Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Demonstrasjon av DNA-fiberanalysen for å undersøke DNA-skade og reparasjonsdynamikk indusert av nanopartikler

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64903
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Biomedical Sciences, University of Illinois College of Medicine Rockford, 2Department of Health Sciences Education, University of Illinois College of Medicine Rockford

Summary

Metodikken bistår i analysen av variasjon i DNA-replikasjonsdynamikk i nærvær av nanopartikler. Ulike metoder kan vedtas basert på cytotoksisitetsnivået til materialet av interesse. I tillegg er det gitt en beskrivelse av bildeanalysen for å hjelpe til med DNA-fiberanalyse.

Abstract

Eksponering for nanomaterialer kan forårsake replikasjonsstress og genomisk ustabilitet i celler. Graden av ustabilitet avhenger av kjemi, størrelse og konsentrasjon av nanomaterialene, eksponeringstidspunktet og den eksponerte celletypen. Flere etablerte metoder har blitt brukt for å belyse hvordan endogene/eksogene agens påvirker global replikasjon. Imidlertid er analyser på svarnivå, for eksempel DNA-fiberanalysen, avgjørende for å forstå hvordan disse midlene påvirker replikasjonsinitiering, avslutninger og replikasjonsgaffelprogresjon. Å vite dette gjør at man kan forstå bedre hvordan nanomaterialer øker sjansene for mutasjonsfiksering og genomisk ustabilitet. Vi brukte RAW 264.7 makrofager som modellceller for å studere replikasjonsdynamikken under eksponering av grafenoksid nanopartikler. Her demonstrerer vi den grunnleggende protokollen for DNA-fiberanalysen, som inkluderer pulsmerking med nukleotidanaloger, cellelyse, spredning av pulsmerkede DNA-fibre på lysbilder, fluorescerende immunfarging av nukleotidanalogene i DNA-fibrene, avbildning av replikasjonsmellomproduktene i DNA-fibrene ved bruk av konfokalmikroskopi og replikasjonsmellomanalyse ved bruk av en dataassistert scoring og analyse (CASA) programvare.

Introduction

Under hver cellesyklus sikrer DNA-replikasjon nøyaktig genomduplisering1. Eukaryot kromosomal replikasjon avhenger i hovedsak av tre faktorer: tidspunktet for avfyring av flere replikasjonsopprinnelser, hastigheten på gaflene som kommer fra den avfyrte opprinnelsen, og avslutningen av replikasjonsprosessen når to replikasjonsgafler fra tilstøtende opprinnelse møtes2. For high-fidelity overføring av genetisk informasjon til datterceller, samt bevaring av genetisk integritet, er nøyaktig DNA-replikasjon avgjørende. Midler som utvikler seg fra vanlig metabolisme eller skyldes kunstige eller naturlige miljømaterialer, angriper stadig genomet. Disse endogene og eksogene midlene får replikasjonsgaflene til å bremse eller stoppe på grunn av DNA-skade forårsaket av disse midlene, og gaflene som midlertidig bremser eller stopper som svar på disse vanskelighetene, kalles replikasjonsstress3. Som svar på replikasjonsstress har celler utviklet flere molekylære veier som opprettholder stabiliteten til de forstyrrede replikasjonsgaflene og lar dem starte på nytt4. Når det gjelder genetisk stabilitet, celleoverlevelse og menneskelig sykdom, har disse replikasjonsstressresponsmekanismene dukket opp som nøkkelfaktorene for å opprettholde et sunt genom, sikre celleoverlevelse og redusere sannsynligheten for sykdomsdannelse5.

Et av de eksogene midlene som er i stand til å produsere replikasjonsstress er nanopartikler. Nanopartikler er partikler som varierer i størrelse fra 1 nm til 100 nm6. På grunn av deres høye overflatearealer, særegne former og unike kjemiske egenskaper, brukes nanopartikler i ulike medisinske, farmasøytiske, miljømessige og industrielle applikasjoner 7,8. Mens nanopartikler har mange potensielle fordeler, kan noen av dem (på grunn av deres arvelige natur eller lang levetid) bli giftige. Nanopartikler kan også dannes på grunn av naturlig slitasje på medisinske implantater og slippes ut i det periprotetiske området 9,10.

På grunn av eksponering av mennesker til et mylder av nanopartikler produsert for ulike applikasjoner, har forskning innen nanopartikkeltoksisitet økt enormt de siste 10 årene11. Selv om disse forskningsinnsatsene har avslørt informasjon i overflod om den potensielle trusselen som nanopartikler utgjør for menneskers helse, er kunnskapen om potensialet for nanopartikler å forårsake gentoksisitet fortsatt begrenset. Det som har blitt oppdaget så langt er at disse nanopartiklene fysisk kan samhandle med DNA, fremme DNA-skade og skade eller forstyrre proteinene som er ansvarlige for å reparere eller replikere DNA12. For å oppdage hvordan de forstyrrer DNA-replikasjon, brukes vanligvis DNA-fiberkaming, radioresistent DNA-syntese (RDS) og DNA-fiberanalyse13,14,15,16.

DNA-fiberkammetoden er fleksibel og gir informasjon om replikasjonsgaffeldynamikk på enkeltmolekylnivå17. I hovedsak trekkes en salinisert coverslip forsiktig ut av DNA-løsningen når DNA-endene binder seg til den. DNA-molekylene rettes ut og justeres av løsningens menisk. Homogeniteten, avstanden og justeringen av DNA-fibrene støtter nøyaktige og pålitelige målinger av fiberkanallengder. Ved å justere lengden og sekvensen av behandlingene og stoffene som brukes til å forårsake stress eller skade, kan mange aspekter av gaffelutvikling overvåkes ved hjelp av dette programmet. I denne metoden brukes et dobbelt merkingssystem, hvorved hastigheten og progresjonen til replikasjonsgaffelen vurderes17,18. På den annen side utnytter 2D-gelelektroforese det faktum at forgrenings-DNA-strukturer i agarosegelelektroforese beveger seg langsommere enn lineære DNA-molekyler med samme masse, noe som muliggjør ren separasjon av de to i et 2D-løp. Faktisk undersøkes denne metoden for å skille DNA-molekyler basert på deres masse i første kjøring og basert på deres form i den andre ortogonale kjøringen. Etter genomisk DNA-fragmentering utvikler de uvanlige replikasjons- og rekombinasjonsmellomproduktene en forgreningsform, og de kan skilles fra de mer vanlige lineære molekylene i 2D-gelen19.

RDS-metoden brukes til å bestemme hvordan global DNA-syntese påvirkes. I denne metoden bestemmes graden av inhibering av global replikasjon ved å sammenligne mengden inkorporerte radioaktivt merkede nukleotider, slik som [14C] tymidin, i ubehandlede versus behandlede celler14,20. Den prosentvise forskjellen i radiomerking mellom de ubehandlede og behandlede cellene representerer i hvilken grad det DNA-skadelige middelet påvirker DNA-syntesen. I likhet med dette bruker en annen metode cellens evne til å integrere nukleotidanaloger som BrdU (5-brom-2'-deoksyuridin) for flowcytometri for å måle de totale hastighetene av DNA-syntese21,22. Selv om disse metodene demonstrerer hvordan DNA-skadelige stoffer påvirker global DNA-syntese, viser de ikke hvordan individuelle svar påvirkes. Faktisk er analyser på replicon-nivå avgjørende for å bedre forstå initiering og omfang av genomisk ustabilitet i tilfelle eksponering for giftige partikler (nanomateriale). DNA-fiberautoradiografi og elektronmikroskopi er noen metoder som brukes til å bestemme denne23,24,25,26.

Konseptene replikasjonsbobler og toveis replikasjon fra ujevnt fordelte kilder ble først utviklet ved hjelp av enkeltmolekylære tester som elektronmikroskopi og DNA-fiberautoradiografi27,28. Den direkte observasjonen av forgreningsreplikasjonsmellomprodukter på spesifikke molekyler spredt over et karbonbelagt rutenett blir i stor grad tilrettelagt ved elektronmikroskopi. Denne metoden, som fortsatt er i bruk i dag for å spore patologiske skift ved replikasjonsgafler, ble brukt til å lokalisere den første eukaryote opprinnelsen til DNA-replikasjon28. Fiberautoradiografi er sentrert rundt begrepet autoradiografisk identifikasjon av nylig replikerte områder og pulsmerking av kromosomer med tritiert tymidin. Den første kvantitative evalueringen av opprinnelsestettheter og replikasjonsgaffelhastigheter i metazoan genomiske sekvenser ble muliggjort av DNA-fiberautoradiografi29.

For tiden har fiberfluorografimetoder tatt plass til autoradiografi, hovedsakelig fordi fiberfluorografi er mye raskere enn autoradiografi. I fiberfluorografi blir to halogenerte nukleotidderivater, slik som brom- (Br), klor- (Cl) eller jododeoksyuridin (IdU), sekvensielt inkorporert i ferskt replikert DNA og deretter identifisert ved indirekte immunfluorescens ved bruk av antistoffer30. Mikroskopisk visning av det gryende DNA som har innlemmet en eller begge analogene, er mulig ved å immunfarge en av analogene i en farge og den andre analogen i en annen farge (f.eks. immunostaining nascerende DNA med innlemmet IdU rød og innlemmet CldU grønn) (figur 1) 21. Mange forskjellige typer replikasjonsmellomprodukter kan identifiseres ved DNA-fiberanalyse. De mest studerte er individuelle forlengelsesgafler, innvielser og avslutninger. Individuelle forlengelsesgafler har et replikasjonsmønster av rødt etterfulgt av grønt (rødgrønt; Figur 2A). 13 Lengdene på disse mellomproduktene brukes ofte til å måle gaffelhastigheten (dvs. gaffellengde/pulstid) eller den eksonukleolytiske nedbrytningen av begynnende DNA gjennom sporforkortelse (figur 2E) 30,31,32. I en studie av Mimitou et al. ble det funnet at ved langvarig eksponering for hydroksyurea, en replikasjonsgift som forårsaker dobbeltstrengbrudd i DNA, ble RE11 rekruttert33. MRE11 er en eksonuklease kjent for sin 3'-5' eksonukleaseaktivitet, og den er i stand til å kutte endene av DNA for reparasjon. Derfor, når man blir utsatt for giftige stoffer, kan man observere eksonukleolytisk nedbrytning av begynnende DNA, som er forkortelsen av DNA-strengen på grunn av eksponering for et DNA-skadelig middel34.

Replikasjonsgaffelbrudd forårsaket av fysiske hindringer (DNA-proteinkomplekser eller DNA-lesjoner), kjemiske hindringer eller mutasjoner kan stoppe replikasjonen og nødvendiggjøre homolog rekombinasjon for å starte den på nytt. Dette er kjent som nedsatt gaffelprogresjon. Tallrike in vitro - og in vivo-undersøkelser har indikert at transkripsjon noen ganger kan forhindre replikasjonsgaffelutvikling på denne måten35.

Initieringer er replikasjonsopprinnelser som starter og skyter under første eller andre puls. Opprinnelser som brenner under første puls og har replikasjonsgafler som fortsetter å være aktive, har et grønn-rød-grønt mønster (figur 2B, nedre). Opprinnelser som starter under den andre pulsen, har et grønt mønster (figur 2B, øvre) og kalles noen ganger nylig initiert opprinnelse, slik at disse opprinnelsene kan differensieres fra de som starter under den første pulsen. Sammenligningen av de relative prosentandelene av nylig avfyrt opprinnelse mellom to eksperimentelle forhold gjør det mulig å forstå hvordan en celle reagerer på et DNA-skadelig middel eller tilstedeværelsen eller fraværet av et protein. Avslutninger opprettes når to replikasjonsgafler fra tilstøtende replikconer slås sammen, og de har et rød-grønn-rødt mønster (figur 2D)30.

Basert på fakta beskrevet ovenfor, er DNA-fiberanalyse for tiden ansett som en foretrukket metode for å studere variasjonen i DNA-replikasjonsdynamikk forårsaket av giftige stoffer som nanomaterialer. Forskere har nå en god forståelse og kunnskap om dynamikken i genom-bred DNA-replikasjon i eukaryoter, både kvantitativt og kvalitativt, på grunn av oppdagelsen av denne teknologien36. Basert på utfallsvariablene kan flere metoder tas i bruk. Noen eksempler på metoder for å studere variasjoner i DNA-skade indusert av eksterne agens/nanopartikler er vist i figur 3. Det overordnede målet med DNA-fiberanalysemetoden beskrevet i denne studien er å bestemme hvordan nanopartikler påvirker replikasjonsprosessen in vitro og hvordan de differensielt påvirker forskjellige vev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling av antistoffer og buffer

  1. Forbered den primære antistoffoppløsningen, mus anti-BrdU ved en 1:300 fortynning i 5% BSA og rotte anti-BrdU ved en 1:500 fortynning i 5% BSA.
  2. Klargjør den sekundære antistoffløsningen, alexafluor 594 kaninantimus ved en 1:300 fortynning i 5% BSA og alexafluor 488 kylling anti-rotte ved en 1:500 fortynning i 5% BSA.
  3. Forbered den tertiære antistoffløsningen, alexafluor 594 geiteantikanin ved en 1:1,000 fortynning i 5% BSA og alexafluor 488 geitekylling ved en 1:1,000 fortynning i 5% BSA.
  4. Forbered 10 ml lysisbuffer i ddH 2 O med2ml 1M Tris (pH 7,4), 1 ml 0,5 M EDTA og 0,5 ml 10% SDS.

2. Forberedelse for fiberanalysen

  1. Dag 1: Cellekultur og nanomaterialbehandling for fiberanalysen
    1. Plate RAW 264.5 makrofagceller eller cellene av interesse, slik at cellene er i loggfasen av veksten på forsøksdagen. For RAW-celler, legg til 5 x 104 celler / brønn til 24-brønnplater for hver tilstand. Vedlikehold cellene i en 37 °C inkubator med 5% CO2 og 98% fuktighet. Tabell 1 beskriver bestanddelene i mediene som brukes. La cellene vokse til 75%-80% sammenløp17,37.
    2. Etter at cellene når nivået 75% -80% konfluens, fjern mediet fra platene, ta halvparten av mediet og reserver det for CldU-pulsen (CldU-reserven), og tilsett 5 μL IdU til den andre halvdelen ved en endelig konsentrasjon på 50 μM. Bland og tilsett det IdU-holdige mediet tilbake til platene. Plasser cellene med IdU i inkubatoren i 20 minutter.
    3. Plasser CldU-reservemediet ved 37 °C for å holde det forvarmet. Legg CldU til dette mediet like før CldU-pulsen.
    4. Etter 20 minutter, aspirer IdU-mediumblandingen, og vask forsiktig cellene med 500 μL fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7,4) ved å rotere platen forsiktig. Kast PBS.
    5. Behandle cellene med forskjellige konsentrasjoner av nanopartikler i 500 μL av mediet, og inkuber i ytterligere 30 minutter. For denne studien, bruk behandlet grafenoksid nanopartikler ved en 25 μg / ml konsentrasjon.
    6. Aspirer behandlingsmediumblandingen, og vask forsiktig cellene med 500 μL PBS ved å rotere platen forsiktig. Kast PBS. Legg til 5 μL CldU (100 μM endelig
    7. konsentrasjon) til CldU-reservemediet, og dekker cellene med CldU-reservemediet. Plasser celler i inkubatoren i løpet av CldU-pulsen i 20 minutter.
    8. Vask cellene med PBS, skrap av eller trypsinize i 3-4 minutter, og tilsett deretter 5 ml medium til platen, og samle cellene.
    9. Spinn ved 264 x g i 4 minutter. Fjern mediet, og resuspender cellene i 1 ml iskald PBS. Bestem cellenumrene ved hjelp av en trypanblå analyse (hemocytometer telling), og fortynn deretter cellene til ~ 200-400 celler / μL. Hold cellesuspensjonen på is under celletellingen.
      MERK: Begrens om mulig tiden cellene sitter på isen. Dette kan bidra til å oppnå en perle av celleoppløsning langs toppen av lysbildet. Hvis de holdes på is, hold dem på i mindre enn 30 minutter.
  2. Dag 1: Fremstilling av DNA-fibrene
    1. Bruk en blyant til å merke lysbildene (glassglass, 75 mm x 25 mm) med eksperimentell tilstand og dato.
    2. Ta 2 μL celler i en pipette, hold pipetten i en ~45° vinkel, plasser pipetten ca. 1 cm under lysbildeetiketten, og flytt pipetten horisontalt til lysbildeetiketten. Når pipetten beveger seg over lysbildet, slipper du litt av celleløsningen om gangen. Lag flere linjer med celler på hvert lysbilde (kritisk trinn).
      MERK: Det skal være en horisontal linje med celleoppheng over lysbildet. Hvis cellesuspensjonen perler opp, tilsettes deretter 5-10 μL cellemedium til beholderen som har cellesuspensjonen, da dette kan hjelpe løsningen til å feste seg til lysbildet når den påføres igjen.
    3. La løsningen med cellene fordampe til løsningen ser klebrig og klebrig ut. På dette tidspunktet er noe væske forbundet med cellene, men ikke mye. Dette trinnet tar fra 8-20 min og varierer avhengig av hvor mye fuktighet som er i luften.
      MERK: Forsikre deg om at all løsningen ikke har fordampet, siden dette gjør det svært vanskelig å oppnå rette og justerte DNA-fibre, da de fleste, om ikke alle, av DNA vil bli sittende fast sammen og ikke i stand til å skille.
    4. Når oppløsningen er klebrig, overlapper du cellene med 15 μL spredningsbuffer (lysis) per hver cellelinje, og pass på at pipettespissen ikke berører lysbildet. Vent i 10 min. Vipp lysbildet i en vinkel på 25°, og plasser etiketten på lysbildet horisontalt mot kanten av et rørstativ (den nederste delen av etiketten skal være på linje med kanten av rørstativet).
    5. La DNA-spredningene lufttørke i minst 4 timer fra tidspunktet de siste lysbildene ble laget.
      MERK: En periode på 4 timer til 12 timer er bra for tørking. Men ikke la dem tørke over natten. Hvis det får tørke over natten, vil det være mye avslappet DNA, men svært få rette og justerte DNA-fibre.
  3. Dag 1: Fiksering av DNA-fibrene og frysing
    1. Når lysbildene har tørket, fikser du lysbildene med metanol:eddiksyre (3:1) ved å senke lysbildene i 2 minutter. Utfør dette trinnet under en hette, og la skliene tørke over natten i et område med begrenset lyseksponering, eller dekk skliene med et tinnfolietelt.
  4. Dag 2
    1. Plasser lysbildene i en glassbærer. Plasser lysbildene på -20 °C i minimum 24 timer. Dette trinnet forbedrer oppløsningen eller skarpheten i bildet.

3. Utføre DNA-fiberanalysen

  1. Denaturering av DNA
    1. Forbered et fuktet kammer ved hjelp av små pipettespissbokser med lokk. Fyll beholderne halvveis med vann og legg dem i et vannbad på 37 °C i minst 1 time.
    2. Ta lysbildene ut fra -20 °C, og tin dem i noen sekunder. Plasser lysbildene forsiktig i en Coplin krukke som inneholder avionisert (DI) vann slik at de belagte overflatene ikke berører veggene i krukken. Inkuber lysbildet i 20 s, og hell deretter forsiktig ut vannet.
    3. Legg 2,5 m HCL til Coplin krukken slik at den dekker alle lysbildene. Vent i 80 min. Dette er et kritisk trinn i protokollen. En endring i tiden kan endre utfallet av bildet.
    4. Vask lysbildene 1x med PBS pluss Tween (PBS + 0,1% Tween [endelig konsentrasjon]) og deretter 2x med PBS i 3 min hver ved romtemperatur (RT).
  2. Immunfarging
    1. Oppbevar lysbildene i det fuktede kammeret i følgende trinn. Blokker lysbildene i 5% BSA i PBS i 30 min ved RT, og dekk dem med coverslips, coverslips laget av en Western blot bag eller gjennomsiktige plastplater.
    2. Etter blokkering, fjern forsiktig dekselet, fjern blokkeringsløsningen og tørk lysbildet på et papirhåndkle (trykk på lysbildet på håndkleet) for å fjerne overflødig blokkeringsløsning.
    3. Tilsett 100 μL av den primære antistoffløsningen langs lengden på lysbildet. Legg til et nytt plastdeksel, og vent i 2 timer. Når du legger til dekselet, må du sørge for at det ikke dannes bobler.
    4. Etter 2 timer, slå av antistoffoppløsningen, og skyll lysbildene i en PBS-fylt Coplin krukke 2x ved RT. Bruk fersk PBS hver gang for å vaske lysbildene.
    5. Blokker lysbildene igjen ved å legge til 200 μL (tre til fire dråper) med 5% BSA langs hvert lysbilde, og legg til et plastdeksel. Vent i 15 min.
    6. Ta av dekselet, slå av overflødig BSA på et papirhåndkle, og tilsett 100 μL av den sekundære antistoffløsningen langs lengden på lysbildet. Legg til et nytt plastdeksel, og vent i 1 time.
    7. Ta av dekselet, slå av overflødig BSA på et papirhåndkle, og vask lysbildene 2x i PBS på RT.
    8. Blokker lysbildene igjen ved å legge til 200 μL (tre til fire dråper) med 5% BSA langs hvert lysbilde, og legg til et plastdeksel. Vent i 15 min.
    9. Hvis nødvendig, fjern dekselet, fjern overflødig BSA på et papirhåndkle, og tilsett 100 μL tertiær antistoffløsning langs lengden på lysbildet. Legg til nye plastdeksler, og vent i 30 min.
    10. Vask lysbildene med PBS 3x. Fjern overflødig PBS, og la dem tørke helt av.
    11. Når det er tørt, legger du til monteringsmediet og plasserer glassdeksler (24 mm x 60 mm) forsiktig over monteringsmediet slik at bobler unngås. Merk lysbildene på nytt, og la dem stå i mørket over natten.

4. Oppkjøp av bilder

  1. Visualiser de immunfargede DNA-fibrene ved hjelp av et immunfluorescerende mikroskop utstyrt med et kamera, et 60x mål og passende filtersett for å oppdage alexafluor 488 og 594 fargestoffer.
  2. Ta bilder for analysen i regioner der fibrene er godt separert og ikke viklet inn. Det er viktig å ta bilder i forskjellige områder langs lysbildet, siden det å ta bilder i bare én del av lysbildet kanskje ikke gir representative data om alle replikasjonsmellomproduktene som finnes på lysbildet.
  3. Hvis mulig, få fiberbilder fra 20 forskjellige regioner på et lysbilde. Bruk bare én kanal til å velge områdene for å ta bilder for å unngå skjevhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter å ha fått nok bilder (fra 20-100 bilder per tilstand), må replikasjonsmellomproduktene identifiseres, måles og telles. Enten du analyserer fibrene manuelt eller automatisk via et program38, er det nødvendig å klart definere hvilke egenskaper en fiber må ha for at den skal telles eller scores (eller ikke telles eller måles)39. For eksempel kan følgende spørsmål vurderes. (1) Skal man måle og telle bare fibre med 100% immunfluorescens gjennom fiberen, eller kan de inneholde noen regioner uten immunfluorescens (f.eks. skal alle mellomproduktene i figur 4Ai, ii, iii analyseres eller bare en delmengde av dem?)? Hvis du analyserer fibre med signaltap, hva er det maksimale signaltapet akseptabelt i en fiber, og hva er det maksimale antallet kontinuerlige piksler i fiberen som kan være blottet for noe signal (f.eks. Vil figur 3Aiv betraktes som en rødgrønn eller rød-bare mellomliggende?)? (2) Hva skal minimum og maksimum fiberbredder/lengder være? (3) Hva skal signal-til-støy-forholdet (S:N) være når man bestemmer om man skal måle en fiber eller ikke (f.eks. hvor mange fibre skal velges i figur 4B for å analysere?)? (4) Hvor nær bildekanten må en fiber være før den ikke telles eller måles? (5) Hvis et fluorescerende signal er gult, teller man det som rødt eller grønt (f.eks. skal den gule delen av replikasjonsmellomproduktet i figur 4C telles som rød eller grønn?)? (6) Hvor lenge må et fargesegment være for å telle et sant signal (f.eks. er replikasjonen mellomliggende i figur 4D et grønt eneste spor, et grønt-rødt spor eller et grønt-rødt spor?)? (7) Hvis du bruker et automatisert fiberanalyseprogram, hvor trygt er programmet i målingen / tellingen som den nettopp har utført? (8) Hvis fibrene analyseres manuelt, hvor konsistent skal analysen være over tid og mellom individer?

Vanligvis er parametrene som brukes til DNA-fiberanalyse følgende:
Signal-støy-forhold: 3 (fiberintensiteten er tre ganger større enn bakgrunnsintensiteten)
Fibertykkelse: ≤8 piksler i bredden
Minimal størrelse: bare rød eller grønn og 10 piksler; rødgrønne spor med hvert segment ≥10 piksler; Rød-grønn-rød eller grønn-rød-grønn spor med hvert segment ≥10 piksler.
Kontinuitet av fluorescerende signal: minst 80% og ingen hull i signalet større enn 6 piksler.
Tillit til vurdering: Konfidensverdiene bør være like hverandre i et bilde og mellom bilder.

I tillegg til parametrene nevnt ovenfor, er et annet viktig kriterium valget av en klar fiber som ikke overlapper med andre fibre under avbildning og analyse.

Figur 5A viser representative bilder av kontroll (figur 5Ai) og grafenoksid nanopartikkelbehandlet makrofag-DNA (figur 5Aii, iii). Bildet viser en økning i skrivebeskyttede spor (avslutninger) og en reduksjon i nyfyrt opprinnelse i grafenoksidbehandlede celler sammenlignet med kontrollen (figur 5C). Det er også viktig å vurdere antall bilder og plasseringen av lysbildet der bildene er tatt. Som vist i figur 5Aiii,C, ble det observert en variasjon i mønsteret av replikasjonsmellomprodukter (en økning i ny opprinnelse sammenlignet med kontroll) på et annet område av samme tilstand. Selv om noen få av slike observasjoner kanskje ikke påvirker det samlede resultatet, må man passe på å avbilde raset ved å inkludere alle de representative områdene. Det ville være ideelt å dele det totale arealet av lysbildet i fem til seks regioner og ta flere bilder fra hver region (eksempel: 10 bilder) for å finne avgjørende fiberdata for hvert lysbilde. Det er ideelt å velge rundt 500 mellomprodukter (figur 5B) fra flere lysbilder/forhold. Med disse variasjonene i replikasjon kan mellomkvantifisering fra DNA-fiberanalyse brukes til å undersøke variasjonen i DNA-replikasjonsdynamikk forårsaket av grafenoksyd nanopartikler eller gentoksisiteten til andre nanomaterialer. Derfor kan både en kvalitativ og kvantitativ forståelse av dynamikken i genom-bred DNA-replikasjon oppnås gjennom denne nye metodikken sammenlignet med andre analyser nevnt i innledningen.

Figure 1
Figur 1: DNA-fiberanalyse. Skjematisk fremstilling av analysen med oversikt over de viktigste trinnene i DNA-fiberanalysen. Skala: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Immunfarging av DNA-replikasjonsmellomproduktene. Skjematisk fremstilling av ulike replikasjonsmellomprodukter identifisert ved sekvensiell pulsmerking med IdU (rød) og CldU (grønn). Skala: 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Nanopartikkeleksponering. Ulike metoder for å studere variasjoner i nanopartikkelindusert DNA-skade. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Kjennetegn på DNA-fibre som skal skåres. Eksempler på replikasjonsmellomprodukter i et bilde. (A) Hull i immunfluorescens; (i) 0 % immunfluorescenssignaltap over replikasjonsmellomproduktet; (ii) ~ 7% signaltap; (iii) 50% signaltap; og (iv) >90 % signaltap. (B) Et område med mange overlappende replikasjonsmellomprodukter (pilen indikerer regionen med klar fiberoverlapping). (C) En DNA-fiber med en gul region. (D) Et replikasjonsmellomprodukt åpent for tolkning (pilen indikerer hullene i fiberen). Skala: 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: DNA-fiberanalyse og tolkning. (A) Representative DNA-fiberbilder fra (i) kontrollmakrofagceller og (ii,iii) makrofagceller behandlet med nanopartikler i 20 minutter ved en konsentrasjon på 25 μg / ml. Bilder ii og iii ble tatt fra forskjellige regioner i lysbildet. (B) Representativ automatisert programvareanalyse av kontroll- og nanopartikkelbehandlede forhold. For denne analysen brukte vi det automatiserte DNA-fibersporings- og måleprogrammet utviklet av Wang et al.38. Tallene i figuren viser antall DNA-spor analysert. (C) Grafisk fremstilling av programvareanalysen av kontroll- og nanopartikkelbehandlede forhold. NP representerer nanopartikler. Den relative prosentandelen av mellompopulasjonen (for eksempel bare for rødt) beregnes ut fra det totale antallet analyserte mellomprodukter. Sammenligner man NP-behandlet bilde 1 med bilde 2, er det store forskjeller mellom de to bildene. Derfor er det viktig å skaffe mange bilder gjennom hele lysbildet for å forstå hvordan en eksperimentell tilstand påvirker replikasjonsprosessen. Forkortelser: R = rød; G = grønn. Skala: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Medienes sammensetning
10% Fetal Bovine Serum
1% Penicillin-Streptomycin løsning (10000 enheter / ml)
1% l glutamin (200 mM)
Dulbeccos modifiserte ørns middels høye glukose

Tabell 1: Mediesammensetning brukt til makrofagcellekultur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi diskuterer her en metode for å bistå i analysen av variasjonen i DNA-replikasjonsdynamikk i nærvær av nanopartikler gjennom DNA-fiberanalysen. Store kritiske trinn involvert i standardanalysen er beskrevet i protokollen (trinn 2.2.2 og trinn 3.1.3). Det anbefales alltid å bruke et område med begrenset overliggende lyseksponering og konstant luftstrøm for å forhindre lysinduserte DNA-brudd i lysbildene, samt for å forbedre reproduserbarheten. Det kreves nøye oppmerksomhet på tidsvarigheten for tørking av cellelysatet på lysbildene. Overdrying vil påvirke fiberspredningen negativt. Det andre kritiske trinnet er fiberdenaturering ved bruk av en syreoppløsning. Varigheten av syrevasken skal holdes lik for alle lysbildene i samme eksperiment. Feilsøking for disse to trinnene for å finne optimale forhold (lyseringstid, lysatvolum på lysbildet, tørketid og syrevasketid) anbefales for forskjellige celletyper og laboratoriemiljøer.

Som diskutert i figur 3, kan eksponeringsvarigheten av nanopartikler varieres for kvantitativ bestemmelse av endring i DNA-replikasjonsdynamikk indusert av nanopartiklene. For å bestemme den første effekten av replikasjonsdynamikk, vil en kortvarig eksponering som 1 min, 20 min eller 30 min med forskjellige doser være passende. Forskjellen i replikasjonsmønstre (som vist i figur 2) etter langvarig eksponering av cellene til nanomaterialene kan bestemmes ved å sammenligne mønstrene for IdU- og CIdU-eksponering (20 min hver) før og etter nanopartikkelbehandlingen. Denne tilnærmingen kan brukes til å bestemme gaffelstansing, gaffelbremsing og opprinnelsesforskjell ved forskjellige eksponeringstidspunkter, noe som kan tolkes som effekten av akutt og kronisk eksponering for nanomaterialer39,40.

Det er flere lovende teknikker tilgjengelig for å oppdage variasjonen i DNA-replikasjon, for eksempel DNA-kaming og RDS-metoden; Imidlertid, i forhold til disse metodene, er DNA-fiberanalysen praktisk og kostnadseffektiv uten behov for dyre instrumenter for analyse41. Begrensningene i denne metoden er den eksperimentelle varigheten, tiden det tar å ta nok bilder for kvantifisering, samt programvareanalysen. Imidlertid vil denne tilnærmingen støtte nanotoksikologiforskning ved å bestemme genomisk ustabilitet forårsaket av partikler i cellelinjer, så vel som i forskjellige vevsprøver og mellom forskjellige arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

Forfatterne anerkjenner økonomisk støtte fra Blazer-stiftelsen, Medical Biotechnology Program ved Biomedical Sciences, UIC Rockford, og Department of Health Science Education, UIC Rockford. Forfatterne takker Ananya Sangineni og James Bradley for deres bidrag til prosjektet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well plate Fisher brand FB012929
Acetic Acid  Sigma Aldrich 695092
Alexa flour 594 goat anti-rabbit  Invitrogen A11037
Alexa fluor 488 chicken anti-rat   Invitrogen A21470
Alexa fluor 488 goat anti-chicken  Invitrogen A11039
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse  Invitrogen A11062
BSA Sigma Aldrich A2153
CldU Sigma Aldrich 50-90-8
Coverslips (22 x 50 mm) Fisher brand 12-545-EP
EDTA Fisher Scientific 15575020
Frosted Microscope Slides Fisher brand 12-550-11
Hydrochloric Acid Sigma Aldrich 320331
IdU  Sigma Aldrich 54-42-2
Methanol Fisher Scientific A454-4
Mouse Anti-BrdU  BD Biosciences 347580
Phosphate Buffer Saline Gibco 10010072
Rat anti-BrdU  Abcam BU1--75(ICR1)
Raw 264.5 macrophage cells  ATCC TIB-71
SDS Sigma Aldrich L3771
Silane-Prep slides Sigma Aldrich S4651-72EA 
Superfrost gold plus slides Fischer scientific 22-035813
Tris pH 7.4 Sigma Aldrich 77861
Tween 20 Sigma Aldrich P9416

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waga, S., Stillman, B. The DNA replication fork in eukaryotic cells. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 721-751 (1998).
  2. Gambus, A. Termination of eukaryotic replication forks. DNA Replication. 1042, 163-187 (2017).
  3. Berti, M., Cortez, D., Lopes, M. The plasticity of DNA replication forks in response to clinically relevant genotoxic stress. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 633-651 (2020).
  4. Carr, A. M., Lambert, S. Replication stress-induced genome instability: The dark side of replication maintenance by homologous recombination. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4733-4744 (2013).
  5. Berti, M., Vindigni, A. Replication stress: Getting back on track. Nature Structural and Molecular Biology. 23 (2), 103-109 (2016).
  6. Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12 (1), 47-53 (2010).
  7. Khan, I., Saeed, K., Khan, I. Nanoparticles: Properties, applications and toxicities. Arabian Journal of Chemistry. 12 (7), 908-931 (2019).
  8. Ealia, S. A. M., Saravanakumar, M. P. A review on the classification, characterisation, synthesis of nanoparticles and their application. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 263 (3), 032019 (2017).
  9. Bijukumar, D. R., et al. Differential toxicity of processed and non-processed states of CoCrMo degradation products generated from a hip simulator on neural cells. Nanotoxicology. 12 (9), 941-956 (2018).
  10. Bijukumar, D., Segu, A., Chastain, P., Mathew, M. T. Implant-derived CoCrMo alloy nanoparticle disrupts DNA replication dynamics in neuronal cells. Cell Biology and Toxicology. 37 (6), 833-847 (2021).
  11. Shekhar, S., et al. Deciphering the pathways for evaluation of nanotoxicity: Stumbling block in nanotechnology. Cleaner Engineering and Technology. 5, 100311 (2021).
  12. Bhabra, G., et al. Nanoparticles can cause DNA damage across a cellular barrier. Nature Nanotechnology. 4 (12), 876-883 (2009).
  13. Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  14. Chastain, P. D., et al. DNA damage checkpoint responses in the S phase of synchronized diploid human fibroblasts. Photochemistry and Photobiology. 91 (1), 109-116 (2015).
  15. Frum, R. A., Deb, S., Deb, S. P. Use of the DNA fiber spreading technique to detect the effects of mutant p53 on DNA replication. p53 Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 147-155 (2013).
  16. Ord, M. G., Stocken, L. A. Studies in synthesis of deoxyribonucleic acid: Radiobiochemical lesion in animal cells. Nature. 182 (4652), 1787-1788 (1958).
  17. Moore, G., Sainz, J. J., Jensen, R. B. DNA fiber combing protocol using in-house reagents and coverslips to analyze replication fork dynamics in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (2), 101371 (2022).
  18. Blin, M., et al. Transcription-dependent regulation of replication dynamics modulates genome stability. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 58-66 (2019).
  19. Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. 2D gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast. DNA Electrophoresis. , Humana. New York, NY. 43-59 (2020).
  20. Painter, R. B. Radioresistant DNA synthesis: An intrinsic feature of ataxia telangiectasia. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 84 (1), 183-190 (1981).
  21. Aten, J. A., Bakker, P. J. M., Stap, J., Boschman, G. A., Veenhof, C. H. N. DNA double labelling with IdUrd and CldUrd for spatial and temporal analysis of cell proliferation and DNA replication. The Histochemical Journal. 24 (5), 251-259 (1992).
  22. Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo-and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
  23. Huberman, J. A., Riggs, A. D. Autoradiography of chromosomal DNA fibers from Chinese hamster cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 55 (3), 599-606 (1966).
  24. Ockey, C. H. Differences in replicon behavior between X-irradiation-sensitive L5178Y mouse lymphoma cells and AT fibroblasts using DNA fiber autoradiography. Radiation Research. 94 (2), 427-438 (1983).
  25. Brayner, R. The toxicological impact of nanoparticles. Nano Today. 3 (1-2), 48-55 (2008).
  26. Mendez-Bermudez, A., et al. Genome-wide control of heterochromatin replication by the telomere capping protein TRF2. Molecular Cell. 70 (3), 449-461 (2018).
  27. Vindigni, A., Lopes, M. Combining electron microscopy with single molecule DNA fiber approaches to study DNA replication dynamics. Biophysical Chemistry. 225, 3-9 (2017).
  28. Herrick, J., Bensimon, A. Single molecule analysis of DNA replication. Biochimie. 81 (8-9), 859-871 (1999).
  29. Taylor, J. H., Miner, P. Units of DNA replication in mammalian chromosomes. Cancer Research. 28 (9), 1810-1814 (1968).
  30. Nieminuszczy, J., Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. The DNA fibre technique-tracking helicases at work. Methods. 108, 92-98 (2016).
  31. Lemaçon, D., et al. MRE11 and EXO1 nucleases degrade reversed forks and elicit MUS81-dependent fork rescue in BRCA2-deficient cells. Nature Communications. 8, 860 (2017).
  32. Vindigni Lab. Replication Fork Protection. Washington University School of Medicine. , https://vindignilab.wustl.edu/research/replication-fork-protection (2020).
  33. Mimitou, E. P., Symington, L. S. DNA end resection: Many nucleases make light work. DNA Repair. 8 (9), 983-995 (2009).
  34. Schlacher, K., et al. Double-strand break repair-independent role for BRCA2 in blocking stalled replication fork degradation by MRE11. Cell. 145 (4), 529-542 (2011).
  35. Prado, F., Aguilera, A. Impairment of replication fork progression mediates RNA polII transcription-associated recombination. The EMBO Journal. 24 (6), 1267-1276 (2005).
  36. Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: Evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
  37. Halliwell, J. A., Gravells, P., Bryant, H. E. DNA fiber assay for the analysis of DNA replication progression in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 115 (2020).
  38. Wang, Y., et al. Automated DNA fiber tracking and measurement. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 1349-1352 (2011).
  39. Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
  40. Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  41. Martins, D. J., Tirman, S., Quinet, A., Menck, C. F. Detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the DNA fiber assay. Journal of Visualized Experiments. (180), e63448 (2022).

Tags

Biologi utgave 193
Demonstrasjon av DNA-fiberanalysen for å undersøke DNA-skade og reparasjonsdynamikk indusert av nanopartikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patel, S., Chastain, P., Bijukumar,… More

Patel, S., Chastain, P., Bijukumar, D. Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles. J. Vis. Exp. (193), e64903, doi:10.3791/64903 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter