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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Generación de retina neural a partir de células madre pluripotentes humanas

Published: December 22, 2023 doi: 10.3791/66246
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 2, 3, 3, 1,2, 2, 3, 3, 1,2
1Medical School of Chinese PLA, 2Senior Department of Ophthalmology, The Third Medical Center of Chinese PLA General Hospital, 3Stem Cell and Regenerative Medicine Lab, Beijing Institute of Radiation Medicine
* These authors contributed equally

Summary

El presente protocolo describe un sistema de inducción neuronal de retina 3D optimizado que reduce la adhesión y fusión de organoides retinianos con alta repetibilidad y eficiencia.

Abstract

La retinopatía es una de las principales causas de ceguera en todo el mundo. Investigar su patogenia es fundamental para el diagnóstico precoz y el tratamiento oportuno de la retinopatía. Desafortunadamente, las barreras éticas dificultan la recopilación de evidencia de los seres humanos. Recientemente, numerosos estudios han demostrado que las células madre pluripotentes humanas (PSC) se pueden diferenciar en organoides de la retina (RO) utilizando diferentes protocolos de inducción, que tienen un enorme potencial en la retinopatía para el modelado de enfermedades, el cribado de fármacos y las terapias basadas en células madre. En este estudio se describe un protocolo de inducción optimizado para generar retina neural (NR) que reduce significativamente la probabilidad de vesiculación y fusión, aumentando la tasa de éxito de la producción hasta el día 60. Basado en la capacidad de las PSC para autoreorganizarse después de la disociación, combinado con ciertos factores complementarios, este nuevo método puede impulsar específicamente la diferenciación de NR. Además, el enfoque es sencillo, rentable, exhibe una notable repetibilidad y eficiencia, presenta perspectivas alentadoras para modelos personalizados de enfermedades de la retina y proporciona un abundante reservorio celular para aplicaciones como la terapia celular, la detección de fármacos y las pruebas de terapia génica.

Introduction

El ojo sirve como la principal fuente de información entre los órganos sensoriales humanos, siendo la retina el principal tejido sensorial visualen los ojos de los mamíferos. La retinopatía se erige como una de las principales causas mundiales de enfermedades oculares, lo que conduce a la ceguera2. Aproximadamente 2,85 millones de personas en todo el mundo sufren diversos grados de discapacidad visual debido a la retinopatía3. En consecuencia, la investigación de su patogenia es crucial para el diagnóstico precoz y el tratamiento oportuno. La mayoría de los estudios sobre retinopatía humana se han centrado principalmente en modelos animales 4,5,6. Sin embargo, la retina humana es un tejido complejo y de múltiples capas que comprende varios tipos de células. Los sistemas tradicionales de cultivo celular bidimensional (2D) y los sistemas de modelos animales generalmente no logran recapitular fielmente el desarrollo espacio-temporal normal y el metabolismo de los fármacos de la retina humana nativa 7,8.

Recientemente, las técnicas de cultivo 3D han evolucionado para generar órganos similares a tejidos a partir de células madre pluripotentes (PSCs)9,10. Los organoides retinianos (RO) generados a partir de PSC humanas en un sistema de cultivo en suspensión 3D no solo contienen siete tipos de células retinianas, sino que también exhiben una estructura estratificada distinta similar a la retina humana in vivo 11,12,13. Las RO derivadas de PSC humanas han ganado popularidad y amplia disponibilidad y actualmente son los mejores modelos in vitro para estudiar el desarrollo y la enfermedad de la retina humana14,15. En las últimas décadas, numerosos investigadores han demostrado que las PSC humanas, incluidas las células madre embrionarias (ESC) y las células madre pluripotentes inducidas (iPSC), pueden diferenciarse en RO utilizando varios protocolos de inducción. Estos avances tienen un enorme potencial en la retinopatía para el modelado de enfermedades, la detección de fármacos y las terapias basadas en células madre 16,17,18.

Sin embargo, la generación de retina neural (NR) a partir de células madre pluripotentes humanas (PSC) es un proceso complejo, engorroso y que requiere mucho tiempo. Además, las variaciones de un lote a otro en los organoides tisulares pueden conducir a una menor reproducibilidad de los resultados19,20. Numerosos factores intrínsecos y extrínsecos pueden influir en el rendimiento de los organoides de la retina (RO), como el número o la especie de células de partida y el uso de factores de transcripción y compuestos de moléculas pequeñas 21,22,23. Desde que el laboratorio Sasaigeneró la primera ósmosis inversa humana 11, se han propuesto múltiples modificaciones a lo largo de los años para mejorar la facilidad y eficacia del proceso de inducción 13,21,24,25. Desafortunadamente, hasta la fecha, no se ha establecido un protocolo estándar de oro para la generación de ósmosis inversa en todos los laboratorios. De hecho, existe un cierto grado de discrepancia en las OR resultantes de los diferentes métodos de inducción, así como una amplia variación en la expresión de los marcadores retinianos y en la robustez de su estructura22,26. Estos problemas pueden complicar gravemente la recolección de muestras y la interpretación de los hallazgos del estudio. Por lo tanto, se necesita un protocolo de diferenciación más consolidado y robusto para maximizar la eficiencia con una heterogeneidad mínima de la generación de ósmosis inversa.

En este estudio se describe un protocolo de inducción optimizado basado en una combinación de Kuwahara et al.12 y Döpper et al.27 con instrucciones detalladas. El nuevo método reduce significativamente la probabilidad de vesiculación y fusión de organoides, lo que aumenta la tasa de éxito en la generación de NR. Este desarrollo es muy prometedor para el modelado de enfermedades, la detección de fármacos y las aplicaciones de terapia celular para trastornos de la retina.

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Protocol

Este estudio se realizó de acuerdo con los Principios de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética Institucional del Hospital General del EPL de China. La línea ESC WA09 (H9) se obtuvo del WiCell Research Institute.

1. Medios de cultivo y preparación de reactivos

  1. Medio de cultivo ESC humano y solución de paso
    1. Medio de mantenimiento (MM): Preparar 500 mL de MM completo (Medio Basal + 5x suplemento; ver Tabla de Materiales) de forma aséptica. Descongele 5 veces el suplemento a temperatura ambiente (RT) o durante la noche a 2-8 °C. Precalentar a RT. Revuelva bien antes de usar hasta que el suplemento esté libre de turbidez.
    2. Matriz extracelular (MEC) al 1%: Utilice una punta de pipeta preenfriada y tubos estériles para dispensar 200 μL de MEC (consulte la Tabla de materiales) por tubo en hielo. Guarde los tubos en un congelador a -20 °C. Derretir el ECM en hielo y diluir con DMEM/F12 preenfriado a 1:100.
    3. pH de 0,5 mM = 8,0 EDTA: Para preparar 500 ml de EDTA 0,5 mM, agregue 500 μL de EDTA 0,5 M y 0,9 g de NaCl a 500 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de 1x Dulbecco (ver Tabla de materiales). Mezclar bien y conservar a 2-8 °C.
  2. Medio de diferenciación retiniana
    1. Medio químicamente definido libre de factor de crecimiento (gfCDM): Prepare el gfCDM combinando un 45 % del medio GlutaMAX de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM-GlutaMAX), un 45 % de F12-GlutaMAX de Ham (F12-Glutamax), un 10 % de reemplazo sérico knockout (KSR), un 1 % de concentrado de lípidos de colesterol y 450 μM de tioglicerol (consulte la tabla de materiales).
  3. Compuestos de moléculas pequeñas
    1. Y-27632 2HCl: Añadir 50 mg de polvo de Y-27632 a 3,122 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). Dispensar y almacenar Y-27632 (ver Tabla de Materiales) a una concentración de 50 mM a -80 °C durante 2 años, manteniéndolo alejado de la luz. Diluir el stock 2.500 veces (20 μM) para su uso, equivalente a 0,4 μL de Y-27632 por mL de gfCDM.
    2. IWR1-endo: Añadir 2,4424 mL de DMSO para disolver 10 mg de IWR1-endo (ver Tabla de Materiales) para obtener una solución madre de 10 mM. Dispensar alícuotas y almacenarlas a -80 °C durante un máximo de 2 años. Añadir 0,3 μL de 10 mM de IWR1-endo por mL de gfCDM para la concentración de 3 μM para la inducción.
    3. SB431542: Para preparar 50 mM SB431542, agregue 10 mg de SB431542 (ver Tabla de Materiales) a 0.5203 mL de DMSO y mezcle bien. Conservar a -80 °C en disolvente durante un máximo de 2 años. Para la preparación de SB431542 a una concentración de trabajo de 10 μM, añadir 2 μL de la solución madre de 50 mM a 10 mL de gfCDM.
    4. LDN-193189 2HCl: Disuelva 5 mg de LDN-193189 2HCl (consulte la Tabla de materiales) en 10,4297 ml de DMSO para obtener 1 mM de solución madre. Conservar a -20 °C o -80 °C (según lo recomendado por el fabricante). Agregue 0,1 μL de stock a cada 10 mL de gfCDM, lo que da como resultado 100 nM de LDN-193189 para la inducción.
    5. Proteína morfogenética ósea humana recombinante 4 (BMP4): Se reconstituye a 50-200 μg/mL en HCl de 4 mM (ver Tabla de Materiales). Conservar entre 2 °C y 8 °C durante 1 mes o -20 °C durante 1 año después de la reconstitución. Realice la inducción de NR utilizando BMP4 de 1,5 nM.
  4. Medio de cultivo NR a largo plazo
    1. Ácido retinoico (AR): Mida 6 mg de polvo de AR (consulte la Tabla de materiales) y agréguelo a 3,9941 ml de DMSO. Conservar en alícuotas de 5 mM a -80 °C y utilizar en un plazo de 3 meses. Para lograr una concentración de trabajo de 0,5 μM, agregue 10 μL de la mezcla maestra a 100 mL de medio de diferenciación de retina neural (NRDM). Agregue justo antes de usar.
      NOTA: Mantener alejado de la luz durante la preparación y el almacenamiento.
    2. Taurina: Añadir taurina en polvo (ver Tabla de Materiales) con un peso de 200 mg a 7,9904 mL de DMSO para obtener una solución madre de 200 mM. Dispensar y conservar a 2-8 °C. Se consigue una concentración de trabajo de 0,1 mM de taurina añadiendo 50 μL de la solución madre por cada 100 mL de NRDM.
    3. NRDM: Componga NRDM con medio DMEM/F12-GlutaMAX, suplemento de N2 al 1%, suero bovino fetal al 10%, AR 0,5 mM y taurina 0,1 mM (ver Tabla de Materiales). Almacenar a 2-8 °C durante un máximo de 2 semanas o 6 meses a -20 °C para garantizar la actividad de los componentes.
  5. Tampón de bloqueo: Diluir 1:9 con DPBS para obtener una solución de trabajo al 10% para su uso (ver Tabla de Materiales). Conservar a -20 °C durante un máximo de 5 años.
    NOTA: Realice todos los demás procedimientos en una cabina de bioseguridad de Clase II para garantizar la esterilidad, excepto el pesaje. Si es necesario añadir reactivos pesados durante el proceso de preparación, utilice filtros de 0,22 μm para la filtración.

2. Cultivo de H9-ESCs

  1. Descongelación de H9-ESC
    1. Agregue 1 ml de ECM al 1% a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Incubar durante 1 h en una incubadora a 37 °C en una atmósfera con 5% deCO2 .
      NOTA: Evite la adición de ECM a lo largo de las paredes del pocillo, ya que puede adherirse a la superficie.
    2. Tome una culata criovial H9-ESC del tanque de nitrógeno líquido y agítela rápidamente en agua a 37 °C durante 30 s.
      NOTA: No permita que el vial se descongele por completo.
    3. Retire el vial y esterilícelo cuidadosamente con alcohol desinfectante en aerosol al 75%. Añadir el H9-ESC descongelado de la criovial a un tubo de 15 mL que contenga 9 mL MM con 10 μM de Y-27632.
    4. Centrifugar el tubo a 190 × g durante 5 min a RT. Retire con cuidado la mayor parte del sobrenadante con una pipeta de 1 ml, dejando aproximadamente 50 μl de sobrenadante para evitar la pérdida celular.
    5. Agregue 1 mL de MM que contenga 10 μM de Y27632 al sedimento celular y vuelva a suspender suavemente el sedimento celular con una pipeta de 1 mL pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5-10 veces.
    6. Retire el recubrimiento de ECM después de 1 h de incubación. Agregue 2 mL de MM precalentado que contenga 10 μM Y-27632 a cada pocillo.
    7. Dispensar 0,5 ml de suspensión celular por pocillo. Agite suavemente la placa lateralmente para asegurar una distribución uniforme de las células.
    8. Incubar la placa a 37 °C bajo un 5% deCO2 durante al menos 24 h sin tocarla.
    9. Cambia el medio diariamente. Cuando la densidad de clones alcanza el 70% o más, se requiere un pase.
  2. Aprobación de H9-ESC
    1. Prepare la placa recubierta de ECM como se describe anteriormente (paso 2.1.1) y agregue 2 ml de MM por pocillo.
    2. Retire el medio gastado de las placas de 6 pocillos. Lave cada pocillo dos veces con 1 ml de DPBS.
    3. Lave cada pocillo dos veces agregando lentamente 1 ml de EDTA e incubando con 1 ml de EDTA durante 4-7 minutos a RT.
      NOTA: Durante la incubación, examine la placa de 6 pocillos durante 3 minutos bajo un microscopio. Continúe inmediatamente con el siguiente paso si la mayoría de las células están a punto de desprenderse de la placa. Evite la incubación prolongada para reducir el impacto negativo en las células.
    4. Deseche el EDTA y agregue 1 mL de MM para abortar la digestión.
    5. Golpee suavemente la placa del pocillo hasta que la mayoría de las células se desprendan.
    6. Transfiera con cuidado la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 ml con una pipeta de 5 ml. Vuelva a suspender suavemente las colonias H9-ESC hacia arriba y hacia abajo de 3 a 5 veces para mezclarlas con una pitette Pasteur. Transfiera 20-100 μL de suspensión celular en una nueva placa de cultivo de 6 pocillos recubierta de ECM y agítela hacia adelante y hacia atrás.
    7. Cuando se observe que la densidad celular es suficiente bajo un microscopio, incubar la placa a 37 °C bajo 5% de CO2 durante al menos 24 h sin tocarla.
    8. Cambia los medios de comunicación a diario. Con una densidad de clones del 70% o más, se requiere el paso.

3. Generación de NR humanos

NOTA: Una vez que las colonias alcanzan aproximadamente el 70% de confluencia, se pueden dirigir hacia la diferenciación en organoides retinianos (RO) utilizando los pasos del procedimiento descritos en la Figura 1.

  1. Día 0 - Formación del cuerpo embrioide (EB)
    1. Después de lavar las celdas con 2 mL de DPBS, agregue 0.5 mL de CDS (ver Tabla de Materiales) que contiene 20 μM Y27632 al pocillo. Incubar durante 3 min a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 .
      NOTA: Verifique bajo un microscopio. Reducir al máximo el tiempo de incubación para evitar efectos nocivos sobre las células.
    2. Abortar la digestión añadiendo 3 mL de MM que contenga 20 μM Y27632. Centrifugar a 190 × g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
    3. Vuelva a suspender el gránulo celular en 1 ml de gfCDM que contenga 20 μM Y27632 y cuente las células. Agregue el volumen correspondiente para 1,2 × 106 celdas (1,2 × 104 celdas por pocillo) a 10 mL de gfCDM, que está preincorporado con 20 μM Y-27632, 3 μM IWR1-endo, 10 μM SB431542 y 100 nM LDN-193189 (ver Tabla de Materiales).
    4. Agregue 100 μL de suspensión celular a cada pocillo de 96 pocillos cónicos con fondo en V. Coloque la placa en una incubadora humidificada con 5% de CO2 hasta el día 6.
      NOTA: No mueva los platos durante al menos 24 h para mejorar la adherencia de los EB.
  2. Día 6 - Inducción de retina
    1. En el día 6, agregue 10 mL de gfCDM que contenga 55 ng/mL de BMP4 para permitir un cambio completo del medio de cultivo en los EB. Regrese la placa a la incubadora.
      NOTA: Pipetee hacia las paredes del pocillo cónico de fondo en V de 96 para evitar burbujas de aire. Evite tomar organoides al cambiar el medio.
    2. Realizar cambio medio-medio el día 9, el día 12 y el día 15. Reemplace la mitad del medio con gfCDM fresco para diluir gradualmente el BMP4.
  3. Día 18 - Cultura NR a largo plazo
    1. El día 18, transfiera cuidadosamente los EB formados a tubos de centrífuga de 15 ml con pipetas Pasteur de 5 ml y enjuague suavemente de nuevo con NRDM. Transfiera los EB a placas de 6 o 24 pocillos de baja adsorción (consulte la Tabla de materiales). Regrese la placa a la incubadora.
    2. Reemplace el medio con NRDM nuevo cada 3 días.
      NOTA: Apague la luz durante el cambio de medio porque el RA es sensible a la luz. Retire los organoides mal diferenciados y separe los organoides adherentes bajo un microscopio.

4. Análisis de las NR humanas

  1. Montaje de las ósmosis inversa
    1. Seleccione diferentes generaciones de H9-ESC para inducir tres lotes de RO.
      NOTA: Para evaluar la tasa de éxito de la inducción, se calculan tres placas del número de NR formadoras para cada uno de los tres métodos evaluados (Kuwahara et al.12, Döpper et al.27 y el método modificado en el presente estudio). La inducción se considera exitosa si la microscopía óptica revela la formación de estructuras similares a neuroepiteliales en el día 30.
  2. Tinción inmunofluorescente de RO
    1. Transfiera de 3 a 5 ósmosis inversas a tubos de 1,5 ml. Pipetear el exceso de medio y lavar los RO una vez con 1 ml de DPBS a RT. Deje que los RO se hundan y retire con cuidado los DPBS. Añadir 1 mL de paraformaldehído al 4% (ver Tabla de Materiales) por tubo de 1,5 mL y fijar a 4 °C.
      NOTA: ROs en el día 6 y el día 18, fijar 2 h. Fijar a las 12 h del día 30 y a las 14 h del día 60.
    2. Después de la fijación, deshidratar con alcohol de gradiente. Deje reposar las RO durante 15 minutos cada una con alcohol al 50%, 60% y 70%, y posteriormente durante 10 minutos cada una con alcohol al 80%, 90%, 95%, 100% y 100%. Luego, agregue una mezcla 1:1 de 100% de alcohol y xileno durante 10 minutos, seguido de xileno dos veces durante 10 minutos cada una.
    3. Coloque las ósmosis inversa en moldes de metal llenos de paraplast derretido (consulte la Tabla de materiales) durante 40 minutos y luego enfríe los moldes con hielo para fijar las ósmosis inversa. Coloque las cajas de inclusión en los moldes y congélelos a -20 °C durante la noche. A continuación, separe con cuidado los cuadros de incrustación. Por último, guárdalos en RT.
    4. Cree secciones continuas (5 μm de grosor) con una cortadora de parafina. Fije las rodajas en portaobjetos de microscopio de adhesión, séquelas y guárdelas en RT.
    5. Realizar desparafinado y rehidratación antes de la reparación del antígeno12,27.
    6. Agregue 10 ml de solución de recuperación de antígeno de citrato de pH 6.0 20x (consulte la tabla de materiales) a 190 ml de ddH2O (H2O doblemente destilado). Calentar en el microondas a temperatura alta durante 4 minutos hasta que hierva. Después de agregar las secciones de parafina, caliente las secciones en modo bajo durante 20 minutos para completar la reparación del antígeno.
    7. Deje que las secciones de parafina se enfríen naturalmente en un área ventilada y luego colóquelas en una cámara húmeda.
    8. Use un bolígrafo de papanicolaou (consulte la Tabla de materiales) para delinear las secciones. Incubar con Triton X-100 al 0,2% en RT durante 30 minutos para romper las membranas, seguido de lavar los portaobjetos tres veces con TPBS, durante 5 minutos cada uno.
    9. Bloquear con suero de burro al 10% diluido en DPBS a RT durante 1 h en cámara húmeda con 10 μL por área de tinción.
    10. Añadir anticuerpos primarios diluidos en suero de burro al 10%. Incubar durante la noche a 4 °C en una cámara de humedad. Lave las muestras tres veces con TPBS durante 10 minutos cada una para eliminar el anticuerpo no unido.
      NOTA: Los anticuerpos primarios son los siguientes: anti-PAX6 (1:250), anti-SOX2 (1:200), anti-KI67 (1:200), anti-CHX10 (1:200), anti-β tubulina III (1:250) y anti-NESTIN (1:200) (ver Tabla de Materiales).
    11. Incubar con anticuerpos secundarios diluidos en DPBS durante 1 h a RT en una cámara humidificada. Repita el paso de lavado con TPBS tres veces durante 10 minutos cada una.
      NOTA: Manténgalo en la oscuridad para evitar que se apague el anticuerpo secundario fluorescente. Los anticuerpos secundarios son Alexa Fluor 488 conjugado con IgG anti-ratón de burro y Alexa Fluor 568 conjugado con IgG anti-conejo de burro a una dilución de 1:400 (ver Tabla de Materiales).
    12. Incubar con DPBS que contengan DAPI (1: 500; ver Tabla de Materiales) durante 10 min a RT en la oscuridad. Lavar tres veces con TPBS durante 10 minutos cada una.
    13. Coloque una cantidad adecuada de sellador antifluorescente (consulte la Tabla de materiales) en el portaobjetos y cúbralo con cubreobjetos.
    14. Visualice utilizando un analizador cuantitativo de células tisulares de flujo (consulte la Tabla de materiales) o similar.
    15. Almacene los portaobjetos a -20 °C en la oscuridad después del análisis microscópico.

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Representative Results

En la Figura 1 se muestra una descripción gráfica del protocolo modificado. Las H9-ESC se utilizaron para generar RO cuando las células crecieron a una densidad del 70%-80%. Las suspensiones de una sola célula de H9-ESC en 96 pozos cónicos con fondo en V se agregaron el día 1 y formaron EB redondos bien circunscritos en el día 6. A medida que aumentaba el tiempo de cultivo, el volumen de EB aumentaba gradualmente. En el día 30, las estructuras de tipo neuroepitelial se formaron claramente y se engrosaron durante la diferenciación NR a largo plazo.

Además, el método modificado se comparó con otros dos métodos (Kuwahara et al.12 y Döpper et al.27) para evaluar su repetibilidad y eficiencia (Figura suplementaria 1). En este estudio también se observó que la morfología de los EB en el día 1 siguiendo el método modificado fue ligeramente peor que en los otros dos métodos. Sin embargo, las estructuras neuroepiteliales que se formaron con el método modificado fueron más continuas en el día 18 (Figura 2). En el día 30, los primeros NR obtenidos con el método modificado eran similares en forma y tamaño y mostraban una forma redonda regular (Figura 3). En comparación con los otros dos métodos, los NR formados por el método modificado tuvieron una menor incidencia de vesiculación y adhesión. Además, con base en las H9-ESC, la tasa de éxito de la generación de NR utilizando el método modificado aumentó a 87,39% desde el 26,9% y 69,24% para los métodos de Kuwahara et al. y Döpper et al.12,27, respectivamente (Figura 3M).

La tinción por inmunofluorescencia se realizó en secciones de los NR incluidas en parafina para evaluar la expresión de marcadores relacionados con el desarrollo de la retina (Figura 4). Los resultados mostraron la expresión de genes humanos asociados a la retina en NRs derivadas de H9-ESCs utilizando un método modificado. El primer subtipo celular en aparecer es el de las células ganglionares de la retina, que se acumula principalmente en la cara basal de las NR. La tinción TUJ1 se utilizó para identificar los axones de las células ganglionares de la retina (Figura 4I-L). Además, se detectaron marcadores de células progenitoras de la retina tanto en la capa interna (PAX6+) como en la externa (CHX10+) (Figura 4A-H). Las células positivas para el marcador de proliferación KI67 se distribuyeron en la capa externa (Figura 4A-D).

Figure 1
Figura 1: Resumen esquemático. La descripción esquemática del protocolo de cultivo modificado muestra la adición de diferentes factores en puntos de tiempo específicos y las imágenes representativas del desarrollo de la retina neural. SFEBq: cultivo flotante sin suero de agregados embrioides similares a cuerpos con rápida reagregación; KSR: reemplazo de suero knockout; gfCDM: medio químicamente definido libre de factores de crecimiento; NRDM: medio de diferenciación de la retina neural; BMP4: proteína morfogenética ósea 4. Barras de escala: 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Imágenes representativas de campo claro de organoides retinianos derivadas de tres protocolos diferentes en la etapa inicial. En el día 1, solo el método modificado no lo hizo de los EB (A,E,I). En el día 6, se formaron EB en los tres métodos (B, F, J). El día 18 se formaron las retinas neurales tempranas y se encontró una morfología diferente entre los tres métodos de inducción (C,G,K). El día 21, la retina neural generada por el método modificado mostró una estructura neuroepitelial continua (D,H,L). Barras de escala: 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Retina neural 3D madura en cultivo en suspensión a los días 30, 45, 60. En el día 30, la retina neural se formó en los tres métodos (A, E, I). Las flechas indican estructuras quísticas en el método de Kuwahara et al. (B). Las cajas punteadas blancas representan la región de adhesión y fusión de organoides entre sí (D, F, H). Los organoides retinianos generados a partir del protocolo modificado son similares en tamaño y morfología en comparación con los otros dos métodos (C,G,J,K,L). Barras de escala: 100 μm (blanco); 200 μm (negro). Gráfico estadístico de la tasa de éxito de la inducción por los tres métodos utilizando H9-ESCs (M). Se utilizó un análisis de varianza unidireccional para probar la significancia (las barras de error muestran el error estándar, n = 864, **P < 0,01, ***P < 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Caracterización de la retina neural en el protocolo modificado. Imágenes inmunotincionadas de retina neural en el día 6, día 18, día 30 y día 60. Las tinciones verdes son para KI67 (célula proliferante), PAX6 (célula progenitora de la retina) y NESTIN (célula madre neural). Las tinciones rojas son para CHX10 (célula progenitora de la retina), SOX2 (célula progenitora neural) y TUJ1 (célula ganglionar de la retina). Barras de escala: 100 μm (A, B, E, F, I, J); 200 μm (C,D,G,H,K,L). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Comparación de los diagramas de flujo de los tres protocolos de inducción de organoides retinianos. SFEBq: cultivo flotante sin suero de agregados embrioides similares a cuerpos con rápida reagregación; KSR: reemplazo de suero knockout; gfCDM: medio químicamente definido libre de factores de crecimiento; NRDM: medio de diferenciación de la retina neural; BMP4: proteína morfogenética ósea 4. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Morfología del cuerpo embrioide (EB) inducida por el método de Kuwaharaet al. La aparición gradual de grupos de células muertas se observó alrededor de los EB después de la adición de BMP4 en el día 6 (A-D, flechas negras). Se observaron grandes diferencias morfológicas, después del día 6 (E-L), e incluso algunos EB estaban completamente inactivados (H,L). ESC: célula madre embrionaria, PBMC: célula mononuclear de sangre periférica, IPSC: célula madre pluripotente inducida. Barras de escala: 200 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Las OR humanas pueden recapitular espacial y temporalmente el desarrollo de la retina fetal, y las OR tempranas exhiben un alto grado de similitud con la retina fetal en etapas equivalentes de desarrollo15. En términos de morfología tisular y expresión molecular, la ósmosis inversa humana refleja de cerca el estado de crecimiento real del tejido de la retina, lo que brinda oportunidades enormes y sin precedentes en los campos del modelado de enfermedades, la detección de medicamentos y la medicina regenerativa. En la actualidad, se han establecido varios métodos diferentes para generar RO a partir de PSC humanas in vitro, y se están llevando a cabo continuas modificaciones y optimizaciones para mejorar aún más la eficiencia9. El laboratorio Sasai informó por primera vez de la generación de RO derivadas de PSC a partir de ESC humanas11. Las ESC humanas se prepararon primero en suspensiones unicelulares, y luego se sembraron un número igual de células en 96 pocillos cónicos con fondo en V, con una rápida agregación para formar EB circulares. La adición externa de vías clave de señalización celular promovió la formación de vesículas ópticas en EB, que posteriormente maduraron en RO laminadas en cultivo en suspensión. El NR contiene un tipo de célula glial y seis tipos de células neuronales diferentes, que representan muchos aspectos del desarrollo de la retina, como la morfogénesis celular, la diferenciación neuronal y la polaridad apical-basal9. Aunque solo el 10% de los agregados formaban una estructura de copa óptica de doble pared, este fue un hito importante en la evolución de la producción de ósmosisinversa más avanzadas.

Posteriormente, Zhong et al. introdujeron una nueva alternativa, en la que las hiPSC se cultivaron primero cerca de las confluencias, seguidas de la desintegración química o mecánica en pequeños agregados flotantes13. Luego, los pequeños agregados formaron EB en cultivo en suspensión, que se separaron por separado de la parte inferior de la placa, diferenciándose aún más en la dirección neuronal. Zhong et al. demostraron una retina 3D completamente laminada con segmentos externos fotorreceptores relativamente bien desarrollados que respondían a la estimulación de la luz. Este método requirió una menor regulación externa de las vías de señalización celular y se realizó principalmente de manera autodirigida9. La tercera revolución tecnológica fue la introducción del método de incrustación por parte del grupo Lowe25. Esto implicó la inclusión de agregados de hESC en ECM para formar una estructura epitelial de un solo lumen. Después de la dispersión enzimática, los agregados se mantuvieron en un cultivo en suspensión para formar ósmosis inversa maduras. Aunque los tres métodos pueden inducir con éxito ósmosis inversa con una estructura y función comparables, las aplicaciones a gran escala tienen la desventaja de ser lentas y laboriosas debido a su alta heterogeneidad y baja tasa de éxito23.

Además de los métodos anteriores, Kuwahara et al. propusieron un nuevo método de inducción, a saber, el método de disminución del gradiente de factor clave12. Descubrieron que la NR podía generarse mediante la adición de BMP4 a una concentración decreciente a partir del día 6. Este sistema de inducción utilizó menos factores externos para formar ósmosis inversa con mayor uniformidad de tamaño y morfología. Sin embargo, estudios han reportado que los EB formados eran propensos a lesiones quísticas, y la tasa de éxito de la inducción de este método fue de aproximadamente el 40%12,28. Döpper et al. modificaron este protocolo para mejorar la tasa de éxito mediante la combinación de un medio comercial con tres inhibidores de moléculas pequeñas en la etapa temprana de la inducción para estabilizar los EBs27. Por el contrario, las células del epitelio neural de la retina se adhieren más fácilmente entre sí, lo que requiere un cultivo separado de cada RO durante el cultivo en suspensión a largo plazo. El método de Döpper et al. aumenta las complicaciones y los costos de las operaciones experimentales y no es adecuado para la inducción a gran escala27. El protocolo de producción de ósmosis inversa optimizado mejoró la eficiencia de la inducción. El método modificado actual se comparó con los métodos de Kuwahara et al. y Döpper et al.

Este estudio mostró que tanto el método de Kuwahara et al. como el de Döpper et al. formaron EBs con bordes lisos en el día 1, mientras que el método modificado actual requirió un tiempo relativamente largo para formar EBs, aproximadamente hasta el día 6. El volumen de los EB obtenidos con el método de Kuwahara et al. fue mayor que el obtenido con el método de Döpper et al., y los EB obtenidos con el método de Döpper et al. mostraron una mayor fluidez bajo flujo de líquido. En particular, los grupos de células muertas aparecieron gradualmente alrededor de los EB después de la adición de BMP4 en el día 6 cuando se utilizó el método de Kuwahara et al. (Figura suplementaria 2). Para el día 18, se observaron diferencias morfológicas significativas en los EB del método de Kuwahara et al., y algunos EB estaban completamente inactivados (Figura suplementaria 2). En el método de Döpper et al., la mayoría de las EB eran redondeadas y bien circunscritas, y exhibían solo un pequeño número de células muertas dispersas a su alrededor. El método modificado formó EB apretados y bien estructurados con ligeras diferencias morfológicas, y se observaron algunas células muertas a su alrededor.

Además, este estudio también encontró que algunos EB generaron vesículas por Kuwahara et al. en la etapa inicial después de la transferencia a placas de 6 pocillos, lo que resultó en una falla en la formación de RO. La adhesión y fusión de las RO ocurrió alrededor del día 40, lo que disminuyó significativamente la utilidad de los experimentos. El sistema de cultivo del método de Döpper et al. es más complicado y requiere más pasos operativos y un costo más alto que el método de Kuwahara et al. La mayoría de las RO de Döpper et al. también desarrollaron inevitablemente adherencias y fusiones entre sí. El método modificado en este estudio generó con éxito NR 3D in vitro que expresaron los marcadores relacionados con la retina humana CHX10, KI67, PAX6, SOX2, TUJ1 y NESTIN. Y la mayoría de las RO por el método modificado fueron consistentes en tamaño y morfología, y muy pocas vesículas o adherencias se desarrollaron durante las últimas etapas de la diferenciación retiniana.

En comparación con los otros dos métodos, el nuevo sistema de cultivo tenía pasos operativos más simples y costos más bajos. El paso crítico en el método modificado es agregar tres inhibidores de moléculas pequeñas en el medio y asegurarse de que la placa no se mueva durante los primeros seis días para estabilizar la estructura de los EB. El movimiento de las placas o cualquier manipulación celular en la etapa temprana puede afectar la formación de EB. En comparación con los otros dos métodos, el método modificado no cambió el medio en el día 1 y también redujo el uso de inhibidores de moléculas pequeñas en el día 15. En resumen, los pasos de operación del método modificado se simplifican hasta cierto punto, y el costo experimental se ahorra con un menor uso de medios y reactivos. Sin embargo, el método modificado aún no puede resolver los problemas comunes del sistema actual de cultivo de organoides. Además, la eficiencia de inducción de ósmosis inversa depende en gran medida de la calidad y la capacidad de diferenciación de las hPSC. En este estudio, solo se calculó completamente la eficiencia de la generación de NR utilizando H9-ESC. Inducimos con éxito ROs en diferentes líneas de hPSCs con el nuevo método en el presente estudio, y logramos la misma eficiencia de inducción, incluyendo H9, H1 y PBMC-iPSC. No hay diferencia estadística en la eficiencia de inducción entre las tres líneas celulares. En el futuro, es necesario que más estudios exploren la eficiencia de inducción de diferentes hPSC utilizando este método.

En conclusión, el protocolo optimizado de inducción de la retina es simple y económico, tiene una alta repetibilidad y eficiencia, ofrece modelos personalizados prometedores de enfermedades de la retina y proporciona una fuente celular abundante para la terapia celular, la detección de medicamentos y las pruebas de terapia génica.

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Disclosures

Todos los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Acknowledgments

Ninguno.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.01 M TPBS Servicebio G0002 Washing slices
4% Paraformaldehyde Servicebio G1101-500ML Fix retinal organoids
5 mL Pasteur pipette NEST Biotechnology 318516 Pipette retinal organoids
96 V-bottomed conical wells Sumitomo Bakelit MS-9096VZ
Adhesion Microscope Slides CITOTEST 188105 Fix slices
AggreWell medium STEMCELL Technologies 5893 Medium
Anhydrous ethanol SINOPHARM 10009218 Dehydrate 
Anti-CHX10 Santa Cruz sc-365519 Primary antibody
Antifade Solution ZSGB-BIO ZLI-9556
Anti-KI67 Abcam ab16667 Primary antibody
Anti-NESTIN Sigma N5413 Primary antibody
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) Beyotime AT809 Primary antibody
Anti-PAX6 Abcam ab195045 Primary antibody
Cell dissociation solution(CDS) STEMCELL Technologies 7922 Cell dissociation
CHIR99021 Selleckchem S2924 GSK-3α/β inhibitor
Cholesterol Lipid Concentrate Gibco 12531018 250×
Citrate Antigen Retrieval Solution Servicebio G1202-250ML 20×, pH 6.0
CS10 STEMCELL Technologies 1001061 Cell Freezing Medium
DAPI Roche 10236276001 Nuclear counterstain
Dimethyl sulfoxide(DMSO) Sigma D2650
DMEM/F12 Gibco 11330032 Medium
DMEM/F12-GlutaMAX Gibco 10565018 Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 Invitrogen A32766 Secondary Antibody
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Invitrogen A10042 Secondary Antibody
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) Biosharp BL518A 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation
Extracellular matrix (ECM) Corning 354277 Coating plates
F12-Glutamax Gibco 31765035 Medium
Fetal Bovine Serum Gibco A5669701
Flow-like tissue cell quantitative analyzer TissueGnostics TissueFAXS Plus Scan sections
IMDM-GlutaMAX Gibco 31980030 Medium
IWR1-endo Selleckchem S7086 Wnt-inhibitor
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828028
LDN-193189 2HCl Selleckchem S7507 BMP-inhibitor
Low-adhesion 24-well Plates Corning 3473
Low-adhesion 6-well Plates Corning 3471
Maintenance medium (MM) STEMCELL Technologies 85850 Medium
N2 supplement Gibco 17502048
Normal Donkey Serum Solarbio SL050 Blocking buffer
Paraplast Leica 39601006 Tissue embedding
PBS pH 7.4 basic (1x) Gibco C10010500BT Without Ca+,Mg+
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) R&D 314-BP Key protein factor
Retinoic acid Sigma R2625 Powder, keep out of light
SB431542 Selleckchem S1067 ALK5-inhibitor
SU5402 Selleckchem S7667 Tyrosine kinase inhibitor
Super PAP Pen ZSGB-BIO ZLI-9305
Taurine Sigma T0625-10G
Thioglycerol Sigma M1753
Triton X-100 Sigma X100 Permeabilization
WA09 embryonic stem cell line WiCell Research Institute Cell line
Xylene SINOPHARM 10023418 Dewaxing
Y-27632 2HCL Selleckchem S1049 ROCK-inhibitor

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Biología del Desarrollo Número 202
Generación de retina neural a partir de células madre pluripotentes humanas
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