Summary
Presentata qui è una nuova versione della microscopia ad espansione (ExM), Magnify, che viene modificata per un'espansione fino a 11 volte, conservando una gamma completa di classi di biomolecole ed è compatibile con una vasta gamma di tipi di tessuto. Consente l'interrogazione della configurazione su scala nanometrica delle biomolecole utilizzando microscopi convenzionali limitati alla diffrazione.
Abstract
L'imaging su scala nanometrica di campioni biologici può migliorare la comprensione della patogenesi della malattia. Negli ultimi anni, la microscopia ad espansione (ExM) ha dimostrato di essere un'alternativa efficace e a basso costo alla microscopia ottica a super-risoluzione. Tuttavia, è stato limitato dalla necessità di agenti di ancoraggio specifici e spesso personalizzati per mantenere diverse classi di biomolecole all'interno del gel e dalle difficoltà nell'espandere i formati di campioni clinici standard, come il tessuto incorporato in paraffina fissato in formalina, specialmente se si desiderano fattori di espansione più grandi o epitopi proteici conservati. Qui descriviamo Magnify, un nuovo metodo ExM per un'espansione robusta fino a 11 volte in una vasta gamma di tipi di tessuto. Utilizzando la metacroleina come ancoraggio chimico tra il tessuto e il gel, Magnify trattiene più biomolecole, come proteine, lipidi e acidi nucleici, all'interno del gel, consentendo così l'imaging su larga scala dei tessuti sui microscopi ottici convenzionali. Questo protocollo descrive le migliori pratiche per garantire un'espansione dei tessuti robusta e priva di crepe, nonché suggerimenti per la manipolazione e l'imaging di gel altamente espansi.
Introduction
I sistemi biologici mostrano eterogeneità strutturale, dagli arti e dagli organi fino ai livelli di proteine su scala nanometrica. Pertanto, una comprensione completa del funzionamento di questi sistemi richiede un esame visivo su queste scale dimensionali. Tuttavia, il limite di diffrazione della luce causa difficoltà nella visualizzazione di strutture più piccole di ~ 200-300 nm su un microscopio a fluorescenza convenzionale. Inoltre, i metodi ottici di super-risoluzione 1,2,3, come la deplezione di emissione stimolata (STED), la microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM), la microscopia a ricostruzione ottica stocastica (STORM) e la microscopia a illuminazione strutturata (SIM), sebbene potenti, presentano le loro sfide, poiché richiedono hardware e reagenti costosi e spesso hanno tempi di acquisizione lenti e una scarsa capacità di visualizzare grandi volumi in 3D.
La microscopia ad espansione4 (ExM) fornisce un mezzo alternativo per aggirare il limite di diffrazione della luce ancorando covalentemente le biomolecole in un gel polimerico gonfiabile d'acqua e separandole fisicamente, rendendole così risolvibili sui microscopi ottici convenzionali. Una moltitudine di varianti del protocollo ExM sono state sviluppate dalla pubblicazione originale di ExM meno di un decennio fa, e questi protocolli consentono l'incorporazione diretta delle proteine 5,6,7, RNA 8,9,10 o lipidi11,12,13 nella rete di gel alterando l'ancoraggio chimico o espandendo ulteriormente il campione (migliorando così la risoluzione effettiva) in un singolo passaggio14 o in più passaggi iterativi15,16. Fino a poco tempo fa, nessun singolo protocollo ExM poteva mantenere queste tre classi di biomolecole con un singolo ancoraggio chimico disponibile in commercio, fornendo al contempo un gel meccanicamente robusto che poteva espandersi ~ 10 volte in un singolo ciclo di espansione.
Qui, presentiamo Magnify17, una recente aggiunta all'arsenale ExM che utilizza la metacroleina come ancoraggio della biomolecola. La metacroleina forma legami covalenti con tessuti come quello della paraformaldeide, assicurando che più classi di biomolecole possano essere trattenute all'interno della rete di gel senza richiedere vari agenti di ancoraggio specifici o personalizzati. Inoltre, questa tecnica può espandere un ampio spettro di tessuti fino a 11 volte, compresi campioni notoriamente impegnativi come campioni clinici fissati in formalina (FFPE). I metodi precedenti per espandere tali campioni meccanicamente rigidi richiedevano una dura digestione della proteasi, rendendo impossibile l'etichettatura anticorpale delle proteine di interesse dopo che il campione era stato espanso. Al contrario, questa tecnica raggiunge l'espansione dei campioni clinici FFPE utilizzando una soluzione denaturante calda, preservando così gli epitopi proteici interi all'interno del gel, che possono essere mirati per l'imaging post-espansione (Figura 1).
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono gli animali sono state condotte in conformità con le linee guida del National Institutes of Health (NIH) e sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Carnegie Mellon University. Sono stati ottenuti commercialmente campioni di tessuto umano.
1. Preparazione dei reagenti e delle soluzioni stock
NOTA: Fare riferimento alla Tabella dei Materiali per un elenco dei reagenti utilizzati.
- Preparare le soluzioni di gelificante. Questi saranno combinati immediatamente prima della fase di gelificazione.
- Preparare la soluzione madre di monomero (4 g/100 mL DI ACIDO N,N- dimetilacrilammide [DMAA], 50 g/100 mL di acrilato di sodio [SA], 66,7 g/100 mL di acrilammide [AA], 0,10 g/100 mL N,N′-metilenebisacrilammide [Bis], 33 g/100 mL di cloruro di sodio [NaCl], 1x soluzione salina tamponata con fosfato; PBS) utilizzando i componenti elencati nella tabella 1. Sciogliere o diluire tutte le soluzioni madre in acqua. La soluzione madre monomerica può essere conservata a 4 °C per almeno 3 mesi.
- Preparare separatamente in acqua le seguenti soluzioni madre: 0,5% (p/p) 4-Hydroxy-TEMPO (4HT), che inibisce la gelificazione durante la diffusione del monomero nei tessuti, e 10% (p/p) tetrametiletilendiammina (TEMED), che accelera la generazione di radicali iniziata dal persolfato di ammonio (APS) e viene preparato al 10% (p/p).
NOTA: Le soluzioni madre possono essere distribuite in aliquote da 1-2 mL e conservate a 4 °C per un massimo di 3 mesi; tuttavia, l'APS viene prodotto immediatamente prima di preparare la soluzione gelificante.
- Preparare il tampone di omogeneizzazione (1% p/v S.D.S., 8 M urea, 25 mM EDTA, 2x PBS, pH 8, a temperatura ambiente [R.T.]) combinando 1 g di SDS, 48,048 g di urea, 5 mL di EDTA (0,5 M, pH 8), 20 mL di 10x PBS, 25 mL di Tris (2 M) e 0,75 g di glicina. Aggiungere acqua per un volume totale di 100 ml. La soluzione può essere scalata verso l'alto o verso il basso in base alle esigenze e può essere memorizzata presso R.T.
2. Preparazione dei tessuti per vetrini di tessuto clinico archiviati e appena preparati
NOTA: Le fasi di pre-trattamento dei tessuti differiscono in base a come vengono preparati i campioni.
- Per i campioni clinici fissati con paraffina (FFPE) fissati con formaldeide, attenersi alla seguente procedura.
- Porre i campioni in una serie sequenziale di soluzioni (è possibile utilizzare un barattolo colorante per vetrini o un tubo conico da 50 ml): xilene, etanolo al 95%, etanolo al 70% e etanolo al 50%, seguito da acqua deionizzata doppiamente. Utilizzare ciascuna soluzione due volte per almeno 3 minuti ogni volta. Utilizzare una pinza per posizionare il vetrino nel contenitore e aggiungere 15 ml della rispettiva soluzione (sufficiente a coprire il campione). Posizionare orizzontalmente il tubo conico tappato su uno shaker a temperatura ambiente.
- Per i campioni colorati e montati su vetrini permanenti, attenersi alla seguente procedura.
- Posizionare brevemente il vetrino in xilene e rimuovere con attenzione i vetrini utilizzando uno strumento appropriato, come una lama di rasoio. Se il coprivetrino rimane bloccato, riportare i vetrini in xilene a temperatura ambiente fino a quando il vetrino di copertura non si allenta.
- Quindi, elaborare i campioni come campioni FFPE (passaggio 2.1.1).
NOTA: Per i vetrini colorati con ematossilina ed eosina (H & E), la colorazione di ematossilina ed eosina viene persa durante il processo di espansione.
- Per vetrini di tessuto congelato non fissati in soluzione di temperatura di taglio ottimale (OCT), fissare i tessuti in acetone a -20 °C per 10 minuti prima di lavare i campioni con 1x soluzione PBS tre volte per 10 minuti ogni volta a temperatura ambiente.
- Per i vetrini di tessuto clinico congelati precedentemente fissati, sciogliere l'OCT incubando i vetrini per 2 minuti a temperatura ambiente, quindi lavare con 1x soluzione PBS tre volte per 5 minuti ogni volta a temperatura ambiente.
3. Preparazione tissutale per il cervello di topo fissato con paraformaldeide
- Seguire questo protocollo per sezioni cerebrali di topo che hanno uno spessore di 30-50 μm.
NOTA: Il successo può essere riscontrato con sezioni più grandi, ma possono essere necessari tempi più lunghi per la diffusione e l'omogeneizzazione della soluzione monomerica. - Se le sezioni non sono attualmente conservate in una soluzione 1x PBS (ad esempio, in una soluzione di glicerolo al 30% [v/v] e al 30% [v/v] di glicole etilenico in 1x PBS), lavare tre volte per almeno 10 minuti ogni volta a temperatura ambiente in 1x PBS in una piastra da 6 a 24 pozzetti.
- Ottenere un vetrino per microscopia in vetro non rivestito. Se un lato del vetrino è rivestito, utilizzare un pennello bagnato per verificare la presenza del lato non rivestito (spesso, l'etichetta del lato rivestito sarà realizzata in vetro smerigliato e diventerà meno opaca quando bagnata).
- Utilizzare un pennello per bagnare il vetrino non rivestito. Rimuovere il tessuto cerebrale del topo dalla piastra del pozzetto con il pennello e posizionarlo con attenzione sul vetrino, utilizzando un movimento di rotolamento per assicurarsi che il tessuto sia piatto. Lasciare che il PBS in eccesso rimanga sul tessuto fino a quando tutte le sezioni non sono montate.
NOTA: Mentre un singolo vetrino può essere utilizzato per più sezioni di tessuto, quando più sezioni di tessuto vengono gelificate contemporaneamente (anche su vetrini separati), è necessario prestare maggiore attenzione per assicurarsi che non si secchino completamente. - Utilizzando un panno di carta da laboratorio, rimuovere la maggior parte del PBS in eccesso dal vetrino. Lasciare un piccolo anello liquido attorno a ciascuna sezione di tessuto, ma lasciare il resto del vetrino per lo più asciutto. Questo liquido rimanente coprirà il tessuto mentre la soluzione di monomero gel è in fase di preparazione.
4. Gelificazione
NOTA: Questo protocollo è adatto a tutti i tipi di tessuto preparati per l'uso con questa tecnica.
- Applicare distanziatori su entrambi i lati della sezione del tessuto (Figura 2A) per prevenire la compressione del tessuto. Per fare ciò, realizza i distanziatori tagliando sottilmente pezzi di vetro di copertura usando una penna con punta diamantata, quindi fissali al vetrino usando piccole quantità di acqua o 1x PBS, o fissali usando una piccola quantità di super colla. Quindi, posizionare delicatamente i distanziatori su entrambi i lati del tessuto.
- Preparare la soluzione gelificante finale. Generalmente, ~ 200 μL è sufficiente per sezione di tessuto, ma il volume non deve superare 800 μL per vetrino. Qualsiasi altra soluzione gelificante comporterà lo spillover.
NOTA: La metacroleina viene utilizzata per ancorare le biomolecole nel gel. Tuttavia, non è necessaria alcuna fase di ancoraggio separata e la metacroleina può essere aggiunta direttamente alla soluzione gelificante finale.- Per sezione, combinare quanto segue nell'ordine: 200 μL di soluzione monomerica, 0,5 μL di soluzione madre 4HT allo 0,5% (diluizione 1:400), 0,2-0,5 μL di metacroleina (diluizione 1:400-1:1.000 a seconda del tipo di tessuto; in generale, utilizzare una diluizione 1:1.000 per campioni fissati con paraformaldeide [PFA] e 1:400 per campioni clinici FFPE), 2 μL di soluzione madre TEMED al 10% (diluizione 1:100), e 5 μL di soluzione madre di A.P.S. al 10% (diluizione 1:40).
NOTA: Preparare la soluzione gelificante finale immediatamente prima dell'uso. Per evitare gelificazioni premature, aggiungere la soluzione APS per ultima.
- Per sezione, combinare quanto segue nell'ordine: 200 μL di soluzione monomerica, 0,5 μL di soluzione madre 4HT allo 0,5% (diluizione 1:400), 0,2-0,5 μL di metacroleina (diluizione 1:400-1:1.000 a seconda del tipo di tessuto; in generale, utilizzare una diluizione 1:1.000 per campioni fissati con paraformaldeide [PFA] e 1:400 per campioni clinici FFPE), 2 μL di soluzione madre TEMED al 10% (diluizione 1:100), e 5 μL di soluzione madre di A.P.S. al 10% (diluizione 1:40).
- Rimuovere la soluzione in eccesso dalla sezione di tessuto e posizionare il vetrino in una capsula di Petri. Aggiungere tutta la soluzione gelificante fredda appena preparata al campione e incubare la miscela sul tessuto per 30 minuti a 4 °C per consentire la diffusione nel tessuto.
- Posizionare con attenzione un secondo vetrino non rivestito sulla soluzione di tessuto e gel. Le bolle d'aria dovrebbero essere evitate (Figura 2B).
NOTA: Se le bolle d'aria rimangono intrappolate sul tessuto, il coperchio di vetro può essere accuratamente sollevato e ricollocato verso il basso. Inoltre, qualsiasi soluzione monomerica che fuoriesce può essere tagliata dopo la polimerizzazione e non causerà alcun problema al tessuto. - Assicurarsi che la polimerizzazione sia completata. Questa polimerizzazione può essere eseguita in due modi, ognuno dei quali produce risultati simili. In primo luogo, incubare i campioni a 37 °C in un ambiente umidificato (come una capsula di Petri chiusa con un tovagliolo di carta umido) durante la notte. In alternativa, per una polimerizzazione più rapida, incubare i campioni in atmosfera umidificata per 2 ore a 37 °C seguita da 1 ora a 60°C.
5. Digestione dei campioni ed espansione dei tessuti
NOTA: Questo protocollo è adatto a tutti i tipi di tessuto.
- Indossando una protezione per gli occhi, far scorrere una lama di rasoio tra i due vetrini della camera di gelificazione per separarli.
NOTA: I vetrini dovrebbero separarsi molto facilmente. Se diverse parti del gel sono attaccate a entrambi i vetrini, è possibile utilizzare un pennello per guidare il gel verso l'uno o l'altro. Se il gel è diventato particolarmente secco durante la polimerizzazione, 1x PBS può essere applicato all'esterno della camera del gel, ma non immergere completamente il gel, poiché ciò causerà l'espansione prima che il tessuto venga omogeneizzato, il che si tradurrà in fessurazioni. - Tagliare il gel bianco intorno al tessuto per ridurre al minimo il volume. Il taglio asimmetrico del gel consente di tracciare l'orientamento del gel dopo l'omogeneizzazione, poiché il campione sarà completamente trasparente.
- Sollevare delicatamente il gel contenente tessuto dal vetrino con una lametta e trasferirlo delicatamente in un tubo da centrifuga da 2 ml con un pennello.
- Riempire il tubo fino in cima con tampone di omogeneizzazione (tabella 2) preriscaldato a 80 °C.
- Incubare il campione agitando a 80 °C per 8 ore (per cervello di topo fissato con PFA) o 60 ore (la maggior parte dei campioni clinici FFPE; vedere Tabella 3).
NOTA: Il tempo di omogeneizzazione dipende dal tipo di tessuto e dal metodo di fissazione. Molte di queste condizioni sono già state convalidate, ma per altre potrebbe essere necessaria un'ottimizzazione. - Versare il contenuto del tubo della centrifuga in un unico pozzetto di una piastra di coltura cellulare in plastica a 6 pozzetti.
- Rimuovere il buffer di denaturazione con un pipett di trasferimento.
- Per rimuovere completamente la SDS rimanente dall'idrogel, lavare il campione in una soluzione di tensioattivo non ionico all'1% (C12E 10) come segue: almeno tre volte per10 minuti ogni volta a temperatura ambiente; per 60 min a 60 °C; e poi altri tre lavaggi per 10 minuti ogni volta a temperatura ambiente.
- Conservare il campione in 1x PBS + 0,02% di azoturo di sodio a 4 °C fino a quando non è necessario eseguire la colorazione post-espansione e l'imaging.
NOTA: A questo punto, il campione dovrebbe essere ~ 3-4,5 volte più grande in ogni dimensione, a seconda del tipo di tessuto.
6. Profilo delle biomolecole post-espansione
- Colorazione anticorpale
NOTA: Questo segue un tipico protocollo di colorazione immunofluorescenza (IF)/immunoistochimica (I.H.C.). Le quantità di anticorpi primari e secondari utilizzati dipendono dalle concentrazioni suggerite dal produttore o dall'ottimizzazione per l'esperimento specifico. I buffer individuali possono essere sostituiti a discrezione dell'utente.- Con il campione in un singolo pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti, lavare i campioni espansi tre volte per 10 minuti ogni volta in 1x PBS a RT, trasferendo il liquido con una pipetta.
- Eseguire una fase di blocco opzionale (ad esempio, albumina sierica bovina al 3% / Triton-X100 allo 0,1% in 1x PBS) per almeno 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C.
- Incubare con gli anticorpi primari nel tampone colorante (ad esempio, 0,1% Triton-X100 1x PBS o 9x PBS/1% TritonX/10 mg/L eparina) per una notte a 37 °C. A seconda della dimensione del campione, 0,5-2 ml dovrebbero coprire adeguatamente il gel.
- Lavare il campione tre volte per almeno 10 minuti ogni volta in 1x PBS a temperatura ambiente.
- Incubare i corrispondenti anticorpi secondari per 3 ore a 37 °C nel tampone colorante scelto.
- Lavare il campione tre volte per almeno 10 minuti ogni volta in 1x PBS a temperatura ambiente.
- Colorazione pan-proteica NHS-estere
- Con il campione in una piastra a 6 pozzetti, versare 1-2 ml di glicole polietilenico (PEG 200) sul campione (sufficiente per coprirlo completamente).
NOTA: Il tessuto dovrebbe ridursi e tornare alla sua dimensione originale pre-espansione (o vicino ad esso). - Colorare con estere NHS coniugato con fluoroforo diluito a 13,3-80 μg/mL per 3 ore a R.T. in 1-2 mL di tampone colorante (ad esempio, 1x PBS, 2x S.S.C. o 100 mM di soluzione di bicarbonato di sodio).
- Lavare il campione tre volte per almeno 10 minuti ogni volta in 1x PBS a temperatura ambiente.
- Con il campione in una piastra a 6 pozzetti, versare 1-2 ml di glicole polietilenico (PEG 200) sul campione (sufficiente per coprirlo completamente).
- Colorazione dei lipidi
NOTA: La colorazione lipidica post-espansione non è efficace sui campioni clinici FFPE, poiché i lipidi vengono persi durante il processo di fissazione.- Lavare il campione tre volte per almeno 10 minuti ogni volta in 1x PBS a temperatura ambiente.
- Applicare un colorante lipofilo convenzionale (DiO, DiI o DiD) diluito 200 volte in 2 ml di TritonX-100/1x PBS allo 0,1% per 72-96 ore a temperatura ambiente.
- Lavare almeno tre volte con 1x PBS
- Ibridazione fluorescenza in situ (FISH)
- Posizionare i campioni di gel omogeneizzati in tampone di ibridazione preriscaldato a 60 °C per 30 minuti.
- Preparare il tampone di ibridazione per FISH: combinare 2x S.S.C. (300 mM NaCl, 30 mM citrato di sodio, pH 7,0), 10% (v/v) di destrano solfato, 20% (v/v) di etilene carbonato e 0,1% (v/v) Tween20.
- Incubare i campioni di gel con un tampone di ibridazione contenente 10 pM (per oligo) di sonde FISH contro il gene bersaglio (almeno 20 sonde per 10 kb) a 45 °C durante la notte.
- Lavare con tampone di lavaggio rigoroso (2x S.S.C. e 0,1% Tween20) due volte per 15 minuti ogni volta a 45 °C.
- Lavare con tampone di lavaggio rigoroso altre due volte per 10 minuti ogni volta a 37 °C.
- Infine, lavare con 1x PBS almeno tre volte per 10 minuti ogni volta a temperatura ambiente.
- I campioni sono pronti per l'imaging o la conservazione in 1x PBS + 0,02% di azoturo di sodio a 4 °C.
- Espansione completa dei tessuti e imaging a fluorescenza
NOTA: Il fattore di espansione ottenibile con Magnify varia a seconda del tipo di tessuto e del metodo di espansione (un riepilogo completo può essere trovato nella Tabella 3). Tuttavia, come stima generale, un campione di Magnify si espanderà di 3-4,5 volte in 1x PBS, 5-7 volte in PBS diluito a 1:50 in ddH 2 O e 8-11 volte in ddH2O. Il fattore di espansione ottimale per l'imaging dipende dalle esigenze di ciascun esperimento. Il fattore di espansione è altamente sintonizzabile, in modo tale che un singolo campione può essere espanso e ridotto molte volte per l'imaging a varie scale.- Spostare i campioni espansi di 4 volte in PBS su una lastra di imaging a 6 pozzetti con fondo di vetro utilizzando un pennello. Spostare ulteriormente qualsiasi campione espanso tagliandolo in pezzi più piccoli o posizionandolo delicatamente in una grande lastra di imaging con fondo di vetro con un sottile pezzo di plastica flessibile.
- Eseguire l'imaging a fluorescenza utilizzando un microscopio a campo largo convenzionale, un microscopio confocale o un altro sistema di imaging preferito. La rimozione del liquido in eccesso intorno al gel con un panno da laboratorio di carta può impedire il movimento del gel durante l'imaging. I gel possono anche essere immobilizzati applicando lo 0,1% di poli-L-lisina sulla superficie del vetro prima dell'imaging.
NOTA: L'applicazione di poli-L-lisina renderà il gel completamente immobile al contatto. Per questo motivo, è necessario prestare attenzione che il gel venga applicato sul vetro senza piegarsi o allungarsi. Inoltre, il gel non deve essere lasciato asciugare completamente su vetro rivestito di poli-L-lisina, in quanto ciò potrebbe rendere difficile la rimozione e il gel non deve essere rimpicciolito in PBS mentre è ancora attaccato al vetro con poli-L-lisina, poiché ciò potrebbe causare danni al gel o ai tessuti. - Dopo l'imaging, ridurre i campioni in 1x PBS con almeno tre lavaggi per 10 minuti ogni volta, poiché non è consigliabile conservare i campioni a lungo termine in ddH2O a causa della degradazione del segnale di fluorescenza. In particolare, i campioni completamente espansi colorati con coloranti lipofili dovrebbero essere ripresi il più vicino possibile al tempo di espansione per prevenire la dissociazione del colorante in acqua.
- Conservare i campioni in 1x PBS + 0,02% di azoturo di sodio a 4 °C.
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Representative Results
Se il protocollo è stato completato con successo (Figura 1), il campione apparirà chiaro e piatto dopo la denaturazione a caldo; Qualsiasi piegatura o rugosità indica un'omogeneizzazione incompleta. Un campione espanso con successo sarà 3-4,5 volte più grande rispetto a prima dell'espansione in 1x PBS e 8-11 volte più grande quando completamente espanso in ddH2O. La Figura 3 mostra immagini di esempio pre e post-espansione di un campione di rene umano FFPE spesso 5 μm elaborato utilizzando questo protocollo e ampliato con successo su 8 volte. Il tessuto è stato prima colorato con anticorpi per ACTN4 insieme a DAPI per visualizzare il DNA nucleare. Il campione è stato quindi ripreso utilizzando un microscopio confocale a disco rotante (Figura 3A). Il tessuto è stato trattato seguendo il protocollo di cui sopra, compresa la colorazione post-espansione degli stessi bersagli, e completamente espanso in acqua (Figura 3B) prima di ri-imaging. Dopo la denaturazione termica, anche le biomolecole diverse dalle proteine possono essere colorate e visualizzate come mostrato nella Figura 4. I coloranti lipofili possono essere applicati per rivelare le strutture della membrana cellulare e mitocondriale nel cervello del topo (Figura 4A). Inoltre, gli acidi nucleici possono essere visualizzati attraverso la FISH, come nel tessuto linfonodale umano normale FFPE mostrato in Figura 4B,C.
La Figura 5 mostra un risultato probabile se il campione non viene adeguatamente omogeneizzato. Dopo l'espansione, il tessuto è stato colorato con anticorpi per ACTN4 e vimentina, insieme a DAPI per visualizzare il DNA nucleare e agglutinina del germe di grano (WGA) per etichettare i carboidrati. Il tessuto è stato espanso di 3,5 volte in PBS prima di acquisire immagini utilizzando un microscopio confocale a disco rotante. In una sezione renale (Figura 5A,C), si può vedere l'espansione senza crepe di un glomerulo. In una sezione separata (Figura 5B, D), il cracking può essere chiaramente visto nel tessuto.
Figura 1: Schema del flusso di lavoro di Ingrandimento. La pre-elaborazione dei vetrini tissutali archiviati clinicamente viene prima eseguita in base al formato di conservazione. Le sezioni fissate con paraformaldeide fluttuante devono essere lavate solo in PBS. I campioni vengono quindi incubati in una soluzione di monomero di gel, compresa la metacroleina per ancorare le biomolecole all'idrogel. La polimerizzazione in situ viene eseguita prima della denaturazione termica con urea, SDS e EDTA. I campioni vengono quindi accuratamente lavati e colorati utilizzando protocolli di immunocolorazione convenzionali, protocolli FISH o coloranti lipofili. I campioni vengono quindi espansi in acqua pura prima dell'imaging. Questa cifra è stata modificata da Klimas et al.17. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Camera di gelificazione del campione di tessuto. (A) Su ciascun lato del tessuto, due distanziatori, come due pezzi di vetro di copertura #1.0, sono posizionati prima che la soluzione di monomero gel sia lasciata diffondere a 4 °C. Per evitare la compressione, i distanziatori dovrebbero essere più spessi delle fette di tessuto. (B) Un coperchio, come un secondo vetrino, viene utilizzato per coprire il campione prima della polimerizzazione a 37 °C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esempio di immagini pre-espansione di una sezione di tessuto renale umano. (A) Un'immagine scattata con ingrandimento 60x (1,4 NA) rispetto a (B) un'immagine dello stesso campo visivo post-espansione con Magnify scattata a 40x di ingrandimento (1,15 NA, fattore di espansione: 8,15x). Magenta, DAPI; Giallo, ACTN4. L'intensità massima delle immagini post-espansione viene proiettata su 25 fotogrammi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Strategie alternative di colorazione delle biomolecole con Magnify . (A) (i e iv) Marcatura pan-proteica estere NHS di tessuto cerebrale di topo completamente espanso. (ii e v) Marcatura del colorante lipofilo (DiD) dello stesso tessuto cerebrale del topo. iii e vi) I canali si sono fusi. (B) DNA FISH con ingrandimento utilizzando FFPE normale tessuto linfonodale umano. Fattore di espansione: 3,5x in 1x PBS. Bianco, DAPI; Magenta, serina/treonina chinasi 1 gene; Blu, gene CDH1 della proteina attivatrice APC/C; Giallo, sequenza satellitare umana S4. (C) Singoli canali associati a B. Tutte le immagini sono state ottenute utilizzando un microscopio confocale a disco rotante con ingrandimento 40x (1,15 NA). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Risultati rappresentativi di campioni di rene FFPE spessi 5 μm. (A) Espansione senza crepe. Bianco, DAPI; Giallo, vimentina; Ciano, alfa-actina 4; Magenta, agglutinina del germe di grano. (B) Sezione renale espansa che mostra fessurazioni. Crepe, distorsioni e perdita di bersagli etichettati possono essere il risultato di un ancoraggio e/o di un'omogeneizzazione inadeguati. (C,D) Immagini ingrandite delle regioni riquadri rispettivamente in A e B. Tutte le immagini sono state ottenute utilizzando un microscopio confocale a disco rotante con ingrandimento 10x (A, B; 0,45 NA) o 60x (C, D; 1,2 NA). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1: Composizione della soluzione di monomero di gel. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Composizione del buffer di omogeneizzazione. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 3: Riassunto delle condizioni di metaacroleina e omogeneizzazione per tessuti validati. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Qui, presentiamo il protocollo Magnify 17, una variante ExM che può trattenere più biomolecole con un singolo ancoraggio chimico ed espandere campioni clinici FFPE impegnativi fino a11 volte con denaturazione termica. I cambiamenti chiave in questo protocollo che lo distinguono da altri protocolli ExM includono l'uso di un gel riformulato che rimane meccanicamente robusto anche quando completamente espanso, così come l'uso di metacroleina come ancoraggio della biomolecola. I passaggi più critici in questo protocollo sono i seguenti: 1) la composizione della soluzione gel finale; 2) la tempistica delle fasi di gelificazione; 3) la configurazione della camera di gelificazione; 4) i parametri per l'omogeneizzazione del campione; e 5) il lavaggio sufficiente di SDS dal campione prima della colorazione post-espansione.
Il parametro più critico per questo protocollo è la composizione della soluzione gelificante finale, in particolare la concentrazione della metacroleina di ancoraggio della biomolecola. Sono necessarie diverse concentrazioni di metaacroleina per espandere diversi tipi di tessuto (Tabella 3) e occorre prestare attenzione per garantire che questo valore sia ben adattato al campione da espandere. Il sovra-ancoraggio con metacroleina può comportare un fattore di espansione ridotto e una perdita di epitopi disponibili per la colorazione post-espansione, mentre il sotto-ancoraggio, specialmente nei campioni clinici FFPE, può causare crepe o distorsioni tissutali. Pertanto, la concentrazione di metacroleina deve essere ottimizzata per i tipi di tessuto non convalidati, anche se la concentrazione ottimale probabilmente cadrà vicino o all'interno dell'intervallo qui presentato. Mentre ci aspettiamo che questo protocollo funzioni per la maggior parte dei tipi di tessuto, anche quelli che non abbiamo ancora convalidato, è noto che non funziona per i campioni contenenti osso.
Oltre alla metacroleina, l'uso di una concentrazione errata di un ingrediente gel critico (4HT o TEMED) può portare al completo fallimento dell'esperimento, a causa di gelificazione incompleta o assente (eccessiva 4HT) o gelificazione prematura (TEMED eccessivo, 4HT ridotto o aggiunta di APS prima degli altri componenti). Per evitare gelificazioni premature, è inoltre necessario mantenere il campione e il gel a 4°C ed esposti all'aria per 30 minuti e coprire il campione solo e posizionarlo a 37°C in una camera umidificata al termine del processo di diffusione.
Quando si costruisce la camera del gel, è fondamentale includere distanziatori tra i due vetrini di vetro non rivestiti, specialmente per sezioni di tessuto più spesse come il cervello di topo fissato con PFA. La mancanza di distanziatori può causare la compressione dei tessuti, con conseguente distorsione delle immagini e dati imprecisi.
L'omogeneizzazione del campione dipende dal tempo di digestione con il tampone di digestione, nonché dalla temperatura e dalla composizione del tampone di digestione. Un'omogeneizzazione inadeguata può causare distorsioni e fattori di espansione ridotti rispetto al valore riportato per un determinato tipo di tessuto. Se si sospetta un'omogeneizzazione incompleta, il tempo di digestione può essere aumentato, in particolare nel caso di tessuti più spessi.
Un passaggio semplice ma cruciale è l'adeguato lavaggio della SDS dal campione con un tensioattivo non ionico (come C12E10) dopo la fase di omogeneizzazione. Qualsiasi SDS residuo può causare un legame anticorpale subottimale o completamente ostacolato. Fortunatamente, se questo è sospettato, un ulteriore lavaggio e la riapplicazione degli anticorpi saranno spesso una soluzione soddisfacente.
Il protocollo fornisce un'alternativa economica alle attuali tecniche di imaging a super-risoluzione e microscopia elettronica per interrogare strutture su scala nanometrica in vari campioni di tessuto, compresi i campioni clinici FFPE. L'uso della metacroleina e della denaturazione termica consente la profilazione post-espansione di eventuali biomolecole che vengono conservate durante la fissazione dei tessuti (questo preclude l'imaging dei lipidi nei campioni di FFPE, ad esempio). Il nostro protocollo, come estensione del framework ExM, è modulare e probabilmente compatibile con altre tecniche come i metodi ottici di super-risoluzione (STED18, STORM19) o la microscopia ad espansione iterativa (iExM)15. Tuttavia, questi devono ancora essere testati con il protocollo presentato e i grandi fattori di espansione possono presentare sfide, specialmente con la diluizione del fluoroforo. Inoltre, le grandi dimensioni dei campioni dopo la completa espansione in acqua richiedono attenzione durante la manipolazione (sebbene il gel utilizzato qui sia più resistente rispetto alle precedenti formulazioni di gel ExM ad alto fattore di espansione, come la microscopia a espansione dieci volte robusta (TREx), per la gestione degli errori17), e occasionalmente sono necessarie soluzioni creative per trasferire e visualizzare questi gel completamente espansi. Ad esempio, utilizzando strumenti a base larga come un sottile foglio di plastica per trasferire i gel completamente espansi piuttosto che un pennello, o utilizzando lastre di imaging di grandi dimensioni su misura (nelle nostre mani, questo significa lastre tagliate al laser o stampate in 3D con grandi pezzi di vetro di copertura # 1.5 aderenti al fondo; questi possono essere visti nel video di accompagnamento). Ancora più importante, questo metodo amplia l'applicabilità dell'imaging su scala nanometrica consentendo l'imaging su nanoscala di comuni preparati biologici e patologici su microscopi convenzionali a largo campo o confocali.
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Disclosures
Gli autori dichiarano i seguenti interessi finanziari concorrenti: Y.Z., A.K., Z.C. e B.R.G. hanno inventato diverse invenzioni relative a Magnify ed ExM.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Carnegie Mellon University e dalla D.S.F. Charitable Foundation (Y.Z. e X.R.), dal National Institutes of Health (N.I.H.) Director's New Innovator Award DP2 OD025926-01, e la Kauffman Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
- Hell, S. W.
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S.
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), 165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nature Methods. 18, 107-113 (2021).
- White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M.
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Chang, J. -B., et al.
- Park, J., et al. Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP). Science Advances. 7 (46), (2021).
- Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology. , (2023).
- Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
- Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388 (2020).
