな方法論。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:スコアリングされるDNAファイバーの特性。 イメージ内のレプリケーション中間体の例。(A)免疫蛍光のギャップ;(i)複製中間体にわたる0%の免疫蛍光シグナル損失;(ii) ~7% の信号損失。(iii)50%の信号損失。(iv)>90%の信号損失。(B)複製中間体が重複する領域が多い領域(矢印は透明な繊維が重なっている領域を示す)。(C)黄色の領域を有するDNA繊維。(D)解釈可能な複製中間体(矢印はファイバのギャップを示す)。スケール:5μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:DNAファイバーの分析と解釈 。 (A)(i)コントロールマクロファージ細胞および(ii、iii)ナノ粒子で25 μg/mL濃度で20分間処理したマクロファージ細胞の代表的なDNAファイバー画像。画像iiとiiiは、スライドの異なる領域から撮影されました。(B)対照およびナノ粒子処理条件の代表的な自動ソフトウェア分析。この解析には、Wangらが開発した自動DNAファイバー追跡および測定プログラムを使用しました38。図中の数字は、解析したDNAトラックの数を示す。(C)コントロールおよびナノ粒子処理条件のソフトウェア分析のグラフ表示。NPはナノ粒子を表す。中間母集団の相対的な割合(たとえば、赤のみ)は、分析された中間母集団の合計から計算されます。NP処理画像1と画像2を比較すると、2つの画像には大きな違いがあります。したがって、実験条件が複製プロセスにどのように影響するかを理解するには、スライド全体で多くの画像を取得することが重要です。略語:R =赤。G =緑。スケール:10μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| メディア構成 |
| 10%ウシ胎児血清 |
| 1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(10000単位/ ml) |
| 1% L グルタミン (200 mM) |
| ダルベッコの改変イーグルの中高グルコース |
表1:マクロファージ細胞培養に用いた培地組成物。
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Discussion
ここでは、DNAファイバーアッセイを通じてナノ粒子の存在下でのDNA複製ダイナミクスの変動の分析を支援する方法について説明します。標準アッセイに関与する主要な重要なステップは、プロトコルに記載されています(ステップ2.2.2およびステップ3.1.3)。スライド内の光誘発DNA切断を防ぎ、再現性を高めるために、頭上の光への露出が制限され、一定の気流のある領域を使用することを常にお勧めします。スライド上の細胞ライセートの乾燥時間には細心の注意を払う必要があります。過度に乾燥すると、繊維の広がりに悪影響を及ぼします。2番目の重要なステップは、酸性溶液を使用した繊維変性です。酸洗浄の持続時間は、同じ実験のすべてのスライドで等しく保たれるべきです。最適な条件(溶解時間、スライド上のライセートの量、乾燥時間、酸洗浄時間)を見つけるためのこれら2つのステップのトラブルシューティングは、さまざまな細胞タイプとラボ環境に推奨されます。
図3で論じたように、ナノ粒子の曝露時間は、ナノ粒子によって誘発されるDNA複製動態の変化の定量的決定のために変えることができる。レプリケーション・ダイナミクスの初期の影響を判断するには、異なる用量で1分、20分、30分などの短期間の曝露が適切です。細胞をナノ材料に長期間曝露した後の複製パターンの違い(図2に示すように)は、ナノ粒子処理の前後のIdUおよびCIdU曝露(それぞれ20分)のパターンを比較することによって決定できます。このアプローチは、異なる曝露時間におけるフォークの失速、フォークの減速、および起源発火の違いを決定するために使用することができ、これは、ナノ材料への急性および慢性曝露の影響として解釈することができる39、40。
DNA複製の変動を検出するために利用できるいくつかの有望な技術があります, DNAコーミングやRDS法など;しかしながら、それらの方法と比較して、DNAファイバーアッセイは、分析のための高価な機器を必要とせずに便利で費用効果が高い41。この方法の限界は、実験時間、定量化に十分な画像を撮影するのに必要な時間、およびソフトウェア解析です。しかし、確かに、このアプローチは、細胞株、異なる組織サンプル、および異なる種間の粒子によって引き起こされるゲノム不安定性を決定する際のナノ毒性学研究をサポートします。
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Disclosures
著者は、開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
著者らは、ブレイザー財団、UICロックフォードの生物医科学の医療バイオテクノロジープログラム、およびUICロックフォードの健康科学教育部門からの財政的支援を認めています。著者らは、プロジェクトへの貢献について、アナンヤ・サンギネニとジェームズ・ブラッドリーに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well plate | Fisher brand | FB012929 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Alexa flour 594 goat anti-rabbit | Invitrogen | A11037 | |
| Alexa fluor 488 chicken anti-rat | Invitrogen | A21470 | |
| Alexa fluor 488 goat anti-chicken | Invitrogen | A11039 | |
| Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse | Invitrogen | A11062 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2153 | |
| CldU | Sigma Aldrich | 50-90-8 | |
| Coverslips (22 x 50 mm) | Fisher brand | 12-545-EP | |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Frosted Microscope Slides | Fisher brand | 12-550-11 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 320331 | |
| IdU | Sigma Aldrich | 54-42-2 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
| Mouse Anti-BrdU | BD Biosciences | 347580 | |
| Phosphate Buffer Saline | Gibco | 10010072 | |
| Rat anti-BrdU | Abcam | BU1--75(ICR1) | |
| Raw 264.5 macrophage cells | ATCC | TIB-71 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Silane-Prep slides | Sigma Aldrich | S4651-72EA | |
| Superfrost gold plus slides | Fischer scientific | 22-035813 | |
| Tris pH 7.4 | Sigma Aldrich | 77861 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
References
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