Summary
Этот протокол описывает, как реконструировать митохондриальные кристы для получения 3D-визуализации с высокой точностью, высоким разрешением и высокой пропускной способностью.
Abstract
Понимание динамических особенностей ультраструктуры клеточных органелл, которая не только богата неизвестной информацией, но и сложна с трехмерной (3D) точки зрения, имеет решающее значение для механистических исследований. Электронная микроскопия (ЭМ) обеспечивает хорошую глубину изображения и позволяет реконструировать стеки изображений с высоким разрешением для исследования ультраструктурной морфологии клеточных органелл даже в нанометровом масштабе; Поэтому 3D-реконструкция приобретает все большее значение благодаря своим несравненным преимуществам. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) представляет собой высокопроизводительную технологию получения изображений, которая позволяет реконструировать большие структуры в 3D из одной и той же интересующей области на последовательных срезах. Поэтому применение СЭМ в крупномасштабной 3D-реконструкции для восстановления истинной 3D-ультраструктуры органелл становится все более распространенным. В этом протоколе мы предлагаем комбинацию серийных ультратонких срезов и методов 3D-реконструкции для изучения митохондриальных крист в клетках рака поджелудочной железы. Подробная информация о том, как выполняются эти методы, описана в этом протоколе пошагово, включая метод осмий-тиокарбогидразид-осмий (OTO), последовательную визуализацию ультратонких срезов и дисплей визуализации.
Introduction
Митохондрии являются одними из самых важных органелл в клетке. Они служат центральным узлом клеточной биоэнергетики и метаболизма 1,2 и играют важнейшую роль в развитии рака3. Рак поджелудочной железы (РПЖ) является одним из самых трудно поддающихся лечению онкологических заболеванийиз-за его быстрого распространения и высокого уровня смертности. Митохондриальная дисфункция, которая в основном вызвана изменениями в морфологии митохондрий 3,5,6,7, связана с механизмами заболевания, лежащими в основе ПК8. Митохондрии также очень динамичны, что отражается в частых и динамичных изменениях в их сетевой связности и структуре крист9. Изменение структуры крист может непосредственно влиять на функцию митохондрий и клеточное состояние 10,11, которые значительно изменяются во время роста опухолевых клеток, метастазирования и изменений микроокружения опухоли 12,13.
В последние годы ученые изучали эту органеллу с помощью ЭМ-наблюдений14,15,16,17; Например, исследователи проанализировали динамику митохондрий с помощью методов 3D-реконструкции 6,7,18,19. Общая концепция и метод 3D-реконструкции изображений электронной микроскопии были официально установлены еще в 1968 году и включали в себя сочетание электронной микроскопии, электронной дифракциии компьютерной обработки изображений для реконструкции фагового хвоста Т4. До настоящего времени технология 3D-визуализации электронной микроскопии добилась значительных успехов с точки зрения разрешения изображения 21, степени автоматизации22 и объема обработки23 и использовалась во все более широком масштабе в биологических исследованиях, от уровня тканей до уровня ультраструктуры органелл в нанометровом масштабе24. В последние годы 3D-визуализация в электронной микроскопии также стала перспективной технологией для широкого спектра применений25,26,27.
Растущее внимание к митохондриальным кристам особенно иллюстрирует основные требования к визуализации ультраструктурного объема. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) была использована для визуализации образцов, собранных на медной сетке (400 меш)28, при этом электронный пучок проходит через разрез. Однако из-за ограниченного диапазона медной сетки невозможно полностью отобразить непрерывные срезы одного и того же образца29. Это усложняет изучение структур-мишеней при ПЭМ-визуализации. Кроме того, ПЭМ полагается на трудоемкие и подверженные ошибкам ручные задачи, включая вырезание и сбор нескольких срезов и их последовательную визуализацию21, поэтому он не приспособлен для ультраструктурных реконструкций образцов большого объема23. В настоящее время реконструкция изображений больших объемов образцов с высоким разрешением достигается за счет использования специализированного оборудования, такого как массив камер TEM (TEMCA)30 или две системы TEMCA второго поколения (TEMCA2)31, которые позволяют автоматизировать высокопроизводительную визуализацию за короткое время. Тем не менее, этот тип визуализации не имеет преимущества в том, что он прост в получении и универсален из-за необходимости индивидуального оборудования.
По сравнению с ПЭМ, метод автоматической генерации тысяч последовательных объемных изображений для больших площадей на основе SEM 32,33 повышает эффективность и надежность последовательной визуализации и обеспечивает более высокое z-разрешение34. Например, серийная блочная сканирующая электронная микроскопия (SBF-SEM) и сканирующая электронная микроскопия с фокусированным ионным пучком (FIB-SEM) позволили достичь 3D-реконструкции ультраструктуры с высокой скоростью, эффективностью и разрешением35,36. Тем не менее, поверхность блока неизбежно срезается механическим способом алмазным ножом SBF-SEM или фрезерованием сфокусированным ионным пучком FIB-SEM33,37. Из-за деструктивного действия двух методов на образцы невозможно повторно реконструировать ту же структуру мишени для дальнейшего анализа38,39,40. Кроме того, в нескольких исследованиях была предпринята попытка реконструировать ультраструктуру 3D-органелл раковых клеток с помощью ЭМ для наблюдения за патологическими изменениями12. По этим причинам для дальнейшего выяснения патологических механизмов раковых клеток, таких как клетки рака поджелудочной железы, мы предлагаем новую технологию 3D-реконструкции изображений серийных срезов с использованием ультрамикротома и полевого эмиссионного сканирующего электронного микроскопа (FE-SEM) для анализа ультраструктуры митохондрий на уровне крист; С помощью этой технологии можно получать данные с высоким разрешением, используя эффективный и доступный метод. Серийные ультратонкие срезы, изготовленные с помощью ультрамикротома, могут храниться в сетчатом футляре и многократно повторяться, даже по прошествиинескольких лет. FE-SEM высоко ценится как инструмент в различных областях исследований благодаря своей способности обеспечивать получение изображений с высоким разрешением, большим увеличением и универсальностью42. В попытке отобразить тонкую структуру органелл в 3D, метод получения последовательных стеков 2D-изображений с полезным разрешением с использованием обратно рассеянных электронов, полученных с помощью FE-SEM 43,44, также может быть использован для достижения высокопроизводительной и многомасштабной визуализации целевых областей или связанных с ними структур без специального оборудования45. Генерация артефактов заряда напрямую влияет на качество получаемых изображений, поэтому особенно важно сократить время выдержки.
Таким образом, настоящее исследование развивает экспериментальные процедуры, используемые в этом методе SEM для реконструкции 3D-структуры митохондриальных крист46. В частности, мы показываем процесс, разработанный для достижения полуавтоматической сегментации митохондриальных областей и оцифровки 3D-реконструкции с помощью программного обеспечения Amira, который также включает в себя изготовление образцов срезов с использованием традиционного метода подготовки образцов OTO44,47, завершение сбора срезов с помощью ультрамикротомной резки и получение последовательных 2D-данных с помощью FE-SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка материала
- Культивируют 2 x 106 клеток Panc02 в 12 мл среды DMEM (10% фетальной бычьей сыворотки и 100 ЕД/мл пенициллина-стрептомицина) и выдерживают при 37 °C и влажности 95% в атмосфере 5% углекислого газа и 95% воздуха в течение 48 ч.
- Соберите клетки Panc02, центрифугируйте при 28 x g в течение 2 мин, а затем выбросьте надосадочную жидкость. Убедитесь, что образец имеет соответствующий размер (1 x 107 клеток), так как в противном случае следующие этапы фиксации и обезвоживания не будут работать.
- Добавьте 1 мл 2,5% глутарового альдегида в качестве фиксатора для фиксации свежих клеток Panc02 в пробирках микроцентрифуги объемом 1,5 мл на ночь при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы необходимо центрифугировать при 1,006 x g в течение 5 мин на каждом из следующих этапов (шаги 1.3-1.11). - Отсасывайте фиксатор и дважды промывают образцы 0,1 М фосфатно-солевым буфером (PBS), а затем дважды промывают двойной дистиллированной водой (ddH2O) комнатной температуры в течение 10 мин каждый.
- Добавляют 50 мкл раствора, содержащего 1% тетраоксид осмия (OsO 4) и 1,5% ферроцианида калия в соотношении 1:1 при4 °С в течение 1 ч. Затем дважды промыть 0,1 M PBS в течение 10 минут каждый раз и промыть ddH2O еще 10 минут.
- Добавьте 1 мл 1% тиоуглеводразида (ТГС), инкубируйте при комнатной температуре от 30 мин до 1 ч, а затем промойте ддН2О четыре раза по 10 мин каждый раз.
- Добавьте 50 мкл 1%OsO4, закрепите при комнатной температуре на 1 ч, а затем смойте ddH2O четыре раза по 10 мин каждый раз.
- Добавьте 1 мл 2% уранилацетата при температуре 4 °C на ночь, а затем смойте ddH2O четыре раза в течение 10 минут каждый раз.
- Добавляют 1 мл раствора Уолтона (0,066 г нитрата свинца, растворенного в 10 мл 0,03 моль/л исходного раствора аспарагиновой кислоты) при 60 °C в течение дополнительного 1 ч инкубации.
- Промывайте ddH 2 O четыре раза в течение 10 минут каждый раз, а затем обезвоживайте в серии дифференцированного спирта в течение 10 минут каждый раз: 50% спирта, 70% спирта, 80% спирта, 90% спирта 1 раз и 100% спирта2раза. Затем дважды обезвоживайте в 100% ацетоне по 10 минут каждый раз. Используйте по 1 мл каждого раствора для обезвоживания.
- Смешайте 200 мкл ацетона с эпоксидной смолой Pon 812 в соотношении 3:1, 1:1 и 1:3. Замочите образец в смоле при комнатной температуре на 2 ч, 4 ч и 4 ч соответственно, а затем возьмите 100% эпоксидную смолу Pon 812 для пропитки на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении этапов окрашивания и заделки смолы важно работать в вытяжном шкафу, так как это токсичные вещества. Кроме того, во время эксперимента необходимо надеть лабораторные халаты и перчатки, устойчивые к растворителям. - Поместите образцы в форму для встраивания, а затем поместите в духовку при температуре 60 °C на 48 часов для полимеризации. Используйте плоскую заделку29 , чтобы уменьшить появление смолы вокруг образца. Это упрощает установку образца и снижает влияние артефактов заряда на последующую сегментацию изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для последующего создания горизонтальной режущей поверхности можно добавить небольшое количество смолы в отверстие формы, стараясь не переполнить его. - Готовят кремниевые пластины, предварительно промывая их, а затем гидрофилизируя концентрированным раствором Н2 СО4/Н2О2 в течение 30 мин. На гидрофилизированные кремниевые пластины с помощью ультрамикротома поочередно нарезать полоски толщиной 70 нм и высушить их в духовке при температуре 60 °C в течение 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Медленно захватывайте срез по мере того, как ломтик всплывает на поверхность пластин, чтобы предотвратить потерю или деформацию среза.
2. Получение изображений и трехмерная реконструкция
- Перед установкой кремниевой пластины на сцену трижды промойте срезы дистиллированной водой и высушите их на воздухе. Отрежьте проводящую углеродную ленту размером 1 см x 0,5 см и приклейте ее между кремниевой пластиной и этапом образца SEM, чтобы завершить настройку образца (Рисунок 2E).
- Установите параметр ускоряющего напряжения FE-SEM на 2 кВ с рабочим расстоянием 4 мм (рис. 3B и табл. 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы улучшить соотношение сигнал/шум и уменьшить шум на изображении, по возможности наблюдайте при малом увеличении. По мере увеличения кратности дальность сканирования РЭМ уменьшается, что приводит к увеличению накопления заряда на изображениях. - Нажмите на значок H/L в верхней строке меню. Во-первых, при малом увеличении сориентируйте первую секцию целевых полос среза, а затем снова нажмите на опцию H/L (рис. 3A), чтобы переключиться в режим большого увеличения; Соберите подходящее изображение для интересующей структуры, отрегулировав яркость, контрастность и увеличение изображения.
- Выберите Project View > Open Data (Открытые данные) и импортируйте файлы изображений для анализа в программное обеспечение.
- Выровняйте изображения, щелкнув Align Slices > Edit (рисунок 4B), и отрегулируйте значение Intensity Range в строке меню в левом нижнем углу, изменив прозрачность изображения. Здесь используйте полуавтоматическую стратегию выравнивания; В частности, с помощью автоматического выравнивания сделайте так, чтобы изображения перекрывались с предыдущим изображением, а затем выполните ручную тонкую настройку.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этой работе, в процессе выравнивания, предыдущее изображение использовалось в качестве эталона, а операции перемещения и поворота были использованы для максимального перекрытия целевой структуры двух изображений. Нажатие на Align Current Slice Pair может помочь автоматически выровнять изображения, но может произойти неправильное размещение. - Выберите модуль «Извлечение подтома» и обрежьте выровненные наборы данных, чтобы они соответствовали размеру перекрывающейся части всего стека.
- В подразделе Segmentation (рис. 4C) выберите Resample > Segmentation > Save. Выберите порог инструмента «Волшебная палочка» и размер инструмента «Кисть», чтобы выбрать правильный диапазон. Опять же, используйте полуавтоматический метод сегментации, сначала используя Волшебную палочку, чтобы автоматически выбрать подходящую большую область, а затем используйте Кисть, чтобы точно описать детали.
ПРИМЕЧАНИЕ: Волшебная палочка может быть применена к сегментированным изображениям на основе очевидных различий в интенсивности пикселей, существующих между интересующей структурой и окружающими структурами, путем изменения значения Маскирования и использования Предельной линии рисования. Он не способен различать артефакты заряда, возникающие при получении изображения. Это может привести к некорректной сегментации по целевым регионам. Инструмент «Кисть » можно использовать для сегментации вручную, чтобы точно реконструировать биологические структуры. - В разделе Segmentation > Selection, нажмите на значок + , чтобы добавить выбранную область (рисунок 4C).
- Повторите описанный выше шаг (2.8) для выбора одной и той же целевой структуры на разных изображениях до тех пор, пока не будет завершен выбор для реконструкции интересующих микроструктур.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время процессов митохондриального ремоделирования выбор целевого объекта должен быть выполнен по изображению в середине группы последовательных изображений. Если по первому или последнему снимку выбрана нужная зона, то результат реконструкции не сможет представить полную 3D-визуализацию. - После завершения региональной сегментации сгенерируйте файл изображения в соответствии с наилучшими результатами по размеру объекта и разрешению изображения. Нажмите на Crop Editor, а затем введите число 6 в поле Virtual Slider (Виртуальный ползунок ) (Рисунок 4C).
- В раскрывающемся меню слева щелкните правой кнопкой мыши серую область под подразделом « Проект » и выберите «Создать поверхность» > « Создать» > «Применить». В созданном файле используйте модуль " Вид поверхности" для создания структуры поверхности и 3D-представления.
3. Количественная оценка
- Нажмите « Удалить небольшие пятна» > «Применить» (рисунок 4D). В подразделе Project щелкните правой кнопкой мыши на серой области и выберите Label Analysis > Apply (рисунок 4D).
- Настройте имя столбца и выберите группу мер. Выберите Volume3d и Length3d в поле Собственные измерения.
- Нажмите кнопку «Применить» в левом нижнем углу экрана. Скопируйте данные и график в статистическое программное обеспечение, такое как GraphPad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При культивировании клеток (рис. 1А) мы сначала разделили клетки рака поджелудочной железы на контрольную группу, культивируемую с использованием полной питательной среды, группу (1S,3R)-RSL348 (RSL3, активатор ферроптоза, 100 нМ) и группу RSL3 (100 нМ) плюс ферростатин-149 (Fer-1, ингибитор ферроптоза, 100 нМ). С помощью описанных выше экспериментальных этапов сканирующий электронный микроскоп получил 38 (дополнительный рисунок 1), 43 (дополнительный рисунок 2) и 44 (дополнительный рисунок 3) последовательных изображений для контрольной группы, группы RSL3 и группы ингибиторов (группа RSL3 + Fer-1) соответственно. Изображения размером 1280 x 960 пикселей были получены при 8000-кратном увеличении (с разрешением 12,40 нм/пиксель). Как морщин, так и загрязнений в области клеток над срезами не наблюдалось. Изображения с помощью электронного микроскопа позволяют четко различать органеллы, такие как митохондрии и эндоплазматический ретикулум, в клетках (рис. 1E).
Наблюдение за 2D-изображениями методом FE-SEM показало, что в контрольной группе раковых клеток (рис. 5А) митохондрии были распределены по всей цитоплазме, и большинство из них были сферической или овальной формы и равномерно пухлыми. Кроме того, была хорошо видна относительно правильная, вытянутая кристальная архитектура. И наоборот, в группе RSL3 (рис. 5D) большинство митохондрий продемонстрировали уменьшение морфологии, увеличение плотности мембраны и сравнительно расплывчатую кристальную структуру. Более тщательное изучение снимков СЭМ (рис. 5E) показало, что не все митохондриальные кристы выродились или исчезли, так как относительно небольшое количество крист осталось нетронутым. По сравнению с группой RSL3, в группе ингибиторов большинство митохондрий сохранили интегральную структуру митохондриальных крист, и только меньшая часть митохондриальных кристальных структур не была очевидна (рис. 5G).
Несмотря на то, что двумерная информация показывает различия в морфологии митохондрий, иногда она может привести к предвзятому пониманию детальной и реальной трехмерной структуры50,51. Кристальные структуры контрольной группы в условиях 3D (рис. 5C) соответствовали 2D-изображениям, но отличались для группы RSL3. Для этой группы присутствие полных митохондриальных крист также можно было наблюдать на 2D-изображениях (рис. 5E), но митохондрии под 3D (рис. 5F) были нерегулярными и, как правило, вакуолизированными в середине. Группа ингибиторов (рис. 5I) показала различные формы крист, и только некоторые митохондриальные кристы демонстрировали локализованный коллапс. Таким образом, из результатов группы RSL3 видно, что только использование 2D-анализа может привести к одностороннему пониманию результатов. Результаты 2D-изображений смещены по сравнению с результатами, представленными при наложении набора изображений для 3D-отображения, поэтому невозможно обобщить результаты, полученные только с помощью 2D-информации. Чтобы более объективно продемонстрировать влияние RSL3 на митохондрии, данные 3D-реконструкции были использованы для количественной оценки и измерения митохондриальных изменений52. По сравнению с контрольной группой, длина и объем 3D-митохондрий в группе RSL3 были значительно уменьшены, но результаты количественной оценки в группе ингибиторов оказались между результатами двух других групп (рис. 5J,K). Эти количественные данные свидетельствуют о том, что RSL3 производит меньшие и деградированные митохондрии, а добавление ингибиторов снижает этот эффект.
Как показано на рисунках 6B и 6C, было определено, что индуктор ферроптоза RSL3 вызывает митохондриальную дисфункцию и влияет на клеточный метаболизм, изменяя морфологию митохондрий 53,54 и вызывая ферроптоз, который может представлять собой повсеместную форму динамической гибели клеток в терапии рака, индуцированнойRSL3 55.
Рисунок 1: Общий рабочий процесс для 3D-реконструкции митохондрий клеток рака поджелудочной железы. Продемонстрирован общий рабочий процесс для экспериментов по 3D-реконструкции, описанных в этом протоколе. (А) Культивирование клеток рака поджелудочной железы. (B) Подготовка блока смолы. (C) Сбор серийных срезов с помощью ультрамикротома. (D) Получение 2D-изображений с помощью полевого эмиссионного сканирующего электронного микроскопа. (E) Позиционирование целевых митохондрий на последовательных изображениях РЭМ. (F) Анализ митохондрий в 3D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Устройство для монтажа срезных полосок непрерывных срезов на гидрофилизированную кремниевую пластину. (A) Манипулятор с регулируемым углом наклона с щипцами для удержания пластины. (B) Рамка держателя пластины, расположенная рядом с ультрамикротомом. (C) Позиционирование кремниевой пластины в синей прорези, содержащей алмазный нож. (D) Крупный план, показывающий позиционное соотношение между кремниевой пластиной и лезвием алмазного ножа. (E) Кремниевая пластина с полосками срезов, прикрепленная к предметному столику РЭМ с проводящим углеродным клеем. (F) Крупный план, показывающий общий обзор полосок последовательных срезов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Процесс установки параметров и получения изображений. (A) Строка меню FE-SEM (стрелка указывает на опцию H/L). (B) Таблица параметров и условий визуализации. (C) Обзор последовательных 2D-изображений в трех группах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Пошаговое руководство по визуализации митохондрий в 3D с помощью Amira. (A) Импорт изображений из определенной папки. (B) Выравнивание стопок изображений в соответствии с целевой структурой. (C) Сегментация и добавление интересующей области. (D) Реконструкция 3D-структуры и добавление количественных данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: 2D и 3D морфология митохондрий в каждой группе. Двухмерная морфология раковых клеток контрольной группы при (А) 8 000-кратном увеличении и (Б) 15 000-кратном увеличении. (C) 3D-представление морфологии митохондрий контрольной группы. 2D морфология раковых клеток группы RSL3 при (D) 8 000-кратном увеличении и (E) 15 000-кратном увеличении. (F) 3D-представление морфологии митохондрий группы RSL3. 2D морфология раковых клеток группы RSL3 + Fer-1 (ингибитор) при (G) 8 000-кратном увеличении и (H) 15 000-кратном увеличении. (I) 3D-представление морфологии митохондрий группы RSL3 + Fer-1 (ингибитор). Количественные данные по (J) длине и (K) среднему объему митохондрий в каждой группе. Значимые различия обозначены звездочками и рассчитаны с помощью t-критерия Стьюдента (по сравнению с контрольной группой, *p≤ 0,05, **p≤ 0,01, ***p≤ 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Различия в морфологии митохондрий раковых клеток на 2D и 3D уровнях . (A) Двумерная морфология раковых клеток группы RSL3 при 8000-кратном увеличении. (B) 2D морфология митохондрий при большем увеличении. (C) 3D-представление конкретных митохондрий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Параметры визуализации | Условия |
| DataSize (Размер данных) | 1280 × 960 |
| Размер пикселя | 12.40234 |
| Ускоряющеенапряжение | 2000 Вольт |
| WorkingDistance (РабочееРасстояние) | 3700 мкм |
| ВыбросыТок | 13700 нА |
| Ток пучка | 10 мкА |
| Токоограничивающая диафрагма | Решетка No2 FE-SEM |
| Время выдержки | 32 мкс/пиксель |
| Количество ячеек | 107 |
| Тома с изображениями | 10×8×2,66 мкм, 212,8 мкм³ |
| 10×8×3,01 мкм, 240,8 мкм³ | |
| 10×8×3,08 мкм, 246,4 мкм³ |
Таблица 1: Сводка условий записи и параметров набора данных для получения изображения.
Дополнительный рисунок 1: Обзор изображений 38 микросрезов раковых клеток контрольной группы. Номер изображения каждого микросреза расположен сверху вниз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Обзор изображений 43 микросрезов раковых клеток из группы RSL3. Номер изображения каждого микросреза расположен сверху вниз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 3: Обзоризображений 44 микрошлифов раковых клеток из группы RSL3 + Fer-1 (ингибитор). Номер изображения каждого микросреза расположен сверху вниз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленный здесь метод представляет собой полезное пошаговое руководство по применению техники 3D-реконструкции, которая включает в себя применение технологии электронной микроскопии и обработки изображений для укладки и сегментации 2D-томографических изображений, полученных из последовательных ультратонких срезов. Этот протокол подчеркивает ограниченность 2D-изображений, которая может быть решена с помощью 3D-визуализации ультраструктуры органеллы, которая имеет преимущества высокой воспроизводимости структур на высоком уровне разрешения и более высокой точности. Что еще более важно, эта 3D-визуализация может быть применена к опухолевым клеткам, чтобы сделать изучение патологических механизмов более простым и надежным. Этот метод был рассмотрен в данной работе для визуализации стереоскопических структур митохондриальных крист путем сравнения трех наборов серийных срезов в различных условиях, тем самым подтверждая индуцированную RSL3 деградацию мембраны митохондриальных кристаллов, которая происходит в раковых клетках56. Эти результаты дают представление о механизме действия RSL3 в качестве противоракового препарата.
Получение 2D-изображений высокого разрешения играет важную роль в процессе 3D-реконструкции57 митохондриальных крист, а качество изображения непосредственно влияет на результаты реконструкции 22,58. Поэтому этот метод также имеет некоторые ограничения, такие как артефакты заряда, генерируемые на СЭМ-изображениях59, что, в свою очередь, может привести к некорректной сегментации целевых структур. Эта проблема может быть решена сокращением времени сканирования среза, оснащением РЭМ фокальным компенсатором заряда34,60 и использованием метода ОТО, для которого применение ТКП позволяет сделать образец более проводящим электроны путем окрашивания дополнительными металлами 61. Полагаться на автоматическую сегментацию изображений, как правило, неточно с точки зрения определения объема структуры, в то время как ручная сегментация отнимает много времени58. Таким образом, на основе преимущества быстрого сканирования SEM для реализации сбора изображений62, полуавтоматическая сегментация в программном обеспечении Amira может быть использована для обеспечения эффективной визуализации и реконструкции; Использование программного обеспечения Amira также может сделать результат более точным и точным, чем использование FIJI и MIB63. Ключевым этапом в 3D-визуализации является получение ультратонких срезов. Такие проблемы, как пропуски, разрушения и искажения, которые влияют на непрерывность изображения, часто возникают во время сбора сечений. Для решения таких проблем, как потеря и поломка срезов, мы использовали гидрофилизированные кремниевые пластины в качестве основы для сбора полосок срезов.
Несмотря на то, что SBF-SEM и FIB-SEM могут уменьшить деформацию или дефекты в сечениях, эти методы имеют низкую скорость визуализации, требуют дорогостоящих инструментов и не способны повторно визуализировать интересующую структуру64,65,66. FIB-SEM не обладает стабильностью системы во время визуализации, в то время как SBF-SEM затруднен из-за сложных этапов пробоподготовки и утомительного рабочего процесса34. В последнее время микроскопическая визуализация со стимулированным истощением эмиссии (STED) постепенно применяется для изучения структуры митохондрий. Этот метод отслеживает 3D-изображения митохондриальных крист в живых клетках в режиме реального времени путем создания зондов для мечения митохондрий67. Маркировка флуоресцентными красителями может выявить процессы изменения в кристаллах при слиянии и делении митохондрий68. Тем не менее, живые клетки имеют ограниченную толерантность к интенсивному свету, поэтому трудно использовать этот метод для долговременной визуализации STED68. Кроме того, STED ограничен своим разрешением, глубиной изображения и номеромпикселя 69.
По сравнению с другими методами, использование непрерывных ультратонких срезов в сочетании с технологией 3D-реконструкции для наблюдения ультраструктуры органелл с широким полем зрения не только позволяет получать высокопроизводительные изображения за короткий период времени, но и позволяет исследовать изображения целевых структур с высоким разрешением в дискретные моменты времени21, тем самым повышая скорость визуализации и гибкость реконструкции. Кроме того, морфологические изменения органелл и пространственные связи с другими органеллами могут быть дополнительно изучены. Эти аспекты могут быть количественно оценены, а механизмы изменений могут быть более точно выявлены путем реконструкции соседних органелл для отображения их позиционных отношений70,71. Эта технология 3D-реконструкции и визуализации серийных срезов с использованием Amira58 выявляет корреляцию между заболеваниями и ультраструктурными изменениями органелл на наноуровне72, широко используется в медицине, биологии и других областях, а также прокладывает путь к разработке новых эффективных терапевтических средств73,74.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Исследование выполнено при поддержке грантов Фонда естественных наук провинции Чжэцзян (Z23H290001, LY19H280001); гранты Национального фонда естественных наук Китая (82274364, 81673607 и 81774011); а также Исследовательский проект общественного благосостояния Научно-технического гранта Хучжоу (2021GY49, 2018GZ24). Мы ценим большую помощь, техническую поддержку и экспериментальную поддержку со стороны Общественной платформы Медицинского исследовательского центра Академии китайских медицинских наук, Чжэцзянского китайского медицинского университета.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (1S,3R)-RSL3 | MCE | HY-100218A | |
| Acetone | SIGMA | 179124 | |
| Amira | Visage Imaging | 2020.2 | |
| Aspartic acid | MCE | HY-42068 | |
| Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco | 11995115 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ferrostatin-1 | MCE | HY-100579 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Field emission scanning electron microscope | HITACHI | SU8010 | |
| Glutaraldehyde | Alfa Aesar | A10500.22 | |
| Lead nitrate | SANTA CRUZ | sc-211724 | |
| Osmium Tetroxide | SANTA CRUZ | sc-206008B | |
| Panc02 | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 98102213 | |
| Penicillin-streptomycin | Biosharp | BL505A | |
| Phosphate Buffered Saline | Biosharp | BL302A | |
| Pon 812 Epoxy resin | SPI CHEM | GS02660 | |
| Potassium ferrocyanide | Macklin | P816416 | |
| Thiocarbohydrazide | Merck | 223220 | |
| Ultramicrotome | LEICA | EMUC7 | |
| Uranyl Acetate | RHAWN | R032929 |
References
- Gonidi, M., et al. Mitochondrial UCP4 and bcl-2 expression in imprints of breast carcinomas: Relationship with DNA ploidy and classical prognostic factors. Pathology, Research and Practice. 207 (6), 377-382 (2011).
- Youle, R. J., vander Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
- Dias, N., Bailly, C. Drugs targeting mitochondrial functions to control tumor cell growth. Biochemical Pharmacology. 70 (1), 1-12 (2005).
- Toshiyama, R., et al. Two cases of resectable pancreatic cancer diagnosed by open surgical biopsy after endoscopic ultrasound fine-needle aspiration failed to yield diagnosis: Case reports. Surgical Case Reports. 3 (1), 39 (2017).
- Hoffmann, M., et al. elegans ATAD-3 is essential for mitochondrial activity and development. PLoS One. 4 (10), e7644 (2009).
- Vincent, A. E., et al. The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondrial myopathy. Scientific Reports. 6, 30610 (2016).
- Strubbe-Rivera, J. O., et al. The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-EM reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function. Scientific Reports. 11 (1), 1037 (2021).
- Nagdas, S., et al. Drp1 promotes KRas-driven metabolic changes to drive pancreatic tumor growth. Cell Reports. 28 (7), 1845-1859 (2019).
- Sukhorukov, V. M., Bereiter-Hahn, J. Anomalous diffusion induced by cristae geometry in the inner mitochondrial membrane. PLoS One. 4 (2), e4604 (2009).
- Cogliati, S., et al. Mitochondrial cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
- Shi, P., et al. Mechanical instability generated by myosin 19 contributes to mitochondria cristae architecture and OXPHOS. Nature Communications. 13 (1), 2673 (2022).
- Moscheni, C., et al. 3D quantitative and ultrastructural analysis of mitochondria in a model of doxorubicin sensitive and resistant human colon carcinoma cells. Cancers. 11 (9), 1254 (2019).
- Porporato, P. E., Filigheddu, N., Pedro, J. M. B., Kroemer, G., Galluzzi, L.
- Sachse, M., Fernández de Castro, I., Tenorio, R., Risco, C. The viral replication organelles within cells studied by electron microscopy. Advances in Virus Research. 105, 1-33 (2019).
- Ohta, K., Hirashima, S., Miyazono, Y., Togo, A., Nakamura, K. I. Correlation of organelle dynamics between light microscopic live imaging and electron microscopic 3D architecture using FIB-SEM. Microscopy. 70 (2), 161-170 (2021).
- Wischnitzer, S. An electron microscope study of cytoplasmic organelle transformations in developing mouse oocytes. Wilhelm Roux' Archiv fur Entwicklungsmechanik der Organismen. 166 (2), 150-172 (1970).
- Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. Journal of Microscopy. 259 (2), 155-164 (2015).
- Mourier, A., Ruzzenente, B., Brandt, T., Kühlbrandt, W., Larsson, N. G. Loss of LRPPRC causes ATP synthase deficiency. Human Molecular Genetics. 23 (10), 2580-2592 (2014).
- Miyazono, Y., et al. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8 (1), 350 (2018).
- Cremers, A. F., Schepman, A. M., Visser, M. P., Mellema, J. E. An analysis of the contracted sheath structure of bacteriophage Mu. European Journal of Biochemistry. 80 (2), 393-400 (1977).
- Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
- Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis. Frontiers in Neural Circuits. 12, 98 (2018).
- Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS One. 7 (4), e35172 (2012).
- Lucas, M. S., Günthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures. Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).
- Kittelmann, M.
- Müller-Reichert, T., Kiewisz, R., Redemann, S. Mitotic spindles revisited - New insights from 3D electron microscopy. Journal of Cell Science. 131 (3), 211383 (2018).
- Russell, M. R., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
- Geys, J., et al. Acute toxicity and prothrombotic effects of quantum dots: Impact of surface charge. Environmental Health Perspectives. 116 (12), 1607-1613 (2008).
- Luckner, M., Wanner, G. From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references. Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).
- Phelps, J. S., et al. Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy. Cell. 184 (3), 759-774 (2021).
- Zheng, Z., et al. A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster. Cell. 174 (3), 730-743 (2018).
- Zechmann, B., Möstl, S., Zellnig, G. Volumetric 3D reconstruction of plant leaf cells using SEM, ion milling, TEM, and serial sectioning. Planta. 255 (6), 118 (2022).
- Laws, R., Steel, D. H., Rajan, N. Research techniques made simple: Volume scanning electron microscopy. The Journal of Investigative Dermatology. 142 (2), 265-271 (2022).
- Lippens, S., Kremer, A., Borghgraef, P., Guérin, C. J. Serial block face-scanning electron microscopy for volume electron microscopy. Methods in Cell Biology. 152, 69-85 (2019).
- Schneider, J. P., Hegermann, J., Wrede, C. Volume electron microscopy: Analyzing the lung. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 241-260 (2021).
- Lewis, P. N., Young, R. D., Souza, R. B., Quantock, A. J., Meek, K. M. Contrast-enhanced tissue processing of fibrillin-rich elastic fibres for 3D visualization by volume scanning electron microscopy. Methods and Protocols. 4 (3), 56 (2021).
- Briggman, K. L., Bock, D. D. Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 154-161 (2012).
- Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
- Wacker, I., et al. Hierarchical imaging: A new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues. BMC Cell Biology. 17 (1), 38 (2016).
- Koga, D., Kusumi, S., Shibata, M., Watanabe, T. Applications of scanning electron microscopy using secondary and backscattered electron signals in neural structure. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 759804 (2021).
- Parajuli, L. K., Koike, M. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 627368 (2021).
- Suga, M., et al. Recent progress in scanning electron microscopy for the characterization of fine structural details of nano materials. Progress in Solid State Chemistry. 42 (1-2), 1-21 (2014).
- Koga, D., Ushiki, T., Watanabe, T. Novel scanning electron microscopy methods for analyzing the 3D structure of the Golgi apparatus. Anatomical Science International. 92 (1), 37-49 (2017).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Koga, D., Kusumi, S., Ushiki, T. Three-dimensional shape of the Golgi apparatus in different cell types: serial section scanning electron microscopy of the osmium-impregnated Golgi apparatus. Microscopy. 65 (2), 145-157 (2016).
- Son, R., et al. Morphomics via next-generation electron microscopy. arXiv. 2111, 14373 (2021).
- Lewczuk, B., Szyryńska, N. Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies. Animals. 11 (12), 3390 (2021).
- Shin, D., Kim, E. H., Lee, J., Roh, J. L. Nrf2 inhibition reverses resistance to GPX4 inhibitor-induced ferroptosis in head and neck cancer. Free Radical Biology & Medicine. 129, 454-462 (2018).
- Skouta, R., et al. Ferrostatins inhibit oxidative lipid damage and cell death in diverse disease models. Journal of the American Chemical Society. 136 (12), 4551-4556 (2014).
- Heinen-Weiler, J., et al. Superiority of focused ion beam-scanning electron microscope tomography of cardiomyocytes over standard 2D analyses highlighted by unmasking mitochondrial heterogeneity. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (4), 933-954 (2021).
- Randles, M. J., et al. Three-dimensional electron microscopy reveals the evolution of glomerular barrier injury. Scientific Reports. 6, 35068 (2016).
- Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 27 (1), 321 (2019).
- Oh, S. J., Ikeda, M., Ide, T., Hur, K. Y., Lee, M. S. Mitochondrial event as an ultimate step in ferroptosis. Cell Death Discovery. 8 (1), 414 (2022).
- Jang, S., et al. Elucidating the contribution of mitochondrial glutathione to ferroptosis in cardiomyocytes. Redox Biology. 45, 102021 (2021).
- Sui, X., et al. RSL3 Drives ferroptosis through GPX4 inactivation and ROS production in colorectal cancer. Frontiers in Pharmacology. 9, 1371 (2018).
- Jelinek, A., et al. Mitochondrial rescue prevents glutathione peroxidase-dependent ferroptosis. Free Radical Biology & Medicine. 117, 45-57 (2018).
- Rennie, M. Y., Gahan, C. G., López, C. S., Thornburg, K. L., Rugonyi, S. 3D imaging of the early embryonic chicken heart with focused ion beam scanning electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1111-1119 (2014).
- Garza-Lopez, E., et al. Protocols for generating surfaces and measuring 3D organelle morphology using Amira. Cells. 11 (1), 65 (2021).
- Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).
- Thomas, C. I., et al. Targeting functionally characterized synaptic architecture using inherent fiducials and 3D correlative microscopy. Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 156-169 (2021).
- Friedman, P. L., Ellisman, M. H. Enhanced visualization of peripheral nerve and sensory receptors in the scanning electron microscope using cryofracture and osmium-thiocarbohydrazide-osmium impregnation. Journal of Neurocytology. 10 (1), 111-131 (1981).
- Oho, E., Suzuki, K., Yamazaki, S. Applying fast scanning method coupled with digital image processing technology as standard acquisition mode for scanning electron microscopy. Scanning. 2020, 4979431 (2020).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), e1002340 (2016).
- Trebichalská, Z., et al. High-resolution 3D reconstruction of human oocytes using focused ion beam scanning electron microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 755740 (2021).
- Wei, D., et al. High-resolution three-dimensional reconstruction of a whole yeast cell using focused-ion beam scanning electron microscopy. BioTechniques. 53 (1), 41-48 (2012).
- Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. eLife. 6, 25916 (2017).
- Zhu, T., et al. Live cell mitochondrial 3-dimensional dynamic ultrastructures under oxidative phosphorylation revealed by a Pyridine-BODIPY probe. Biosensors & Bioelectronics. 178, 113036 (2021).
- Yang, X., et al. Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe. Nature Communications. 11 (1), 3699 (2020).
- Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A.
- Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 129-143 (2016).
- Stoica, R., et al. ER-mitochondria associations are regulated by the VAPB-PTPIP51 interaction and are disrupted by ALS/FTD-associated TDP-43. Nature Communications. 5, 3996 (2014).
- Bruno, S. R., Anathy, V. Lung epithelial endoplasmic reticulum and mitochondrial 3D ultrastructure: a new frontier in lung diseases. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 291-300 (2021).
- Park, S. J., Schertel, A., Lee, K. E., Han, S. S. Ultra-structural analysis of the brain in a Drosophila model of Alzheimer's disease using FIB/SEM microscopy. Microscopy. 63 (1), 3-13 (2014).
- Torkamani, N., et al. Three dimensional glomerular reconstruction: A novel approach to evaluate renal microanatomy in diabetic kidney disease. Scientific Reports. 9 (1), 1829 (2019).
