Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Erzeugung neuronaler Netzhaut aus humanen pluripotenten Stammzellen

Published: December 22, 2023 doi: 10.3791/66246
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 2, 3, 3, 1,2, 2, 3, 3, 1,2
1Medical School of Chinese PLA, 2Senior Department of Ophthalmology, The Third Medical Center of Chinese PLA General Hospital, 3Stem Cell and Regenerative Medicine Lab, Beijing Institute of Radiation Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein optimiertes 3D-System zur Induktion neuronaler Netzhaut, das die Adhäsion und Fusion von Netzhautorganoiden mit hoher Wiederholbarkeit und Effizienz reduziert.

Abstract

Die Retinopathie ist weltweit eine der Hauptursachen für Erblindung. Die Untersuchung seiner Pathogenese ist für die frühzeitige Diagnose und rechtzeitige Behandlung der Retinopathie unerlässlich. Leider behindern ethische Barrieren das Sammeln von Beweisen von Menschen. In jüngster Zeit haben zahlreiche Studien gezeigt, dass humane pluripotente Stammzellen (PSCs) unter Verwendung verschiedener Induktionsprotokolle in retinale Organoide (ROs) differenziert werden können, die in der Retinopathie ein enormes Potenzial für die Krankheitsmodellierung, das Wirkstoffscreening und stammzellbasierte Therapien haben. Diese Studie beschreibt ein optimiertes Induktionsprotokoll zur Erzeugung einer neuralen Netzhaut (NR), das die Wahrscheinlichkeit von Vesikulation und Fusion signifikant reduziert und die Erfolgsrate der Produktion bis zum 60. Tag erhöht. Basierend auf der Fähigkeit von PSCs, sich nach der Dissoziation selbst zu reorganisieren, kombiniert mit bestimmten komplementären Faktoren, kann diese neue Methode die NR-Differenzierung spezifisch vorantreiben. Darüber hinaus ist der Ansatz unkompliziert, kostengünstig, weist eine bemerkenswerte Wiederholbarkeit und Effizienz auf, bietet ermutigende Aussichten für personalisierte Modelle von Netzhauterkrankungen und bietet ein reichliches Zellreservoir für Anwendungen wie Zelltherapie, Wirkstoffscreening und Gentherapietests.

Introduction

Das Auge dient als primäre Informationsquelle unter den menschlichen Sinnesorganen, wobei die Netzhaut das wichtigste visuelle Sinnesgewebe in Säugetieraugen ist1. Retinopathie ist eine der wichtigsten globalen Ursachen für Augenkrankheiten, die zur Erblindung führen2. Weltweit leiden etwa 2,85 Millionen Menschen an unterschiedlich starken Sehstörungen aufgrund einer Retinopathie3. Daher ist die Untersuchung seiner Pathogenese entscheidend für eine frühzeitige Diagnose und rechtzeitige Behandlung. Die meisten Studien zur menschlichen Retinopathie haben sich hauptsächlich auf Tiermodelle konzentriert 4,5,6. Die menschliche Netzhaut ist jedoch ein komplexes, vielschichtiges Gewebe, das aus verschiedenen Zelltypen besteht. Herkömmliche zweidimensionale (2D) Zellkultur- und Tiermodellsysteme sind in der Regel nicht in der Lage, die normale räumlich-zeitliche Entwicklung und den Arzneimittelstoffwechsel der nativen menschlichen Netzhaut originalgetreu zu rekapitulieren 7,8.

In jüngster Zeit haben sich 3D-Kulturtechniken entwickelt, um gewebeähnliche Organe aus pluripotenten Stammzellen (PSCs) zu erzeugen9,10. Retinale Organoide (ROs), die aus menschlichen PSCs in einem 3D-Suspensionskultursystem erzeugt werden, enthalten nicht nur sieben retinale Zelltypen, sondern weisen auch eine ausgeprägte geschichtete Struktur auf, die der menschlichen Netzhaut in vivo ähnelt 11,12,13. Humane PSC-abgeleitete ROs haben an Popularität und weit verbreiteter Verfügbarkeit gewonnen und sind derzeit die besten In-vitro-Modelle zur Untersuchung der Entwicklung und Erkrankung der menschlichen Netzhaut14,15. In den letzten Jahrzehnten haben zahlreiche Forscher gezeigt, dass sich menschliche PSCs, einschließlich embryonaler Stammzellen (ESCs) und induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs), mithilfe verschiedener Induktionsprotokolle in ROs differenzieren können. Diese Fortschritte bergen ein enormes Potenzial in der Retinopathie für die Krankheitsmodellierung, das Wirkstoffscreening und stammzellbasierte Therapien 16,17,18.

Die Erzeugung von neuronaler Netzhaut (NR) aus humanen pluripotenten Stammzellen (PSCs) ist jedoch ein komplexer, umständlicher und zeitaufwändiger Prozess. Darüber hinaus können Variationen von Charge zu Charge bei Gewebeorganoiden zu einer geringeren Reproduzierbarkeit der Ergebnisse führen 19,20. Zahlreiche intrinsische und extrinsische Faktoren können die Ausbeute an retinalen Organoiden (ROs) beeinflussen, wie z. B. die Anzahl oder Spezies der Ausgangszellen und die Verwendung von Transkriptionsfaktoren und niedermolekularen Verbindungen 21,22,23. Seit der Erzeugung der ersten menschlichen RO durch das Sasai-Labor11 wurden im Laufe der Jahre mehrere Modifikationen vorgeschlagen, um die Einfachheit und Wirksamkeit des Induktionsprozesses zu verbessern 13,21,24,25. Leider wurde bis heute kein Goldstandardprotokoll für die Erzeugung von ROs in allen Labors festgelegt. In der Tat gibt es ein gewisses Maß an Diskrepanz bei ROs, das sich aus verschiedenen Induktionsmethoden ergibt, sowie große Unterschiede in der Expression von Netzhautmarkern und der Robustheit ihrer Struktur22,26. Diese Probleme können die Probenentnahme und die Interpretation der Studienergebnisse erheblich erschweren. Daher ist ein konsolidierteres und robusteres Differenzierungsprotokoll erforderlich, um die Effizienz bei minimaler Heterogenität der RO-Erzeugung zu maximieren.

Diese Studie beschreibt ein optimiertes Induktionsprotokoll, das auf einer Kombination von Kuwahara et al.12 und Döpper et al.27 mit detaillierten Anweisungen basiert. Die neue Methode reduziert die Wahrscheinlichkeit der Organoidvesikulation und -fusion signifikant und erhöht die Erfolgsrate bei der Erzeugung von NR. Diese Entwicklung ist vielversprechend für die Modellierung von Krankheiten, das Screening von Medikamenten und Zelltherapieanwendungen für Netzhauterkrankungen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von der institutionellen Ethikkommission des chinesischen Allgemeinen Krankenhauses der Volksbefreiungsarmee genehmigt. Die WA09 (H9) ESC-Linie wurde vom WiCell Research Institute bezogen.

1. Nährmedien und Reagenzienvorbereitung

  1. Humanes ESC-Nährmedium und Durchgangslösung
    1. Erhaltungsmedium (MM): 500 ml vollständiges MM (Basalmedium + 5x Ergänzung; siehe Materialtabelle) aseptisch herstellen. 5x Supplement bei Raumtemperatur (RT) oder über Nacht bei 2-8 °C auftauen. Vor Gebrauch gut umrühren, bis das Präparat frei von Trübung ist.
    2. 1% extrazelluläre Matrix (ECM): Verwenden Sie eine vorgekühlte Pipettenspitze und sterile Röhrchen, um 200 μl ECM (siehe Materialtabelle) pro Röhrchen auf Eis abzugeben. Lagern Sie die Röhrchen in einem -20 °C Gefrierschrank. ECM auf Eis schmelzen und mit vorgekühltem DMEM/F12 bei 1:100 verdünnen.
    3. 0,5 mM pH = 8,0 EDTA: Um 500 ml 0,5 mM EDTA herzustellen, fügen Sie 500 μl 0,5 M EDTA und 0,9 g NaCl zu 500 ml 1x Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) hinzu (siehe Materialtabelle). Gründlich mischen und bei 2-8 °C lagern.
  2. Retinales Differenzierungsmedium
    1. Wachstumsfaktorfreies chemisch definiertes Medium (gfCDM): Bereiten Sie das gfCDM vor, indem Sie 45 % des modifizierten Dulbecco-Mediums GlutaMAX (IMDM-GlutaMAX) von Iscove, 45 % F12-GlutaMAX (F12-Glutamax) von Ham, 10 % Knockout-Serumersatz (KSR), 1 % Cholesterin-Lipidkonzentrat und 450 μM Thioglycerin kombinieren (siehe Materialtabelle).
  3. Kleinmolekulare Verbindungen
    1. Y-27632 2HCl: Fügen Sie 50 mg Y-27632-Pulver zu 3,122 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzu. Y-27632 (siehe Materialtabelle) in einer Konzentration von 50 mM bei -80 °C abgeben und 2 Jahre lang lichtgeschützt lagern. Verdünnen Sie das Stammmaterial 2.500 Mal (20 μM) zur Verwendung, was 0,4 μl Y-27632 pro ml gfCDM entspricht.
    2. IWR1-endo: Fügen Sie 2,4424 ml DMSO hinzu, um 10 mg IWR1-endo aufzulösen (siehe Materialtabelle), um eine 10 mM Stammlösung zu erhalten. Aliquote abgeben und bis zu 2 Jahre bei -80 °C lagern. Fügen Sie 0,3 μl 10 mM IWR1-endo pro ml gfCDM für die 3 μM-Konzentration für die Induktion hinzu.
    3. SB431542: Um 50 mM SB431542 zuzubereiten, fügen Sie 10 mg SB431542 (siehe Materialtabelle) zu 0,5203 ml DMSO hinzu und mischen Sie gründlich. Bei -80 °C in Lösungsmittel maximal 2 Jahre lagern. Für die Herstellung von SB431542 in einer Arbeitskonzentration von 10 μM werden 2 μl der 50 mM-Stammlösung zu 10 ml gfCDM gegeben.
    4. LDN-193189 2HCl: 5 mg LDN-193189 2HCl (siehe Materialtabelle) in 10,4297 ml DMSO lösen, um 1 mM Stammlösung zu erhalten. Bei -20 °C oder -80 °C lagern (wie vom Hersteller empfohlen). Fügen Sie 0,1 μl des Stammmaterials zu jeweils 10 ml gfCDM hinzu, was 100 nM LDN-193189 für die Induktion ergibt.
    5. Rekombinantes humanes morphogenetisches Knochenprotein 4 (BMP4): Rekonstitution bei 50-200 μg/ml in 4 mM HCl (siehe Materialtabelle). Nach der Rekonstitution bei 2 °C bis 8 °C 1 Monat oder -20 °C 1 Jahr lang lagern. Führen Sie die Induktion von NR mit 1,5 nM BMP4 durch.
  4. Langfristiges NR-Kulturmedium
    1. Retinsäure (RA): Messen Sie 6 mg RA-Pulver (siehe Materialtabelle) und fügen Sie es zu 3,9941 ml DMSO hinzu. In Aliquots von 5 mM bei -80 °C lagern und innerhalb von 3 Monaten verbrauchen. Um eine Arbeitskonzentration von 0,5 μM zu erreichen, fügen Sie 10 μl des Mastermixes zu 100 ml neuronalem Netzhautdifferenzierungsmedium (NRDM) hinzu. Kurz vor Gebrauch hinzufügen.
      Anmerkungen: Während der Zubereitung und Lagerung vor Licht schützen.
    2. Taurin: Fügen Sie Taurinpulver (siehe Materialtabelle) mit einem Gewicht von 200 mg zu 7,9904 ml DMSO hinzu, um eine 200 mM Stammlösung zu erhalten. Dosieren und bei 2-8 °C lagern. Eine Arbeitskonzentration von 0,1 mM Taurin wird durch Zugabe von 50 μl der Stammlösung pro 100 ml NRDM erreicht.
    3. NRDM: Komponieren Sie NRDM mit DMEM/F12-GlutaMAX-Medium, 1 % N2-Ergänzung, 10 % fötalem Rinderserum, 0,5 mM RA und 0,1 mM Taurin (siehe Materialtabelle). Bei 2-8 °C bis zu 2 Wochen oder 6 Monate bei -20 °C lagern, um die Aktivität der Komponenten zu gewährleisten.
  5. Blockierungspuffer: 1:9 mit DPBS verdünnen, um eine 10%ige Arbeitslösung für den Gebrauch zu erhalten (siehe Materialtabelle). Bei -20 °C bis zu 5 Jahre lagern.
    HINWEIS: Führen Sie alle anderen Verfahren in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II durch, um die Sterilität zu gewährleisten, mit Ausnahme des Wiegens. Wenn während des Vorbereitungsprozesses gewogene Reagenzien hinzugefügt werden müssen, verwenden Sie 0,22-μm-Filter für die Filtration.

2. Kultivierung von H9-ESCs

  1. Auftauen von H9-ESCs
    1. Geben Sie 1 ml 1 % ECM in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. 1 h in einem Inkubator bei 37 °C in einer 5 % CO2 -Atmosphäre inkubieren.
      Anmerkungen: Vermeiden Sie die Zugabe von ECM entlang der Bohrlochwände, da es an der Oberfläche haften bleiben kann.
    2. Nehmen Sie einen H9-ESC-Kryoröhrchen-Fond aus dem Flüssigstickstofftank und schütteln Sie ihn 30 s lang schnell in 37 °C warmem Wasser.
      HINWEIS: Lassen Sie die Durchstechflasche nicht vollständig auftauen.
    3. Nehmen Sie die Durchstechflasche heraus und sterilisieren Sie sie vorsichtig mit 75% desinfizierendem Alkoholspray. Geben Sie das aufgetaute H9-ESC aus dem Kryofläschchen in ein 15-ml-Röhrchen mit 9 ml MM mit 10 μM Y-27632.
    4. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 190 × g für 5 min bei RT. Entfernen Sie vorsichtig den größten Teil des Überstands mit einer 1-ml-Pipette, wobei ca. 50 μl Überstand übrig bleiben, um Zellverlust zu vermeiden.
    5. Geben Sie 1 ml MM mit 10 μM Y27632 in das Zellsediment und resuspendieren Sie das Zellsediment vorsichtig mit einer 1-ml-Pipette, indem Sie 5-10 Mal auf und ab pipettieren.
    6. Entfernen Sie die ECM-Beschichtung nach 1 Stunde Inkubation. Geben Sie 2 ml vorgewärmtes MM mit 10 μM Y-27632 in jede Vertiefung.
    7. Geben Sie 0,5 ml Zellsuspension pro Well ab. Schütteln Sie die Platte vorsichtig seitlich, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten.
    8. Die Platte wird bei 37 °C unter 5 % CO2 mindestens 24 h inkubiert, ohne sie zu berühren.
    9. Wechseln Sie das Medium täglich. Wenn die Klondichte 70 % und mehr erreicht, ist eine Passage erforderlich.
  2. Passage von H9-ESCs
    1. Bereiten Sie die ECM-beschichtete Platte wie oben beschrieben vor (Schritt 2.1.1) und fügen Sie 2 ml MM pro Vertiefung hinzu.
    2. Entfernen Sie das verbrauchte Medium von den 6-Well-Platten. Waschen Sie jede Mulde zweimal mit 1 ml DPBS.
    3. Waschen Sie jede Mulde zweimal, indem Sie langsam 1 ml EDTA hinzufügen und 4-7 Minuten lang bei RT mit 1 ml EDTA inkubieren.
      HINWEIS: Untersuchen Sie die 6-Well-Platte während der Inkubation 3 Minuten lang unter einem Mikroskop. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort, wenn sich die meisten Zellen von der Schale lösen. Vermeiden Sie eine lange Inkubationszeit, um negative Auswirkungen auf die Zellen zu reduzieren.
    4. EDTA verwerfen und 1 ml MM hinzufügen, um die Verdauung abzubrechen.
    5. Klopfen Sie vorsichtig auf die Well-Platte, bis sich die Mehrheit der Zellen abgelöst hat.
    6. Übertragen Sie die Zellsuspension vorsichtig mit einer 5-ml-Pipette in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Suspendieren Sie die H9-ESC-Kolonien vorsichtig 3-5 Mal auf und ab, um sie mit einer Pasteur-Pitette zu mischen. 20-100 μl Zellsuspension in eine neue ECM-beschichtete 6-Well-Kulturschale geben und hin und her schütteln.
    7. Wenn die Zelldichte unter dem Mikroskop als ausreichend angesehen wird, wird die Platte bei 37 °C unter 5 % CO2 mindestens 24 h lang inkubiert, ohne sie zu berühren.
    8. Wechseln Sie täglich die Medien. Bei einer Klondichte von 70 % und mehr ist eine Passage erforderlich.

3. Erzeugung menschlicher NRs

HINWEIS: Sobald die Kolonien eine Konfluenz von etwa 70 % erreicht haben, können sie mit den in Abbildung 1 beschriebenen Verfahrensschritten auf die Differenzierung in Netzhautorganoide (ROs) ausgerichtet werden.

  1. Tag 0 - Bildung des Embryoidkörpers (EB)
    1. Nachdem Sie die Zellen mit 2 ml DPBS gewaschen haben, geben Sie 0,5 ml CDS (siehe Materialtabelle) mit 20 μM Y27632 in die Vertiefung. 3 min bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Inkubator inkubieren.
      HINWEIS: Unter einem Mikroskop prüfen. Verkürzen Sie die Inkubationszeit so weit wie möglich, um schädliche Auswirkungen auf die Zellen zu vermeiden.
    2. Verdau durch Zugabe von 3 ml MM mit 20 μM Y27632 abbrechen. Bei 190 × g 5 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
    3. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml gfCDM mit 20 μM Y27632 und zählen Sie die Zellen. Fügen Sie das entsprechende Volumen für 1,2 × 106 Zellen (1,2 × 104 Zellen pro Well) zu 10 ml gfCDM hinzu, das mit 20 μM Y-27632, 3 μM IWR1-endo, 10 μM SB431542 und 100 nM LDN-193189 vorintegriert ist (siehe Materialtabelle).
    4. Geben Sie 100 μl Zellsuspension in jede Vertiefung von konischen Vertiefungen mit 96 V-Boden. Legen Sie die Platte bis zum 6. Tag in einen befeuchteten 5% CO2 -Inkubator.
      HINWEIS: Bewegen Sie das Geschirr mindestens 24 Stunden lang nicht, um die Haftung von EBs zu verbessern.
  2. Tag 6 - Netzhaut-Induktion
    1. An Tag 6 werden 10 ml gfCDM mit 55 ng/ml BMP4 hinzugefügt, um einen vollständigen Wechsel des Nährmediums auf den EBs zu ermöglichen. Stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator.
      HINWEIS: Pipettieren Sie in Richtung der Wände der konischen Vertiefung mit 96 V-Boden, um Luftblasen zu vermeiden. Vermeiden Sie die Aufnahme von Organoiden beim Wechsel des Mediums.
    2. Führen Sie an Tag 9, Tag 12 und Tag 15 einen halben bis mittleren Wechsel durch. Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums durch frisches gfCDM, um das BMP4 allmählich zu verdünnen.
  3. Tag 18 - Langfristige NR-Kultur
    1. Übertragen Sie die gebildeten EBs am 18. Tag vorsichtig mit 5-ml-Pasteurpipetten in 15-ml-Zentrifugenröhrchen und spülen Sie sie erneut vorsichtig mit NRDM aus. Übertragen Sie die EBs auf adsorptionsarme 6-Well- oder 24-Well-Platten (siehe Materialtabelle). Stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator.
    2. Ersetzen Sie das Medium alle 3 Tage durch frisches NRDM.
      HINWEIS: Schalten Sie das Licht während des Medienwechsels aus, da die RA lichtempfindlich ist. Entfernen Sie schlecht differenzierte Organoide und trennen Sie anhaftende Organoide unter einem Mikroskop.

4. Analyse menschlicher NRs

  1. Montage der ROs
    1. Wählen Sie verschiedene Generationen von H9-ESCs aus, um drei Chargen von ROs zu induzieren.
      HINWEIS: Drei Platten mit der Anzahl der sich bildenden NRs für jede der drei bewerteten Methoden (Kuwahara et al.12, Döpper et al.27 und die modifizierte Methode in der vorliegenden Studie) werden berechnet, um die Induktionserfolgsrate zu bewerten. Die Induktion gilt als erfolgreich, wenn die Lichtmikroskopie am 30. Tag die Bildung neuroepithelähnlicher Strukturen zeigt.
  2. Immunfluoreszenzfärbung von ROs
    1. Übertragen Sie 3-5 ROs auf 1,5 ml-Röhrchen. Überschüssiges Medium abpipettieren und die ROs einmal mit 1 ml DPBS bei RT waschen. Lassen Sie die ROs sinken und entfernen Sie vorsichtig die DPBS. 1 ml 4%iges Paraformaldehyd (siehe Materialtabelle) pro 1,5-ml-Röhrchen zugeben und bei 4 °C fixieren.
      HINWEIS: ROs an Tag 6 und Tag 18, fix 2 h. Fixieren Sie für 12 h an Tag 30 und 14 h an Tag 60.
    2. Nach der Fixierung mit Gradientenalkohol dehydrieren. Lassen Sie die ROs jeweils 15 Minuten in 50 %, 60 % und 70 % Alkohol und anschließend jeweils 10 Minuten in 80 %, 90 %, 95 %, 100 % und 100 % Alkohol stehen. Fügen Sie dann eine 1:1-Mischung aus 100% Alkohol und Xylol für 10 Minuten hinzu, gefolgt von Xylol zweimal für jeweils 10 Minuten.
    3. Legen Sie die ROs 40 Minuten lang in Metallformen, die mit geschmolzenem Paraplast gefüllt sind (siehe Materialtabelle), und schrecken Sie die Formen dann auf Eis ab, um die ROs zu fixieren. Legen Sie Einbettboxen in die Formen und frieren Sie sie über Nacht bei -20 °C ein. Lösen Sie anschließend vorsichtig die Einbettungsboxen. Lagern Sie sie schließlich bei RT.
    4. Erstellen Sie kontinuierliche Abschnitte (5 μm Dicke) mit einem Paraffinschneider. Fixieren Sie die Schichten auf Adhäsionsmikroskop-Objektträgern, trocknen Sie sie und lagern Sie sie bei RT.
    5. Führen Sie vor der Antigenreparatur eine Entparaffinierung und Rehydrierung durch12,27.
    6. 10 ml 20x pH 6,0 Citrat Antigen Retrieval Solution (siehe Materialtabelle) zu 190 ml ddH2O (doppelt destilliertes H2O) geben. In der Mikrowelle auf hoher Stufe 4 Minuten erhitzen, bis sie kochen. Nach dem Hinzufügen von Paraffinabschnitten erhitzen Sie die Abschnitte 20 Minuten lang im niedrigen Modus, um die Antigenreparatur abzuschließen.
    7. Lassen Sie die Paraffinabschnitte in einem belüfteten Bereich auf natürliche Weise abkühlen und legen Sie sie dann in eine feuchte Kammer.
    8. Verwenden Sie einen Pap-Stift (siehe Materialtabelle), um die Abschnitte zu skizzieren. Inkubieren Sie mit 0,2 % Triton X-100 bei RT für 30 Minuten, um die Membranen zu brechen, gefolgt von dreimaligem Waschen der Objektträger mit TPBS für jeweils 5 Minuten.
    9. Mit 10 % Eselserum, verdünnt in DPBS bei RT, 1 h in einer feuchten Kammer mit 10 μl pro Färbebereich blockieren.
    10. Fügen Sie primäre Antikörper hinzu, die in 10% Eselserum verdünnt sind. Über Nacht bei 4 °C in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren. Waschen Sie die Proben dreimal mit TPBS für jeweils 10 Minuten, um den ungebundenen Antikörper zu entfernen.
      HINWEIS: Primäre Antikörper sind wie folgt: Anti-PAX6 (1: 250), Anti-SOX2 (1: 200), Anti-KI67 (1: 200), Anti-CHX10 (1: 200), Anti-β Tubulin III (1: 250) und Anti-NESTIN (1: 200) (siehe Materialtabelle).
    11. Mit in DPBS verdünnten Sekundärantikörpern 1 h bei RT in einer befeuchteten Kammer inkubieren. Wiederholen Sie den Waschschritt mit TPBS dreimal für jeweils 10 Minuten.
      HINWEIS: Im Dunkeln aufbewahren, um ein Abschrecken des fluoreszierenden Sekundärantikörpers zu verhindern. Sekundäre Antikörper sind Alexa Fluor 488, konjugiert mit Esel-Anti-Maus-IgG und Alexa Fluor 568, konjugiert mit Esel-Anti-Kaninchen-IgG in einer Verdünnung von 1:400 (siehe Materialtabelle).
    12. Inkubieren Sie mit DPBS, das DAPI (1: 500; siehe Materialtabelle) enthält, 10 Minuten lang bei RT im Dunkeln. Dreimal mit TPBS für jeweils 10 min waschen.
    13. Geben Sie eine angemessene Menge Anti-Fluoreszenz-Versiegelung (siehe Materialtabelle) auf den Objektträger und decken Sie ihn mit Deckgläsern ab.
    14. Visualisieren Sie mit einem flussähnlichen quantitativen Gewebezellanalysator (siehe Materialtabelle) oder ähnlichem.
    15. Lagern Sie Objektträger nach mikroskopischer Analyse bei -20 °C im Dunkeln.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eine grafische Übersicht über das geänderte Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. H9-ESCs wurden zur Erzeugung von ROs verwendet, wenn die Zellen auf eine Dichte von 70 % bis 80 % gezüchtet wurden. Einzelzellsuspensionen von H9-ESCs in konischen Vertiefungen mit 96 V-Boden aggregierten sich an Tag 1 und bildeten bis Tag 6 gut umschriebene runde EBs. Mit zunehmender Kulturzeit nahm das Volumen der EBs allmählich zu. Am Tag 30 wurden während der langfristigen NR-Differenzierung deutlich neuroepitheliale Strukturen gebildet und verdickt.

Darüber hinaus wurde die modifizierte Methode mit zwei anderen Methoden (Kuwahara et al.12 und Döpper et al.27) verglichen, um ihre Wiederholbarkeit und Effizienz zu bewerten (Ergänzende Abbildung 1). In dieser Studie wurde auch beobachtet, dass die Morphologie der EBs an Tag 1 nach der modifizierten Methode etwas schlechter war als bei den beiden anderen Methoden. Die neuroepithelialen Strukturen, die sich mit der modifizierten Methode bildeten, waren jedoch am Tag 18 kontinuierlicher (Abbildung 2). Am Tag 30 waren die mit der modifizierten Methode erhaltenen frühen NRs in Form und Größe ähnlich und zeigten eine regelmäßige runde Form (Abbildung 3). Im Vergleich zu den beiden anderen Methoden wiesen die mit der modifizierten Methode gebildeten NRs eine geringere Inzidenz von Vesikulation und Adhäsion auf. Darüber hinaus stieg die Erfolgsrate bei der Erzeugung von NRs mit der modifizierten Methode auf der Grundlage der H9-ESCs von 26,9% bzw. 69,24% für die Methoden von Kuwahara et al. und Döpper et al.12,27 auf 87,39% (Abbildung 3M).

Die Immunfluoreszenzfärbung wurde an paraffineingebetteten Schnitten der NRs durchgeführt, um die Expression von Markern im Zusammenhang mit der Netzhautentwicklung zu bewerten (Abbildung 4). Die Ergebnisse zeigten die Expression menschlicher Gene, die mit der Netzhaut assoziiert sind, in NRs, die von H9-ESCs abgeleitet wurden, mit einer modifizierten Methode. Der erste Zellsubtyp, der auftauchte, ist die retinale Ganglienzelle, die sich hauptsächlich auf der basalen Seite der NRs ansammelte. Die TUJ1-Färbung wurde verwendet, um die Axone der retinalen Ganglienzellen zu identifizieren (Abbildung 4I-L). Darüber hinaus wurden Marker von retinalen Vorläuferzellen sowohl in der inneren (PAX6+) als auch in der äußeren (CHX10+) Schicht nachgewiesen (Abbildung 4A-H). Zellen, die positiv für den Proliferationsmarker KI67 waren, waren in der äußeren Schicht verteilt (Abbildung 4A-D).

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Übersicht. Die schematische Übersicht des modifizierten Kulturprotokolls zeigt die Addition verschiedener Faktoren zu bestimmten Zeitpunkten und die repräsentativen Bilder der Entwicklung der neuronalen Netzhaut. SFEBq: serumfreie Schwimmkultur von embryoidenähnlichen Aggregaten mit schneller Reaggregation; KSR: Knockout-Serumersatz; gfCDM: Wachstumsfaktorfreies chemisch definiertes Medium; NRDM: Differenzierungsmedium für die neuronale Netzhaut; BMP4: knochenmorphogenetisches Protein 4.Maßstabsbalken: 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Die repräsentativen Hellfeldbilder von Netzhaut-Organoiden, die aus drei verschiedenen Protokollen im Frühstadium abgeleitet wurden. An Tag 1 war nur die modifizierte Methode nicht von den EBs (A, E, I) betroffen. Am Tag 6 bildeten sich EBs in allen drei Methoden (B, F, J). Am Tag 18 wurden frühe neurale Netzhäute gebildet und eine unterschiedliche Morphologie zwischen den drei Induktionsmethoden (C, G, K) gefunden. Am Tag 21 zeigte die mit der modifizierten Methode erzeugte neuroepitheliale Netzhaut eine kontinuierliche neuroepitheliale Struktur (D,H,L). Maßstabsbalken: 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Reife 3D-Neuralnetzhaut in Suspensionskultur an den Tagen 30, 45, 60. Am Tag 30 bildete sich bei allen drei Methoden (A,E,I) eine neuronale Netzhaut. Pfeile zeigen zystische Strukturen in der Methode von Kuwahara et al. (B). Weiße gepunktete Kästchen stellen den Bereich der Organoidadhäsion und -fusion zueinander dar (D,F,H). Die aus dem modifizierten Protokoll generierten Netzhautorganoide sind in Größe und Morphologie ähnlich wie die beiden anderen Methoden (C, G, J, K, L). Maßstabsleisten: 100 μm (weiß); 200 μm (schwarz). Statistisches Diagramm der Induktionserfolgsrate durch die drei Methoden mit H9-ESCs (M). Zur Überprüfung der Signifikanz wurde eine unidirektionale Varianzanalyse verwendet (Fehlerbalken zeigen Standardfehler, n = 864, **P < 0,01, ***P < 0,001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Charakterisierung der neuronalen Netzhaut im modifizierten Protokoll. Immunfärbebilder der neuronalen Netzhaut an Tag 6, Tag 18, Tag 30 und Tag 60. Grüne Färbungen sind für KI67 (proliferierende Zelle), PAX6 (retinale Vorläuferzelle) und NESTIN (neurale Stammzelle). Rote Färbungen sind für CHX10 (retinale Vorläuferzelle), SOX2 (neurale Vorläuferzelle) und TUJ1 (retinale Ganglienzelle). Maßstabsleisten: 100 μm (A,B,E,F,I,J); 200 μm (C,D,G,H,K,L). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Vergleich der Flussdiagramme für die drei retinalen Organoid-Induktionsprotokolle. SFEBq: serumfreie Schwimmkultur von embryoidenähnlichen Aggregaten mit schneller Reaggregation; KSR: Knockout-Serumersatz; gfCDM: Wachstumsfaktorfreies chemisch definiertes Medium; NRDM: Differenzierungsmedium für die neuronale Netzhaut; BMP4: morphogenetisches Protein der Knochen 4. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Die Morphologie des Embryoidkörpers (EB), die durch die Methode von Kuwaharaet al. induziert wurde. Das allmähliche Auftreten von toten Zellklumpen wurde um EBs herum nach der Zugabe von BMP4 an Tag 6 beobachtet (A-D, schwarze Pfeile). Nach Tag 6 (E-L) wurden große morphologische Unterschiede beobachtet, und einige EBs waren sogar vollständig inaktiviert (H,L). ESC: embryonale Stammzelle, PBMC: mononukleäre Zelle des peripheren Blutes, IPSC: induzierte pluripotente Stammzelle. Maßstabsbalken: 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Menschliche ROs können die Entwicklung der fetalen Netzhaut räumlich und zeitlich rekapitulieren, und frühe ROs weisen in äquivalenten Entwicklungsstadien einen hohen Grad an Ähnlichkeit mit der fetalen Netzhaut auf15. In Bezug auf Gewebemorphologie und molekulare Expression spiegelt die menschliche RO den tatsächlichen Wachstumsstatus des Netzhautgewebes genau wider und bietet enorme und beispiellose Möglichkeiten in den Bereichen Krankheitsmodellierung, Wirkstoffscreening und regenerative Medizin. Derzeit wurden mehrere verschiedene Methoden zur Erzeugung von ROs aus menschlichen PSCs in vitro etabliert, und kontinuierliche Modifikationen und Optimierungen sind im Gange, um die Effizienz weiter zu verbessern9. Das Sasai-Labor berichtete zum ersten Mal über die Erzeugung von PSC-abgeleiteten ROs aus menschlichen ESCs11. Humane ESCs wurden zuerst in Einzelzellsuspensionen hergestellt, und dann wurde eine gleiche Anzahl von Zellen in konischen Vertiefungen mit 96 V-Boden ausgesät, wobei eine schnelle Aggregation zu kreisförmigen EBs erfolgte. Die externe Addition von Schlüsselzellsignalwegen förderte die Bildung von optischen Vesikeln in EBs, die anschließend in Suspensionskultur zu laminierten ROs reiften. Die NR enthält einen Gliazelltyp und sechs verschiedene neuronale Zelltypen, die viele Aspekte der Netzhautentwicklung repräsentieren, wie z. B. Zellmorphogenese, Neuronendifferenzierung und apikal-basale Polarität9. Obwohl nur 10 % der Aggregate eine doppelwandige optische Becherstruktur bildeten, war dies ein wichtiger Meilenstein in der Entwicklung der Herstellung fortschrittlicherer ROs11.

In der Folge stellten Zhong et al. eine neue Alternative vor, bei der hiPSCs zunächst in der Nähe von Konfluenzen gezüchtet wurden, gefolgt von einem chemischen oder mechanischen Zerfall in schwimmende kleine Aggregate13. Dann bildeten die kleinen Aggregate EBs in Suspensionskultur, die sich getrennt vom Boden der Platte lösten und sich in neuronaler Richtung weiter differenzierten. Zhong et al. zeigten eine vollständig laminierte 3D-Netzhaut mit relativ gut entwickelten Photorezeptor-Außensegmenten, die auf Lichtstimulation reagierten. Diese Methode erforderte weniger externe Regulation der Zellsignalwege und wurde hauptsächlich selbstgesteuert durchgeführt9. Die dritte technologische Revolution war die Einführung der Einbettungsmethode durch die Lowe-Gruppe25. Dabei wurden hESC-Aggregate in die ECM eingebettet, um eine einlumige Epithelstruktur zu bilden. Nach der enzymatischen Dispergierung wurden die Aggregate in einer Suspensionskultur gehalten, um reife ROs zu bilden. Obwohl alle drei Methoden erfolgreich ROs mit vergleichbarer Struktur und Funktion induzieren können, haben großtechnische Anwendungen aufgrund ihrer hohen Heterogenität und geringen Erfolgsquote den Nachteil, dass sie zeitaufwändig und mühsam sind23.

Zusätzlich zu den oben genannten Methoden schlugen Kuwahara et al. eine neue Induktionsmethode vor, nämlich die Schlüsselfaktor-Gradientenabnahmemethode12. Sie fanden heraus, dass NR durch die Zugabe von BMP4 bei abnehmender Konzentration ab Tag 6 erzeugt werden konnte. Dieses Induktionssystem verwendete weniger externe Faktoren, um ROs mit erhöhter Einheitlichkeit von Größe und Morphologie zu bilden. Studien haben jedoch berichtet, dass die gebildeten EBs anfällig für zystische Läsionen waren, und die Induktionserfolgsrate dieser Methode betrug etwa 40 %12,28. Döpper et al. modifizierten dieses Protokoll, um die Erfolgsrate zu verbessern, indem sie ein kommerzielles Medium mit drei niedermolekularen Inhibitoren im frühen Stadium der Induktion kombinierten, um die EBszu stabilisieren 27. Im Gegensatz dazu haften Zellen des neuralen Epithels der Netzhaut leichter aneinander, was eine separate Kultur jedes RO während der Langzeit-Suspensionskultur erforderlich macht. Die Methode von Döpper et al. erhöht die Komplikationen und Kosten des experimentellen Betriebs und ist für die Induktion im großen Maßstab nicht geeignet27. Das optimierte RO-Produktionsprotokoll verbesserte die Induktionseffizienz. Die aktuelle modifizierte Methode wurde mit den Methoden von Kuwahara et al. und Döpper et al. verglichen.

Diese Studie zeigte, dass sowohl die Methoden von Kuwahara et al. als auch die von Döpper et al. am Tag 1 EBs mit glatten Kanten bildeten, während die vorliegende modifizierte Methode eine relativ lange Zeit benötigte, um EBs zu bilden, etwa bis zum Tag 6. Das Volumen der EBs, die mit der Methode von Kuwahara et al. erhalten wurden, war größer als das mit der Methode von Döpper et al., und die mit der Methode von Döpper et al. erhaltenen EBs zeigten eine erhöhte Fließfähigkeit unter Flüssigkeitsströmung. Bemerkenswert ist, dass nach der Zugabe von BMP4 am Tag 6 allmählich tote Zellklumpen um die EBs herum auftraten, wenn die Methode von Kuwahara et al. angewendet wurde (Ergänzende Abbildung 2). Am Tag 18 wurden signifikante morphologische Unterschiede in den EBs der Methode von Kuwahara et al. beobachtet, und einige EBs waren vollständig inaktiviert (Ergänzende Abbildung 2). In der Methode von Döpper et al. war die Mehrheit der EBs abgerundet und gut umschrieben und wies nur eine kleine Anzahl verstreuter toter Zellen um sie herum auf. Die modifizierte Methode bildete dichte und gut strukturierte EBs mit leichten morphologischen Unterschieden, und um sie herum wurden einige tote Zellen beobachtet.

Darüber hinaus ergab diese Studie auch, dass einige EBs von Kuwahara et al. im Frühstadium nach dem Transfer auf 6-Well-Platten Vesikel erzeugten, was zu einem Versagen bei der Bildung von ROs führte. Adhäsion und Fusion von ROs traten um Tag 40 auf, was den Nutzen der Experimente erheblich verringerte. Das Kultursystem der Methode von Döpper et al. ist komplizierter und erfordert mehr Arbeitsschritte und höhere Kosten als die Methode von Kuwahara et al. Die Mehrzahl der ROs von Döpper et al. entwickelte auch zwangsläufig Adhäsionen und Fusionen untereinander. Die modifizierte Methode in dieser Studie erzeugte erfolgreich 3D-NRs in vitro , die die humanen Netzhaut-verwandten Marker CHX10, KI67, PAX6, SOX2, TUJ1 und NESTIN exprimierten. Und die meisten ROs mit der modifizierten Methode waren in Größe und Morphologie konsistent, und nur sehr wenige Vesikel oder Adhäsionen entwickelten sich in den späten Stadien der Netzhautdifferenzierung.

Im Vergleich zu den beiden anderen Methoden hatte das neue Kultursystem einfachere Arbeitsschritte und geringere Kosten. Der entscheidende Schritt bei der modifizierten Methode besteht darin, drei niedermolekulare Inhibitoren in das Medium zu geben und sicherzustellen, dass die Platte in den ersten sechs Tagen nicht bewegt wird, um die Struktur der EBs zu stabilisieren. Die Bewegung von Platten oder jede Zellmanipulation im Frühstadium kann die Bildung von EBs beeinflussen. Im Vergleich zu den beiden anderen Methoden veränderte die modifizierte Methode das Medium an Tag 1 nicht und reduzierte auch den Einsatz von niedermolekularen Inhibitoren an Tag 15. Kurz gesagt, die Arbeitsschritte der modifizierten Methode werden bis zu einem gewissen Grad vereinfacht und die Versuchskosten werden durch den geringeren Einsatz von Medien und Reagenzien eingespart. Die modifizierte Methode kann jedoch immer noch nicht die üblichen Probleme des derzeitigen Organoidkultursystems lösen. Darüber hinaus hängt die Induktionseffizienz von ROs weitgehend von der Qualität und Differenzierungsfähigkeit von hPSCs ab. In dieser Studie wurde nur der Wirkungsgrad der NR-Erzeugung mit H9-ESC vollständig berechnet. Wir haben mit der neuen Methode in der vorliegenden Studie erfolgreich ROs in verschiedenen hPSCs-Linien induziert und die gleiche Induktionseffizienz erreicht, einschließlich H9, H1 und PBMC-iPSC. Es gibt keinen statistischen Unterschied in der Induktionseffizienz zwischen den drei Zelllinien. In Zukunft müssen weitere Studien die Induktionseffizienz verschiedener hPSCs mit dieser Methode untersuchen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das optimierte Netzhautinduktionsprotokoll einfach und kostengünstig ist, eine hohe Wiederholbarkeit und Effizienz aufweist, vielversprechende personalisierte Modelle von Netzhauterkrankungen bietet und eine reichhaltige Zellquelle für Zelltherapie, Wirkstoffscreening und Gentherapietests bietet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Acknowledgments

Nichts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.01 M TPBS Servicebio G0002 Washing slices
4% Paraformaldehyde Servicebio G1101-500ML Fix retinal organoids
5 mL Pasteur pipette NEST Biotechnology 318516 Pipette retinal organoids
96 V-bottomed conical wells Sumitomo Bakelit MS-9096VZ
Adhesion Microscope Slides CITOTEST 188105 Fix slices
AggreWell medium STEMCELL Technologies 5893 Medium
Anhydrous ethanol SINOPHARM 10009218 Dehydrate 
Anti-CHX10 Santa Cruz sc-365519 Primary antibody
Antifade Solution ZSGB-BIO ZLI-9556
Anti-KI67 Abcam ab16667 Primary antibody
Anti-NESTIN Sigma N5413 Primary antibody
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) Beyotime AT809 Primary antibody
Anti-PAX6 Abcam ab195045 Primary antibody
Cell dissociation solution(CDS) STEMCELL Technologies 7922 Cell dissociation
CHIR99021 Selleckchem S2924 GSK-3α/β inhibitor
Cholesterol Lipid Concentrate Gibco 12531018 250×
Citrate Antigen Retrieval Solution Servicebio G1202-250ML 20×, pH 6.0
CS10 STEMCELL Technologies 1001061 Cell Freezing Medium
DAPI Roche 10236276001 Nuclear counterstain
Dimethyl sulfoxide(DMSO) Sigma D2650
DMEM/F12 Gibco 11330032 Medium
DMEM/F12-GlutaMAX Gibco 10565018 Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 Invitrogen A32766 Secondary Antibody
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Invitrogen A10042 Secondary Antibody
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) Biosharp BL518A 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation
Extracellular matrix (ECM) Corning 354277 Coating plates
F12-Glutamax Gibco 31765035 Medium
Fetal Bovine Serum Gibco A5669701
Flow-like tissue cell quantitative analyzer TissueGnostics TissueFAXS Plus Scan sections
IMDM-GlutaMAX Gibco 31980030 Medium
IWR1-endo Selleckchem S7086 Wnt-inhibitor
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828028
LDN-193189 2HCl Selleckchem S7507 BMP-inhibitor
Low-adhesion 24-well Plates Corning 3473
Low-adhesion 6-well Plates Corning 3471
Maintenance medium (MM) STEMCELL Technologies 85850 Medium
N2 supplement Gibco 17502048
Normal Donkey Serum Solarbio SL050 Blocking buffer
Paraplast Leica 39601006 Tissue embedding
PBS pH 7.4 basic (1x) Gibco C10010500BT Without Ca+,Mg+
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) R&D 314-BP Key protein factor
Retinoic acid Sigma R2625 Powder, keep out of light
SB431542 Selleckchem S1067 ALK5-inhibitor
SU5402 Selleckchem S7667 Tyrosine kinase inhibitor
Super PAP Pen ZSGB-BIO ZLI-9305
Taurine Sigma T0625-10G
Thioglycerol Sigma M1753
Triton X-100 Sigma X100 Permeabilization
WA09 embryonic stem cell line WiCell Research Institute Cell line
Xylene SINOPHARM 10023418 Dewaxing
Y-27632 2HCL Selleckchem S1049 ROCK-inhibitor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoon, M., Okawa, H., Della Santina,, Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
  2. Steinmetz, J. D., et al. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
  3. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
  4. Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).
  5. Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).
  6. Peng, Y. R., et al. Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina. Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).
  7. Ribeiro, J., et al. Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors. Cell Rep. 35 (3), 109022 (2021).
  8. Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
  9. Manafi, N., et al. Organoids and organ chips in ophthalmology. Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).
  10. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).
  11. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  12. Kuwahara, A., et al. Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nat Commun. 6, 6286 (2015).
  13. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nat Commun. 5, 4047 (2014).
  14. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  15. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  16. Li, H., et al. Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids. FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).
  17. Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
  18. Mandai, M. Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review. Regen Ther. 22, 59-67 (2023).
  19. Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. 3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer. Cell Biosci. 12 (1), 39 (2022).
  20. Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 9, 640212 (2021).
  21. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
  22. Sanjurjo-Soriano, C., et al. RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478 (2022).
  23. Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation. Front Cell Neurosci. 15, 638439 (2021).
  24. Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
  25. Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
  26. Yamasaki, S., et al. Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture. Regen Ther. 19, 24-34 (2022).
  27. Döpper, H., et al. Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120 (2020).
  28. Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535 (2021).

Tags

Entwicklungsbiologie Heft 202
Erzeugung neuronaler Netzhaut aus humanen pluripotenten Stammzellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, W., Li, H., Yan, H., Gao, L.,… More

Li, W., Li, H., Yan, H., Gao, L., Wang, X., Zhao, L., Yan, Y., Ye, Z., Xi, J., Yue, W., Li, Z. Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (202), e66246, doi:10.3791/66246 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter