Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

توليد شبكية العين العصبية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

Published: December 22, 2023 doi: 10.3791/66246
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 2, 3, 3, 1,2, 2, 3, 3, 1,2
1Medical School of Chinese PLA, 2Senior Department of Ophthalmology, The Third Medical Center of Chinese PLA General Hospital, 3Stem Cell and Regenerative Medicine Lab, Beijing Institute of Radiation Medicine
* These authors contributed equally

Summary

يصف البروتوكول الحالي نظام تحريض شبكية العين العصبي 3D الأمثل الذي يقلل من التصاق وانصهار عضويات الشبكية مع قابلية عالية للتكرار والكفاءة.

Abstract

اعتلال الشبكية هو أحد الأسباب الرئيسية للعمى في جميع أنحاء العالم. التحقيق في التسبب في المرض أمر ضروري للتشخيص المبكر والعلاج في الوقت المناسب لاعتلال الشبكية. لسوء الحظ ، تعيق الحواجز الأخلاقية جمع الأدلة من البشر. في الآونة الأخيرة ، أظهرت العديد من الدراسات أنه يمكن تمييز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (PSCs) إلى عضويات شبكية العين (ROs) باستخدام بروتوكولات تحريض مختلفة ، والتي لديها إمكانات هائلة في اعتلال الشبكية لنمذجة الأمراض ، وفحص الأدوية ، والعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية. تصف هذه الدراسة بروتوكول الحث الأمثل لتوليد شبكية العين العصبية (NR) التي تقلل بشكل كبير من احتمال الحويصلة والانصهار ، مما يزيد من معدل نجاح الإنتاج حتى اليوم 60. استنادا إلى قدرة PSCs على إعادة التنظيم الذاتي بعد الانفصال ، جنبا إلى جنب مع بعض العوامل التكميلية ، يمكن لهذه الطريقة الجديدة أن تدفع على وجه التحديد تمايز NR. علاوة على ذلك ، فإن النهج غير معقد وفعال من حيث التكلفة ، ويظهر قابلية تكرار وكفاءة ملحوظة ، ويقدم آفاقا مشجعة لنماذج شخصية لأمراض الشبكية ، ويوفر خزانا وفيرا للخلايا لتطبيقات مثل العلاج بالخلايا ، وفحص الأدوية ، واختبار العلاج الجيني.

Introduction

تعمل العين كمصدر أساسي للمعلومات بين الأعضاء الحسية البشرية ، حيث تكون شبكية العين هي النسيج الحسي البصري الرئيسي في عيون الثدييات1. يعتبر اعتلال الشبكية أحد الأسباب العالمية الرئيسية لأمراض العيون ، مما يؤدي إلى العمى2. يعاني ما يقرب من 2.85 مليون شخص في جميع أنحاء العالم من درجات متفاوتة من ضعف البصر بسبب اعتلال الشبكية3. وبالتالي ، فإن التحقيق في التسبب في المرض أمر بالغ الأهمية للتشخيص المبكر والعلاج في الوقت المناسب. ركزت معظم الدراسات حول اعتلال الشبكية البشري بشكل أساسي على النماذج الحيوانية4،5،6. ومع ذلك ، فإن شبكية العين البشرية هي نسيج معقد متعدد الطبقات يضم أنواعا مختلفة من الخلايا. عادة ما تفشل زراعة الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) وأنظمة النماذج الحيوانية في تلخيص التطور الزماني المكاني الطبيعي واستقلاب الدواء لشبكية العين البشرية الأصلية 7,8.

في الآونة الأخيرة ، تطورت تقنيات زراعة 3D لتوليد أعضاء تشبه الأنسجة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSCs) 9,10. لا تحتوي عضويات الشبكية (ROs) المتولدة من PSCs البشرية في نظام ثقافة تعليق ثلاثي الأبعاد على سبعة أنواع من خلايا الشبكية فحسب ، بل تظهر أيضا بنية طبقية مميزة مماثلة لشبكية العين البشرية في الجسم الحي11،12،13. اكتسبت ROs المشتقة من PSC البشرية شعبية وتوافر واسع النطاق وهي حاليا أفضل النماذج في المختبر لدراسة تطور ومرض شبكية العين البشرية14,15. على مدى العقود القليلة الماضية ، أثبت العديد من الباحثين أن PSCs البشرية ، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) ، يمكن أن تتمايز إلى ROs باستخدام بروتوكولات تحريض مختلفة. تحمل هذه التطورات إمكانات هائلة في اعتلال الشبكية لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية والعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية16،17،18.

ومع ذلك ، فإن توليد شبكية العين العصبية (NR) من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (PSCs) هو عملية معقدة ومرهقة وتستغرق وقتا طويلا. علاوة على ذلك ، قد تؤدي الاختلافات من دفعة إلى أخرى في عضويات الأنسجة إلى انخفاض قابلية استنساخ النتائج19،20. يمكن أن تؤثر العديد من العوامل الجوهرية والخارجية على إنتاجية عضويات الشبكية (ROs) ، مثل عدد أو أنواع الخلايا الأولية واستخدام عوامل النسخ ومركبات الجزيئات الصغيرة21،22،23. منذ أن تم إنشاء أول RO بشري بواسطة مختبر Sasai11 ، تم اقتراح تعديلات متعددة على مر السنين لتعزيز سهولة وفعالية عملية الحث13،21،24،25. لسوء الحظ ، حتى الآن ، لم يتم إنشاء بروتوكول قياسي ذهبي لتوليد ROs في جميع المختبرات. في الواقع ، هناك درجة معينة من التناقض في ROs الناتجة عن طرق الحث المختلفة ، وكذلك التباين الواسع في التعبير عن علامات الشبكية وقوة هيكلها22,26. قد تعقد هذه القضايا بشدة جمع العينات وتفسير نتائج الدراسة. لذلك ، هناك حاجة إلى بروتوكول تمايز أكثر توحيدا وقوة لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة مع الحد الأدنى من عدم تجانس توليد RO.

تصف هذه الدراسة بروتوكول الحث الأمثل بناء على مزيج من Kuwahara et al.12 و Döpper et al.27 مع تعليمات مفصلة. تقلل الطريقة الجديدة بشكل كبير من احتمال الحويصلة العضوية والانصهار ، مما يزيد من معدل نجاح توليد NR. يحمل هذا التطور وعدا كبيرا لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية وتطبيقات العلاج بالخلايا لاضطرابات الشبكية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت هذه الدراسة وفقا لمبادئ إعلان هلسنكي ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات المؤسسية في مستشفى جيش التحرير الشعبي الصيني العام. تم الحصول على خط ESC WA09 (H9) من معهد أبحاث WiCell.

1. الإعلام الثقافي وإعداد الكاشف

  1. وسيط ثقافة ESC البشرية وحل المرور
    1. وسط الصيانة (مم): قم بإعداد 500 مل من MM الكامل (الوسط الأساسي + ملحق 5x ؛ انظر جدول المواد) بشكل معقم. قم بإذابة 5x مكمل في درجة حرارة الغرفة (RT) أو طوال الليل عند 2-8 درجة مئوية. يقلب جيدا قبل الاستخدام حتى يصبح المكمل خاليا من الغيوم.
    2. 1٪ مصفوفة خارج الخلية (ECM): استخدم طرف ماصة مبرد مسبقا وأنابيب معقمة لتوزيع 200 ميكرولتر من ECM (انظر جدول المواد) لكل أنبوب على الجليد. قم بتخزين الأنابيب في فريزر -20 درجة مئوية. قم بإذابة ECM على الجليد وخففه باستخدام DMEM / F12 المبرد مسبقا عند 1: 100.
    3. 0.5 mM pH = 8.0 EDTA: لتحضير 500 مل من 0.5 mM EDTA ، أضف 500 ميكرولتر من 0.5 M EDTA و 0.9 جم من NaCl إلى 500 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) (انظر جدول المواد). تخلط جيدا وتخزن على حرارة 2-8 درجة مئوية.
  2. وسط تمايز الشبكية
    1. وسط محدد كيميائيا خال من عوامل النمو (gfCDM): قم بإعداد gfCDM من خلال الجمع بين 45٪ من متوسط Dulbecco's GlutaMAX المعدل من Iscove (IMDM-GlutaMAX) ، و 45٪ من Ham's F12-GlutaMAX (F12-Glutamax) ، واستبدال مصل الضربة القاضية بنسبة 10٪ (KSR) ، وتركيز دهون الكوليسترول بنسبة 1٪ ، و 450 ميكرومتر ثيوجلسرين (انظر جدول المواد).
  3. مركبات الجزيئات الصغيرة
    1. Y-27632 2HCl: أضف 50 مجم من مسحوق Y-27632 إلى 3.122 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). الاستغناء عن وتخزين Y-27632 (انظر جدول المواد) بتركيز 50 mM عند -80 °C لمدة 2 سنوات ، مع الابتعاد عن الضوء. قم بتخفيف المخزون 2500 مرة (20 ميكرومتر) للاستخدام ، أي ما يعادل 0.4 ميكرولتر من Y-27632 لكل مل من gfCDM.
    2. IWR1-endo: أضف 2.4424 مل من DMSO لإذابة 10 ملغ من IWR1-endo (انظر جدول المواد) للحصول على محلول مخزون 10 mM. الاستغناء عن القسمة وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 سنوات. أضف 0.3 ميكرولتر من 10 mM IWR1-endo لكل مل من gfCDM لتركيز 3 ميكرومتر للتحريض.
    3. SB431542: لتحضير 50 مللي مول SB431542 ، أضف 10 مجم من SB431542 (انظر جدول المواد) إلى 0.5203 مل من DMSO واخلطها جيدا. يحفظ في -80 درجة مئوية في مذيب لمدة أقصاها 2 سنة. لإعداد SB431542 بتركيز عمل 10 ميكرومتر ، أضف 2 ميكرولتر من محلول المخزون 50 مللي متر إلى 10 مل من gfCDM.
    4. LDN-193189 2HCl: قم بإذابة 5 مجم من LDN-193189 2HCl (انظر جدول المواد) في 10.4297 مل من DMSO للحصول على 1 mM من محلول المخزون. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية (على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة). أضف 0.1 ميكرولتر من المخزون إلى كل 10 مل من gfCDM ، مما ينتج عنه 100 نانومتر من LDN-193189 للتحريض.
    5. البروتين المورفولوجي العظمي البشري المؤتلف 4 (BMP4): يعاد تكوينه عند 50-200 ميكروغرام / مل في 4 ملليمتر حمض الهيدروكلوريك (انظر جدول المواد). يخزن في درجة حرارة 2 إلى 8 درجات مئوية لمدة شهر واحد أو -20 درجة مئوية لمدة عام واحد بعد إعادة التكوين. إجراء تحريض NR باستخدام 1.5 نانومتر BMP4.
  4. وسط ثقافة NR طويل الأجل
    1. حمض الريتينويك (RA): قم بقياس 6 مجم من مسحوق RA (انظر جدول المواد) وأضفه إلى 3.9941 مل من DMSO. يخزن في قسومة 5 مللي مول عند -80 درجة مئوية ويستخدم في غضون 3 أشهر. لتحقيق تركيز عمل يبلغ 0.5 ميكرومتر ، أضف 10 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى 100 مل من وسط تمايز الشبكية العصبية (NRDM). أضف قبل الاستخدام مباشرة.
      ملاحظة: يحفظ بعيدا عن الضوء أثناء التحضير والتخزين.
    2. التورين: أضف مسحوق التورين (انظر جدول المواد) الذي يزن 200 مجم إلى 7.9904 مل من DMSO للحصول على محلول مخزون 200 مللي متر. يوزع ويخزن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. يتم تحقيق تركيز عمل قدره 0.1 mM taurine بإضافة 50 ميكرولتر من محلول المخزون لكل 100 مل من NRDM.
    3. NRDM: قم بتكوين NRDM مع وسط DMEM / F12-GlutaMAX ، ومكمل N2 1٪ ، ومصل بقري جنيني 10٪ ، و 0.5 mM RA و 0.1 mM taurine (انظر جدول المواد). يخزن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين أو 6 أشهر عند -20 درجة مئوية لضمان نشاط المكونات.
  5. حظر المخزن المؤقت: قم بتخفيف 1: 9 باستخدام DPBS للحصول على حل عملي بنسبة 10٪ للاستخدام (انظر جدول المواد). يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 5 سنوات.
    ملاحظة: نفذ جميع الإجراءات الأخرى في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية لضمان العقم ، باستثناء الوزن. إذا كان من الضروري إضافة الكواشف الموزونة أثناء عملية التحضير ، فاستخدم مرشحات 0.22 ميكرومتر للترشيح.

2. زراعة H9-ESCs

  1. ذوبان H9-ESCs
    1. أضف 1 مل من 1٪ ECM إلى كل بئر من لوحة 6 آبار. احتضان لمدة 1 ساعة في حاضنة عند 37 درجة مئوية في جو CO2 5٪.
      ملاحظة: تجنب إضافة ECM على طول جدران البئر ، لأنها قد تلتصق بالسطح.
    2. خذ مخزون التبريد H9-ESC من خزان النيتروجين السائل ورجه بسرعة في ماء 37 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
      ملاحظة: لا تدع القارورة تذوب تماما.
    3. قم بإزالة القارورة وتعقيمها بعناية باستخدام رذاذ الكحول المطهر بنسبة 75٪. أضف H9-ESC المذاب من cryovial إلى أنبوب 15 مل يحتوي على 9 مل مم مع 10 ميكرومتر Y-27632.
    4. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 190 × جم لمدة 5 دقائق في RT. قم بإزالة معظم المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة سعة 1 مل ، تاركا حوالي 50 ميكرولتر من المادة الطافية لتجنب فقدان الخلايا.
    5. أضف 1 مل من MM يحتوي على 10 ميكرومتر من Y27632 إلى رواسب الخلية وأعد تعليق رواسب الخلية برفق باستخدام ماصة 1 مل عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 5-10 مرات.
    6. إزالة طلاء ECM بعد 1 ساعة من الحضانة. أضف 2 مل من MM المسخن مسبقا الذي يحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 إلى كل بئر.
    7. الاستغناء عن 0.5 مل من تعليق الخلية لكل بئر. هز اللوحة برفق بشكل جانبي لضمان التوزيع المتساوي للخلايا.
    8. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة على الأقل دون لمسها.
    9. تغيير الوسيلة يوميا. عندما تصل كثافة الاستنساخ إلى 70٪ وما فوق ، يلزم المرور.
  2. تمرير H9-ESCs
    1. قم بإعداد اللوحة المطلية ب ECM كما هو موضح أعلاه (الخطوة 2.1.1) وأضف 2 مل من مم لكل بئر.
    2. قم بإزالة الوسط المستهلك من ألواح 6 آبار. اغسل كل بئر مرتين باستخدام 1 مل من DPBS.
    3. اغسل كل بئر مرتين عن طريق إضافة 1 مل من EDTA ببطء ، واحتضان 1 مل من EDTA لمدة 4-7 دقائق في RT.
      ملاحظة: أثناء الحضانة ، افحص اللوحة المكونة من 6 آبار لمدة 3 دقائق تحت المجهر. انتقل فورا إلى الخطوة التالية إذا كانت معظم الخلايا على وشك الانفصال عن الطبق. تجنب الحضانة لفترة طويلة للحد من التأثير السلبي على الخلايا.
    4. تخلص من EDTA وأضف 1 مل من MM لإجهاض الهضم.
    5. اضغط برفق على لوحة البئر حتى يتم فصل غالبية الخلايا.
    6. انقل تعليق الخلية بعناية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل مع ماصة سعة 5 مل. أعد تعليق مستعمرات H9-ESC برفق لأعلى ولأسفل 3-5 مرات لخلطها مع حفرة باستور. انقل 20-100 ميكرولتر من تعليق الخلية في طبق استزراع جديد مكون من 6 آبار مطلي ب ECM ورجه ذهابا وإيابا.
    7. عندما يلاحظ أن كثافة الخلية كافية تحت المجهر ، احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة على الأقل دون لمسها.
    8. قم بتغيير الوسائط يوميا. عند كثافة استنساخ 70٪ وما فوق ، يلزم المرور.

3. توليد NRs البشرية

ملاحظة: بمجرد أن تحقق المستعمرات التقاء بنسبة 70٪ تقريبا ، يمكن توجيهها نحو التمايز إلى عضويات شبكية العين (ROs) باستخدام الخطوات الإجرائية الموضحة في الشكل 1.

  1. اليوم 0 - تكوين الجسم الجنيني (EB)
    1. بعد غسل الخلايا ب 2 مل من DPBS ، أضف 0.5 مل من CDS (انظر جدول المواد) تحتوي على 20 ميكرومتر Y27632 إلى البئر. احتضان لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 مرطبة 5٪.
      ملاحظة: تحقق تحت المجهر. تقليل وقت الحضانة قدر الإمكان لتجنب الآثار الضارة على الخلايا.
    2. إجهاض الهضم بإضافة 3 مل من مم تحتوي على 20 ميكرومتر Y27632. أجهزة الطرد المركزي في 190 × غرام لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف.
    3. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من gfCDM تحتوي على 20 ميكرومتر Y27632 ، وعد الخلايا. أضف الحجم المقابل ل 1.2 × 106 خلايا (1.2 × 104 خلايا لكل بئر) إلى 10 مل من gfCDM ، والتي تم دمجها مسبقا مع 20 ميكرومتر Y-27632 و 3 ميكرومتر IWR1-endo و 10 ميكرومتر SB431542 و 100 نانومتر LDN-193189 (انظر جدول المواد).
    4. أضف 100 ميكرولتر من معلق الخلية إلى كل بئر من 96 بئرا مخروطية القاع على شكل حرف V. ضع الطبق في حاضنة CO2 مرطبة بنسبة 5٪ حتى اليوم السادس.
      ملاحظة: لا تحرك الأطباق لمدة 24 ساعة على الأقل لتعزيز التصاق EBs.
  2. اليوم 6 - تحريض الشبكية
    1. في اليوم السادس، أضف 10 مل من gfCDM تحتوي على 55 نانوغرام/مل BMP4 للسماح بتغيير كامل لوسط الاستزراع في EBs. أعد اللوحة إلى الحاضنة.
      ملاحظة: ماصة باتجاه جدران البئر المخروطي ذو القاع V 96 لتجنب فقاعات الهواء. تجنب تناول أي مواد عضوية عند تغيير الوسط.
    2. قم بإجراء تغيير نصف متوسط في اليوم 9 واليوم 12 واليوم 15. استبدل نصف الوسط ب gfCDM الطازج لتخفيف BMP4 تدريجيا.
  3. اليوم 18 - ثقافة NR طويلة الأجل
    1. في اليوم 18 ، انقل EBs المشكلة بعناية إلى أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل باستخدام ماصات باستور سعة 5 مل وشطفها برفق مرة أخرى باستخدام NRDM. انقل EBs إلى ألواح منخفضة الامتزاز ذات 6 آبار أو 24 بئرا (انظر جدول المواد). أعد اللوحة إلى الحاضنة.
    2. استبدل الوسط ب NRDM طازج كل 3 أيام.
      ملاحظة: أطفئ الضوء أثناء تغيير الوسط لأن RA حساس للضوء. إزالة المواد العضوية المتمايزة بشكل سيئ ، وفصل المواد العضوية الملتصقة تحت المجهر.

4. تحليل NRs البشرية

  1. تركيب مكاتب تسلم الطلبات
    1. حدد أجيالا مختلفة من H9-ESCs للحث على ثلاث دفعات من ROs.
      ملاحظة: تم حساب ثلاث لوحات من عدد NRs للتشكيل لكل طريقة من الطرق الثلاث التي تم تقييمها (Kuwahara et al.12 ، Döpper et al.27 ، والطريقة المعدلة في الدراسة الحالية) لتقييم معدل نجاح الحث. يعتبر الحث ناجحا إذا كشف الفحص المجهري الضوئي عن تكوين هياكل شبيهة بالظهارة العصبية في اليوم 30.
  2. تلطيخ المناعي من ROs
    1. نقل 3-5 ROs إلى أنابيب 1.5 مل. ماصة قبالة الوسط الزائد وغسل ROs مرة واحدة مع 1 مل من DPBS في RT. السماح ل ROs بالغرق وإزالة DPBS بعناية. أضف 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (انظر جدول المواد) لكل أنبوب 1.5 مل وثبته عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: ROs في اليوم 6 واليوم 18 ، إصلاح 2 ساعة. إصلاح لمدة 12 ساعة في اليوم 30 و 14 ساعة في اليوم 60.
    2. بعد التثبيت ، جفف باستخدام الكحول المتدرج. اترك ROs للوقوف لمدة 15 دقيقة لكل منها في 50٪ و 60٪ و 70٪ كحول ، وبعد ذلك لمدة 10 دقائق لكل منها في 80٪ و 90٪ و 95٪ و 100٪ كحول. ثم أضيفي مزيجا 1: 1 من الكحول 100٪ والزيلين لمدة 10 دقائق ، متبوعا بالزيلين مرتين لمدة 10 دقائق لكل منهما.
    3. ضع ROs في قوالب معدنية مملوءة ب paraplast المذاب (انظر جدول المواد) لمدة 40 دقيقة ، ثم قم بإخماد القوالب على الجليد لإصلاح ROs. ضع صناديق التضمين في القوالب وقم بتجميدها عند -20 درجة مئوية طوال الليل. بعد ذلك ، افصل صناديق التضمين بعناية. أخيرا ، قم بتخزينها في RT.
    4. قم بإنشاء أقسام مستمرة (سمك 5 ميكرومتر) باستخدام قطاعة البارافين. إصلاح الشرائح على شرائح مجهر الالتصاق ، وتجفيفها ، وتخزينها في RT.
    5. إجراء إزالة الشمع والإماهة قبل إصلاح المستضد12,27.
    6. أضف 10 مل من محلول استرجاع مستضد سيترات 20x pH 6.0 (انظر جدول المواد) إلى 190 مل من ddH2O (H2O المقطر المزدوج). يسخن في الميكروويف على وضع عال لمدة 4 دقائق حتى الغليان. بعد إضافة أقسام البارافين ، قم بتسخين الأقسام في الوضع المنخفض لمدة 20 دقيقة لإكمال إصلاح المستضد.
    7. اترك أقسام البارافين لتبرد بشكل طبيعي في منطقة جيدة التهوية ثم ضعها في غرفة رطبة.
    8. استخدم قلم عنق الرحم (انظر جدول المواد) لتحديد الأقسام. احتضان 0.2٪ Triton X-100 في RT لمدة 30 دقيقة لكسر الأغشية ، متبوعا بغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام TPBS ، لمدة 5 دقائق لكل منها.
    9. كتلة مع مصل حمار 10 ٪ مخفف في DPBS في RT لمدة 1 ساعة في غرفة رطبة مع 10 ميكرولتر لكل منطقة تلطيخ.
    10. أضف الأجسام المضادة الأولية المخففة في مصل الحمير بنسبة 10٪. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في غرفة الرطوبة. اغسل العينات ثلاث مرات باستخدام TPBS لمدة 10 دقائق لكل منها لإزالة الجسم المضاد غير المقيد.
      ملاحظة: الأجسام المضادة الأولية هي كما يلي: مضاد PAX6 (1: 250) ، مضاد SOX2 (1: 200) ، مضاد KI67 (1: 200) ، مضاد CHX10 (1: 200) ، مضاد β توبولين III (1: 250) ومضاد نستين (1: 200) (انظر جدول المواد).
    11. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المخففة في DPBS لمدة 1 ساعة في RT في غرفة مرطبة. كرر خطوة الغسيل مع TPBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها.
      ملاحظة: ابق في الظلام لمنع إخماد الجسم المضاد الثانوي الفلوري. الأجسام المضادة الثانوية هي Alexa Fluor 488 مترافقة مع IgG المضاد للحمار و Alexa Fluor 568 مترافقة مع IgG المضاد للأرانب عند تخفيف 1: 400 (انظر جدول المواد).
    12. احتضان مع DPBS التي تحتوي على DAPI (1: 500 ؛ انظر جدول المواد) لمدة 10 دقائق في RT في الظلام. اغسل ثلاث مرات باستخدام TPBS لمدة 10 دقائق لكل منها.
    13. قم بإسقاط كمية مناسبة من مانع التسرب المضاد للفلورسنت (انظر جدول المواد) على الشريحة وقم بتغطيتها بزلات الغطاء.
    14. تصور باستخدام محلل كمي لخلايا الأنسجة يشبه التدفق (انظر جدول المواد) ، أو ما شابه ذلك.
    15. قم بتخزين الشرائح عند -20 درجة مئوية في الظلام بعد التحليل المجهري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يظهر الشكل 1 نظرة عامة رسومية على البروتوكول المعدل . تم استخدام H9-ESCs لتوليد ROs عندما نمت الخلايا بكثافة 70٪ -80٪. تم تجميع معلقات أحادية الخلية ل H9-ESCs في 96 بئرا مخروطية القاع على شكل V في اليوم 1 وشكلت EBs مستديرة محدودة جيدا بحلول اليوم 6. مع زيادة وقت الثقافة ، زاد حجم EBs تدريجيا. في اليوم 30 ، تم تشكيل الهياكل الشبيهة بالظهارة العصبية بوضوح وسمكها أثناء تمايز NR على المدى الطويل.

بالإضافة إلى ذلك ، تمت مقارنة الطريقة المعدلة بطريقتين أخريين (Kuwahara et al.12 و Döpper et al.27) لتقييم تكرارها وكفاءتها (الشكل التكميلي 1). لاحظت هذه الدراسة أيضا أن مورفولوجيا EBs في اليوم 1 بعد الطريقة المعدلة كانت أسوأ قليلا من الطريقتين الأخريين. ومع ذلك ، كانت الهياكل الظهارية العصبية التي تشكلت باستخدام الطريقة المعدلة أكثر استمرارية في اليوم 18 (الشكل 2). في اليوم 30 ، كانت NRs المبكرة التي تم الحصول عليها باستخدام الطريقة المعدلة متشابهة في الشكل والحجم وأظهرت شكلا دائريا منتظما (الشكل 3). بالمقارنة مع الطريقتين الأخريين ، كان لدى NRs التي شكلتها الطريقة المعدلة نسبة أقل من الحويصلة والالتصاق. علاوة على ذلك ، استنادا إلى H9-ESCs ، ارتفع معدل نجاح توليد NRs باستخدام الطريقة المعدلة إلى 87.39٪ من 26.9٪ و 69.24٪ لطرق Kuwahara et al. و Döpper et al.12,27 ، على التوالي (الشكل 3M).

تم إجراء تلطيخ التألق المناعي على أقسام مدمجة بالبارافين من NRs لتقييم التعبير عن العلامات المتعلقة بتطور الشبكية (الشكل 4). أظهرت النتائج التعبير عن الجينات البشرية المرتبطة بشبكية العين في NRs المشتقة من H9-ESCs باستخدام طريقة معدلة. النوع الفرعي الأول للخلايا الذي يظهر هو خلية العقدة الشبكية ، والتي تراكمت بشكل أساسي على الجانب القاعدي من NRs. تم استخدام تلطيخ TUJ1 لتحديد محاور خلايا العقدة الشبكية (الشكل 4I-L). علاوة على ذلك ، تم الكشف عن علامات الخلايا السلفية للشبكية في كل من الطبقات الداخلية (PAX6 +) والخارجية (CHX10 +) (الشكل 4A-H). تم توزيع الخلايا الإيجابية لعلامة الانتشار KI67 في الطبقة الخارجية (الشكل 4A-D).

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية. تظهر النظرة العامة التخطيطية لبروتوكول الثقافة المعدلة إضافة عوامل مختلفة في نقاط زمنية محددة والصور التمثيلية لتطور الشبكية العصبية. SFEBq: ثقافة عائمة خالية من المصل من الركام الجنيني الشبيه بالجسم مع إعادة تجميع سريعة ؛ KSR: استبدال مصل خروج المغلوب ؛ gfCDM: وسط محدد كيميائيا خال من عوامل النمو ؛ NRDM: وسط تمايز الشبكية العصبية. BMP4: البروتين المورفولوجي العظمي 4. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: صور برايت فيلد التمثيلية لعضويات الشبكية المشتقة من ثلاثة بروتوكولات مختلفة في المرحلة المبكرة. في اليوم 1 ، فقط الطريقة المعدلة لم تكن من EBs (A ، E ، I). في اليوم 6 ، تشكلت EBs في جميع الطرق الثلاث (B ، F ، J). في اليوم 18 ، تشكلت شبكية العين العصبية المبكرة ، وتم العثور على مورفولوجيا مختلفة بين طرق الحث الثلاثة (C ، G ، K). في اليوم 21 ، أظهرت شبكية العين العصبية الناتجة عن الطريقة المعدلة بنية ظهارية عصبية مستمرة (D ، H ، L). قضبان المقياس: 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الشبكية العصبية ثلاثية الأبعاد الناضجة في ثقافة التعليق في الأيام 30 و 45 و 60. في اليوم 30 ، تشكلت شبكية العين العصبية في جميع الطرق الثلاث (A ، E ، I). تشير الأسهم إلى الهياكل الكيسية في طريقة Kuwahara et al. (B). تمثل الصناديق المنقطة البيضاء منطقة التصاق المواد العضوية والانصهار مع بعضها البعض (D ، F ، H). تتشابه عضويات الشبكية الناتجة عن البروتوكول المعدل في الحجم والتشكل مقارنة بالطريقتين الأخريين (C ، G ، J ، K ، L). قضبان المقياس: 100 ميكرومتر (أبيض) ؛ 200 ميكرومتر (أسود). الرسم البياني الإحصائي لمعدل نجاح الحث بالطرق الثلاث باستخدام H9-ESCs (M). تم استخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه لاختبار الأهمية (تظهر أشرطة الخطأ الخطأ المعياري ، n = 864 ، ** P < 0.01 ، ***P < 0.001). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: توصيف الشبكية العصبية في البروتوكول المعدل. صور مناعية لشبكية العين العصبية في اليوم 6 واليوم 18 واليوم 30 واليوم 60. البقع الخضراء هي ل KI67 (الخلية المتكاثرة) ، PAX6 (الخلية السلفية الشبكية) ، و NESTIN (الخلايا الجذعية العصبية). البقع الحمراء مخصصة ل CHX10 (الخلية السلفية الشبكية) و SOX2 (الخلية السلفية العصبية) و TUJ1 (خلية العقدة الشبكية). قضبان المقياس: 100 ميكرومتر (أ ، ب ، ه ، و ، ط ، ي) ؛ 200 ميكرومتر (C ، D ، G ، H ، K ، L). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: مقارنة مخططات التدفق لبروتوكولات تحريض الشبكية العضوية الثلاثة. SFEBq: ثقافة عائمة خالية من المصل من الركام الجنيني الشبيه بالجسم مع إعادة تجميع سريعة ؛ KSR: استبدال مصل خروج المغلوب ؛ gfCDM: وسط محدد كيميائيا خال من عوامل النمو ؛ NRDM: وسط تمايز الشبكية العصبية. BMP4: البروتين المورفولوجي العظمي 4. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: مورفولوجيا الجسم الجنيني (EB) الناجم عن طريقة Kuwaharaet al. لوحظ الظهور التدريجي لكتل الخلايا الميتة حول EBs بعد إضافة BMP4 في اليوم 6 (A-D ، الأسهم السوداء). لوحظت اختلافات مورفولوجية كبيرة ، بعد اليوم 6 (E-L) ، وتم تعطيل بعض EBs تماما (H ، L). ESC: الخلايا الجذعية الجنينية ، PBMC: خلية الدم أحادية النواة المحيطية ، IPSC: الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يمكن ل ROs البشرية أن تلخص مكانيا وزمانيا تطور شبكية العين الجنينية ، وتظهر ROs المبكرة درجة عالية من التشابه مع شبكية العين الجنينية في مراحل مماثلة من التطور15. من حيث مورفولوجيا الأنسجة والتعبير الجزيئي ، يعكس RO البشري عن كثب حالة النمو الفعلية لأنسجة الشبكية ، مما يوفر فرصا هائلة وغير مسبوقة في مجالات نمذجة الأمراض وفحص الأدوية والطب التجديدي. حاليا ، تم إنشاء العديد من الطرق المختلفة لتوليد ROs من PSCs البشرية في المختبر ، والتعديلات والتحسينات المستمرة جارية لزيادة تحسين الكفاءة9. أبلغ مختبر ساساي لأول مرة عن توليد ROs المشتقة من PSC من ESCsالبشرية 11. تم تحضير ESCs البشرية أولا في معلقات أحادية الخلية ، ثم تم زرع أعداد متساوية من الخلايا في 96 بئرا مخروطية القاع على شكل V ، مع تجميع سريع لتشكيل EBs دائرية. عززت الإضافة الخارجية لمسارات إشارات الخلايا الرئيسية تكوين الحويصلات البصرية في EBs ، والتي نضجت لاحقا إلى ROs مغلفة في ثقافة التعليق. يحتوي NR على نوع واحد من الخلايا الدبقية وستة أنواع مختلفة من الخلايا العصبية ، تمثل العديد من جوانب تطور الشبكية ، مثل تشكل الخلايا ، وتمايز الخلايا العصبية ، والقطبية القميةالقاعدية 9. على الرغم من أن 10٪ فقط من الركام شكلت بنية كوب بصري مزدوج الجدران ، إلا أن هذا كان معلما رئيسيا في تطور إنتاج ROs11 أكثر تقدما.

في وقت لاحق ، قدم Zhong et al. بديلا جديدا ، حيث نمت hiPSCs لأول مرة بالقرب من نقاط الالتقاء ، تليها التفكك الكيميائي أو الميكانيكي إلى مجاميع صغيرة عائمة13. بعد ذلك ، شكلت المجاميع الصغيرة EBs في ثقافة التعليق ، والتي انفصلت بشكل منفصل عن الجزء السفلي من اللوحة ، مما زاد من التمايز في الاتجاه العصبي. أظهر Zhong et al. شبكية العين 3D مغلفة تماما مع شرائح خارجية متطورة نسبيا لمستقبلات الضوء التي استجابت لتحفيز الضوء. تتطلب هذه الطريقة تنظيما خارجيا أقل لمسارات إشارات الخلية وتم إجراؤها بشكل أساسي بطريقة ذاتية التوجيه9. كانت الثورة التكنولوجية الثالثة هي إدخال طريقة التضمين من قبل مجموعة Lowe25. تضمن ذلك تضمين مجاميع hESC في ECM لتشكيل هيكل ظهاري أحادي التجويف. بعد التشتت الأنزيمي ، تم الحفاظ على الركام في ثقافة التعليق لتشكيل ROs ناضجة. على الرغم من أن جميع الطرق الثلاث يمكن أن تحفز بنجاح ROs ذات الهيكل والوظيفة المماثلين ، إلا أن التطبيقات واسعة النطاق لها عيوب كونها تستغرق وقتا طويلا وشاقة بسبب عدم تجانسها العالي ومعدل نجاحهاالمنخفض 23.

بالإضافة إلى الطرق المذكورة أعلاه ، اقترح Kuwahara et al. طريقة تحريض جديدة ، وهي طريقة انخفاض تدرج العامل الرئيسي12. وجدوا أنه يمكن إنشاء NR عن طريق إضافة BMP4 بتركيز متناقص من اليوم 6. استخدم نظام الحث هذا عوامل خارجية أقل لتشكيل ROs مع زيادة توحيد الحجم والمورفولوجيا. ومع ذلك ، فقد أفادت الدراسات أن EBs المشكلة كانت عرضة للآفات الكيسية ، وكان معدل نجاح الحث لهذه الطريقة حوالي 40٪ 12,28. قام Döpper et al. بتعديل هذا البروتوكول لتحسين معدل النجاح من خلال الجمع بين وسيط تجاري وثلاثة مثبطات جزيء صغيرة في المرحلة المبكرة من الحث لتثبيت EBs27. في المقابل ، تلتصق خلايا الظهارة العصبية للشبكية بسهولة أكبر ببعضها البعض ، مما يستلزم زراعة منفصلة لكل RO أثناء ثقافة التعليق طويلة الأجل. تزيد طريقة Döpper et al. من مضاعفات وتكاليف العمليات التجريبية وهي غير مناسبة للتحريض على نطاق واسع27. أدى بروتوكول إنتاج RO المحسن إلى تحسين كفاءة الحث. تمت مقارنة الطريقة المعدلة الحالية بأساليب Kuwahara et al. و Döpper et al.

أظهرت هذه الدراسة أن كلا من طرق Kuwahara et al. و Döpper et al. شكلت EBs ذات حواف ناعمة في اليوم 1 ، في حين أن الطريقة المعدلة الحالية تتطلب وقتا طويلا نسبيا لتشكيل EBs ، تقريبا حتى اليوم 6. كان حجم EBs التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة Kuwahara et al. أكبر من ذلك الذي تم الحصول عليه باستخدام طريقة Döpper et al. ، وأظهرت EBs التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة Döpper et al. زيادة السيولة تحت تدفق السائل. والجدير بالذكر أن كتل الخلايا الميتة ظهرت تدريجيا حول EBs بعد إضافة BMP4 في اليوم 6 عند استخدام طريقة Kuwahara et al. (الشكل التكميلي 2). بحلول اليوم 18 ، لوحظت اختلافات مورفولوجية كبيرة في EBs لطريقة Kuwahara et al. ، وتم تعطيل بعض EBs تماما (الشكل التكميلي 2). في طريقة Döpper et al. ، كانت غالبية EBs مستديرة ومحدودة جيدا ، ولم تظهر سوى عدد صغير من الخلايا الميتة المتناثرة حولها. شكلت الطريقة المعدلة EBs ضيقة وجيدة التنظيم مع اختلافات مورفولوجية طفيفة ، ولوحظت بعض الخلايا الميتة حولها.

علاوة على ذلك ، وجدت هذه الدراسة أيضا أن بعض EBs ولدت حويصلات بواسطة Kuwahara et al. في المرحلة المبكرة بعد النقل إلى ألواح 6 آبار ، مما أدى إلى فشل تكوين ROs. حدث التصاق واندماج ROs في حوالي اليوم 40 ، مما قلل بشكل كبير من فائدة التجارب. نظام الاستزراع لطريقة Döpper et al. أكثر تعقيدا ، ويتطلب خطوات تشغيلية أكثر وتكلفة أعلى من طريقة Kuwahara et al. غالبية ROs بواسطة Döpper et al. كما طورت حتما التصاقات واندماجات مع بعضها البعض. نجحت الطريقة المعدلة في هذه الدراسة في توليد 3D NRs في المختبر التي عبرت عن العلامات المتعلقة بشبكية العين البشرية CHX10 و KI67 و PAX6 و SOX2 و TUJ1 و NESTIN. وكانت معظم التناضح العكسي بالطريقة المعدلة متسقة في الحجم والتشكل ، وتطور عدد قليل جدا من الحويصلات أو الالتصاقات خلال المراحل المتأخرة من تمايز الشبكية.

بالمقارنة مع الطريقتين الأخريين ، كان لنظام الاستزراع الجديد خطوات تشغيلية أبسط وتكاليف أقل. تتمثل الخطوة الحاسمة في الطريقة المعدلة في إضافة ثلاثة مثبطات جزيء صغيرة إلى الوسائط والتأكد من عدم تحريك اللوحة خلال الأيام الستة الأولى لتثبيت بنية EBs. قد تؤثر حركة الصفائح أو أي تلاعب بالخلايا في المرحلة المبكرة على تكوين EBs. بالمقارنة مع الطريقتين الأخريين ، لم تغير الطريقة المعدلة الوسط في اليوم 1 وقللت أيضا من استخدام مثبطات الجزيئات الصغيرة في اليوم 15. باختصار ، يتم تبسيط خطوات تشغيل الطريقة المعدلة إلى حد ما ، ويتم توفير التكلفة التجريبية باستخدام أقل للوسائط والكواشف. ومع ذلك ، فإن الطريقة المعدلة لا تزال غير قادرة على حل المشاكل الشائعة لنظام الثقافة العضوية الحالي. بالإضافة إلى ذلك ، تعتمد كفاءة تحريض ROs إلى حد كبير على الجودة والقدرة على التمايز ل hPSCs. في هذه الدراسة ، تم حساب كفاءة توليد NR فقط باستخدام H9-ESC بالكامل. لقد نجحنا في تحفيز ROs في خطوط hPSCs المختلفة بالطريقة الجديدة في الدراسة الحالية ، وحققنا نفس كفاءة الحث ، بما في ذلك H9 و H1 و PBMC-iPSC. لا يوجد فرق إحصائي في كفاءة الحث بين خطوط الخلايا الثلاثة. في المستقبل ، تحتاج المزيد من الدراسات إلى استكشاف كفاءة الحث لمختلف hPSCs باستخدام هذه الطريقة.

في الختام ، فإن بروتوكول تحريض الشبكية الأمثل بسيط وغير مكلف ، وله قابلية عالية للتكرار والكفاءة ، ويقدم نماذج شخصية واعدة لأمراض الشبكية ، ويوفر مصدرا وفيرا للخلايا للعلاج بالخلايا ، وفحص الأدوية ، واختبار العلاج الجيني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن جميع المؤلفين أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgments

اي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.01 M TPBS Servicebio G0002 Washing slices
4% Paraformaldehyde Servicebio G1101-500ML Fix retinal organoids
5 mL Pasteur pipette NEST Biotechnology 318516 Pipette retinal organoids
96 V-bottomed conical wells Sumitomo Bakelit MS-9096VZ
Adhesion Microscope Slides CITOTEST 188105 Fix slices
AggreWell medium STEMCELL Technologies 5893 Medium
Anhydrous ethanol SINOPHARM 10009218 Dehydrate 
Anti-CHX10 Santa Cruz sc-365519 Primary antibody
Antifade Solution ZSGB-BIO ZLI-9556
Anti-KI67 Abcam ab16667 Primary antibody
Anti-NESTIN Sigma N5413 Primary antibody
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) Beyotime AT809 Primary antibody
Anti-PAX6 Abcam ab195045 Primary antibody
Cell dissociation solution(CDS) STEMCELL Technologies 7922 Cell dissociation
CHIR99021 Selleckchem S2924 GSK-3α/β inhibitor
Cholesterol Lipid Concentrate Gibco 12531018 250×
Citrate Antigen Retrieval Solution Servicebio G1202-250ML 20×, pH 6.0
CS10 STEMCELL Technologies 1001061 Cell Freezing Medium
DAPI Roche 10236276001 Nuclear counterstain
Dimethyl sulfoxide(DMSO) Sigma D2650
DMEM/F12 Gibco 11330032 Medium
DMEM/F12-GlutaMAX Gibco 10565018 Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 Invitrogen A32766 Secondary Antibody
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Invitrogen A10042 Secondary Antibody
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) Biosharp BL518A 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation
Extracellular matrix (ECM) Corning 354277 Coating plates
F12-Glutamax Gibco 31765035 Medium
Fetal Bovine Serum Gibco A5669701
Flow-like tissue cell quantitative analyzer TissueGnostics TissueFAXS Plus Scan sections
IMDM-GlutaMAX Gibco 31980030 Medium
IWR1-endo Selleckchem S7086 Wnt-inhibitor
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828028
LDN-193189 2HCl Selleckchem S7507 BMP-inhibitor
Low-adhesion 24-well Plates Corning 3473
Low-adhesion 6-well Plates Corning 3471
Maintenance medium (MM) STEMCELL Technologies 85850 Medium
N2 supplement Gibco 17502048
Normal Donkey Serum Solarbio SL050 Blocking buffer
Paraplast Leica 39601006 Tissue embedding
PBS pH 7.4 basic (1x) Gibco C10010500BT Without Ca+,Mg+
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) R&D 314-BP Key protein factor
Retinoic acid Sigma R2625 Powder, keep out of light
SB431542 Selleckchem S1067 ALK5-inhibitor
SU5402 Selleckchem S7667 Tyrosine kinase inhibitor
Super PAP Pen ZSGB-BIO ZLI-9305
Taurine Sigma T0625-10G
Thioglycerol Sigma M1753
Triton X-100 Sigma X100 Permeabilization
WA09 embryonic stem cell line WiCell Research Institute Cell line
Xylene SINOPHARM 10023418 Dewaxing
Y-27632 2HCL Selleckchem S1049 ROCK-inhibitor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoon, M., Okawa, H., Della Santina,, Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
  2. Steinmetz, J. D., et al. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
  3. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
  4. Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).
  5. Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).
  6. Peng, Y. R., et al. Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina. Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).
  7. Ribeiro, J., et al. Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors. Cell Rep. 35 (3), 109022 (2021).
  8. Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
  9. Manafi, N., et al. Organoids and organ chips in ophthalmology. Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).
  10. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).
  11. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  12. Kuwahara, A., et al. Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nat Commun. 6, 6286 (2015).
  13. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nat Commun. 5, 4047 (2014).
  14. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  15. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  16. Li, H., et al. Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids. FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).
  17. Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
  18. Mandai, M. Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review. Regen Ther. 22, 59-67 (2023).
  19. Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. 3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer. Cell Biosci. 12 (1), 39 (2022).
  20. Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 9, 640212 (2021).
  21. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
  22. Sanjurjo-Soriano, C., et al. RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478 (2022).
  23. Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation. Front Cell Neurosci. 15, 638439 (2021).
  24. Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
  25. Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
  26. Yamasaki, S., et al. Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture. Regen Ther. 19, 24-34 (2022).
  27. Döpper, H., et al. Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120 (2020).
  28. Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535 (2021).

Tags

علم الأحياء التنموي ، العدد 202 ،
توليد شبكية العين العصبية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, W., Li, H., Yan, H., Gao, L.,… More

Li, W., Li, H., Yan, H., Gao, L., Wang, X., Zhao, L., Yan, Y., Ye, Z., Xi, J., Yue, W., Li, Z. Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (202), e66246, doi:10.3791/66246 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter