Summary
Il presente protocollo descrive un sistema di induzione retinica neurale 3D ottimizzato che riduce l'adesione e la fusione degli organoidi retinici con elevata ripetibilità ed efficienza.
Abstract
La retinopatia è una delle principali cause di cecità in tutto il mondo. Indagare la sua patogenesi è essenziale per la diagnosi precoce e il trattamento tempestivo della retinopatia. Sfortunatamente, le barriere etiche ostacolano la raccolta di prove da parte degli esseri umani. Recentemente, numerosi studi hanno dimostrato che le cellule staminali pluripotenti umane (PSC) possono essere differenziate in organoidi retinici (RO) utilizzando diversi protocolli di induzione, che hanno un enorme potenziale nella retinopatia per la modellazione della malattia, lo screening dei farmaci e le terapie basate sulle cellule staminali. Questo studio descrive un protocollo di induzione ottimizzato per generare la retina neurale (NR) che riduce significativamente la probabilità di vescicolazione e fusione, aumentando il tasso di successo della produzione fino al giorno 60. Basato sulla capacità delle PSC di auto-riorganizzarsi dopo la dissociazione, combinata con alcuni fattori complementari, questo nuovo metodo può guidare in modo specifico la differenziazione delle NR. Inoltre, l'approccio è semplice, conveniente, mostra una notevole ripetibilità ed efficienza, presenta prospettive incoraggianti per modelli personalizzati di malattie retiniche e fornisce un abbondante serbatoio cellulare per applicazioni come la terapia cellulare, lo screening farmacologico e i test di terapia genica.
Introduction
L'occhio funge da fonte primaria di informazioni tra gli organi sensoriali umani, con la retina che è il principale tessuto sensoriale visivo negli occhi dei mammiferi1. La retinopatia è una delle principali cause globali di malattie oculari, che porta alla cecità2. Circa 2,85 milioni di persone in tutto il mondo soffrono di vari gradi di disabilità visiva a causa della retinopatia3. Di conseguenza, indagare la sua patogenesi è fondamentale per una diagnosi precoce e un trattamento tempestivo. La maggior parte degli studi sulla retinopatia umana si è concentrata principalmente su modelli animali 4,5,6. Tuttavia, la retina umana è un tessuto complesso e multistrato che comprende vari tipi di cellule. I tradizionali sistemi di coltura cellulare bidimensionale (2D) e i sistemi di modelli animali in genere non riescono a ricapitolare fedelmente il normale sviluppo spazio-temporale e il metabolismo farmacologico della retina umana nativa 7,8.
Recentemente, le tecniche di coltura 3D si sono evolute per generare organi simili ai tessuti da cellule staminali pluripotenti (PSCs)9,10. Gli organoidi retinici (RO) generati da PSC umane in un sistema di coltura in sospensione 3D non solo contengono sette tipi di cellule retiniche, ma mostrano anche una struttura stratificata distinta simile alla retina umana in vivo 11,12,13. Gli RO umani derivati da PSC hanno guadagnato popolarità e ampia disponibilità e sono attualmente i migliori modelli in vitro per lo studio dello sviluppo e della malattia della retina umana14,15. Negli ultimi decenni, numerosi ricercatori hanno dimostrato che le PSC umane, comprese le cellule staminali embrionali (ESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), possono differenziarsi in RO utilizzando vari protocolli di induzione. Questi progressi hanno un enorme potenziale nella retinopatia per la modellazione della malattia, lo screening farmacologico e le terapie basate sulle cellule staminali 16,17,18.
Tuttavia, la generazione di retina neurale (NR) da cellule staminali pluripotenti umane (PSC) è un processo complesso, ingombrante e dispendioso in termini di tempo. Inoltre, le variazioni da lotto a lotto negli organoidi tissutali possono portare a una minore riproducibilità dei risultati19,20. Numerosi fattori intrinseci ed estrinseci possono influenzare la resa degli organoidi retinici (RO), come il numero o la specie di cellule di partenza e l'uso di fattori di trascrizione e composti a piccole molecole 21,22,23. Da quando il primo RO umano è stato generato dal laboratorio Sasai11, nel corso degli anni sono state proposte molteplici modifiche per migliorare la facilità e l'efficacia del processo di induzione 13,21,24,25. Purtroppo, ad oggi, non è stato stabilito alcun protocollo gold standard per la generazione di RO in tutti i laboratori. In effetti, c'è un certo grado di discrepanza negli RO risultanti da diversi metodi di induzione, così come un'ampia variazione nell'espressione dei marcatori retinici e nella robustezza della loro struttura22,26. Questi problemi possono complicare gravemente la raccolta dei campioni e l'interpretazione dei risultati dello studio. Pertanto, è necessario un protocollo di differenziamento più consolidato e robusto per massimizzare l'efficienza con una minima eterogeneità di generazione di RO.
Questo studio descrive un protocollo di induzione ottimizzato basato su una combinazione di Kuwahara et al.12 e Döpper et al.27 con istruzioni dettagliate. Il nuovo metodo riduce significativamente la probabilità di vescicolazione e fusione degli organoidi, aumentando il tasso di successo della generazione di NR. Questo sviluppo è molto promettente per la modellazione delle malattie, lo screening dei farmaci e le applicazioni di terapia cellulare per i disturbi della retina.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Questo studio è stato condotto in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki e approvato dal Comitato Etico Istituzionale dell'Ospedale Generale Cinese del PLA. La linea ESC WA09 (H9) è stata ottenuta dall'Istituto di Ricerca WiCell.
1. Terreni di coltura e preparazione dei reagenti
- Terreno di coltura ESC umano e soluzione di passaggio
- Terreno di mantenimento (MM): Preparare 500 mL di MM completo (terreno basale + supplemento 5x; vedere la tabella dei materiali) in modo asettico. Scongelare 5 volte l'integratore a temperatura ambiente (RT) o per una notte a 2-8 °C. Mescolare bene prima dell'uso fino a quando l'integratore non è privo di torbidità.
- Matrice extracellulare (ECM) all'1%: utilizzare un puntale per pipette pre-raffreddato e provette sterili per erogare 200 μL di ECM (vedere la tabella dei materiali) per provetta su ghiaccio. Conservare le provette in un congelatore a -20 °C. Sciogliere l'ECM su ghiaccio e diluire con DMEM/F12 preraffreddato a 1:100.
- 0,5 mM pH = 8,0 EDTA: Per preparare 500 mL di EDTA 0,5 mM, aggiungere 500 μL di EDTA 0,5 M e 0,9 g di NaCl a 500 mL di 1x soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) (vedi Tabella dei materiali). Mescolare accuratamente e conservare a 2-8 °C.
- Mezzo di differenziazione retinica
- Terreno chimicamente definito privo di fattore di crescita (gfCDM): preparare il gfCDM combinando il 45% di GlutaMAX di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM-GlutaMAX), il 45% di F12-GlutaMAX di prosciutto (F12-Glutamax), il 10% di sostituzione del siero knockout (KSR), l'1% di concentrato lipidico di colesterolo e 450 μM di tioglicerolo (vedere la tabella dei materiali).
- Composti di piccole molecole
- Y-27632 2HCl: Aggiungere 50 mg di polvere di Y-27632 a 3,122 mL di dimetilsolfossido (DMSO). Erogare e conservare Y-27632 (vedere la tabella dei materiali) ad una concentrazione di 50 mM a -80 °C per 2 anni, al riparo dalla luce. Diluire lo stock 2.500 volte (20 μM) per l'uso, equivalente a 0,4 μL di Y-27632 per mL di gfCDM.
- IWR1-endo: Aggiungere 2,4424 mL di DMSO per sciogliere 10 mg di IWR1-endo (vedere la tabella dei materiali) per ottenere una soluzione madre di 10 mM. Dosare le aliquote e conservarle a -80 °C per un massimo di 2 anni. Aggiungere 0,3 μL di 10 mM IWR1-endo per mL di gfCDM per la concentrazione di 3 μM per induzione.
- SB431542: Per preparare 50 mM SB431542, aggiungere 10 mg di SB431542 (vedi Tabella dei materiali) a 0,5203 mL di DMSO e mescolare accuratamente. Conservare a -80 °C in solvente per un massimo di 2 anni. Per la preparazione di SB431542 a una concentrazione di lavoro di 10 μM, aggiungere 2 μL della soluzione madre 50 mM a 10 mL di gfCDM.
- LDN-193189 2HCl: Sciogliere 5 mg di LDN-193189 2HCl (vedere la tabella dei materiali) in 10,4297 mL di DMSO per ottenere 1 mM di soluzione madre. Conservare a -20 °C o -80 °C (come raccomandato dal produttore). Aggiungere 0,1 μL di materiale ogni 10 mL di gfCDM, ottenendo 100 nM di LDN-193189 per l'induzione.
- Proteina morfogenetica 4 dell'osso umano ricombinante (BMP4): ricostituita a 50-200 μg/mL in HCl 4 mM (vedi Tabella dei materiali). Conservare a 2 °C a 8 °C per 1 mese o a -20 °C per 1 anno dopo la ricostituzione. Eseguire l'induzione di NR utilizzando 1,5 nM BMP4.
- Terreno di coltura NR a lungo termine
- Acido retinoico (RA): Misurare 6 mg di polvere di RA (vedere la tabella dei materiali) e aggiungere a 3,9941 mL di DMSO. Conservare in aliquote di 5 mM a −80 °C e consumare entro 3 mesi. Per ottenere una concentrazione di lavoro di 0,5 μM, aggiungere 10 μL della miscela principale a 100 mL di mezzo di differenziazione della retina neurale (NRDM). Aggiungere poco prima dell'uso.
NOTA: Tenere al riparo dalla luce durante la preparazione e la conservazione. - Taurina: aggiungere la polvere di taurina (vedi Tabella dei materiali) del peso di 200 mg a 7,9904 mL di DMSO per ottenere una soluzione madre di 200 mM. Erogare e conservare a 2-8 °C. Una concentrazione di lavoro di 0,1 mM di taurina si ottiene aggiungendo 50 μL della soluzione madre per 100 mL di NRDM.
- NRDM: Comporre NRDM con DMEM/F12-GlutaMAX medium, integratore di N2 all'1%, siero bovino fetale al 10%, AR 0,5 mM e taurina 0,1 mM (vedere la tabella dei materiali). Conservare a 2-8 °C per un massimo di 2 settimane o 6 mesi a -20 °C per garantire l'attività dei componenti.
- Acido retinoico (RA): Misurare 6 mg di polvere di RA (vedere la tabella dei materiali) e aggiungere a 3,9941 mL di DMSO. Conservare in aliquote di 5 mM a −80 °C e consumare entro 3 mesi. Per ottenere una concentrazione di lavoro di 0,5 μM, aggiungere 10 μL della miscela principale a 100 mL di mezzo di differenziazione della retina neurale (NRDM). Aggiungere poco prima dell'uso.
- Tampone bloccante: Diluire 1:9 con DPBS per ottenere una soluzione di lavoro al 10% per l'uso (vedi Tabella dei Materiali). Conservare a -20 °C per un massimo di 5 anni.
NOTA: Eseguire tutte le altre procedure in una cabina di biosicurezza di Classe II per garantire la sterilità, ad eccezione della pesatura. Se è necessaria l'aggiunta di reagenti pesati durante il processo di preparazione, utilizzare filtri da 0,22 μm per la filtrazione.
2. Coltura di H9-ESC
- Scongelamento degli H9-ESC
- Aggiungere 1 mL di ECM all'1% a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Incubare per 1 ora in incubatrice a 37 °C in atmosfera con il 5% di CO2 .
NOTA: Evitare l'aggiunta di ECM lungo le pareti del pozzetto, perché potrebbe attaccarsi alla superficie. - Prelevare un materiale crioviale H9-ESC dal serbatoio di azoto liquido e agitarlo rapidamente in acqua a 37 °C per 30 s.
NOTA: Non lasciare che il flaconcino si scongeli completamente. - Rimuovere il flaconcino e sterilizzarlo accuratamente con alcol spray disinfettante al 75%. Aggiungere l'H9-ESC scongelato dal crioviale a una provetta da 15 mL contenente 9 mL MM con 10 μM Y-27632.
- Centrifugare la provetta a 190 × g per 5 minuti a RT. Rimuovere con cautela la maggior parte del surnatante con una pipetta da 1 mL, lasciando circa 50 μL di surnatante per evitare la perdita di cellule.
- Aggiungere 1 mL di MM contenente 10 μM di Y27632 al sedimento cellulare e risospendere delicatamente il sedimento cellulare con una pipetta da 1 mL pipettando su e giù 5-10 volte.
- Rimuovere il rivestimento ECM dopo 1 ora di incubazione. Aggiungere 2 mL di MM preriscaldato contenente 10 μM Y-27632 a ciascun pozzetto.
- Erogare 0,5 mL di sospensione cellulare per pozzetto. Agitare delicatamente la piastra lateralmente per garantire una distribuzione uniforme delle cellule.
- Incubare la piastra a 37 °C con il 5% di CO2 per almeno 24 ore senza toccarla.
- Cambiare il mezzo ogni giorno. Quando la densità del clone raggiunge il 70% e oltre, è necessario il passaggio.
- Aggiungere 1 mL di ECM all'1% a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Incubare per 1 ora in incubatrice a 37 °C in atmosfera con il 5% di CO2 .
- Passaggio di H9-ESC
- Preparare la piastra rivestita con ECM come descritto sopra (passaggio 2.1.1) e aggiungere 2 mL di MM per pozzetto.
- Rimuovere il terreno esausto dalle piastre a 6 pozzetti. Lavare ogni pozzetto due volte con 1 ml di DPBS.
- Lavare ogni pozzetto due volte aggiungendo lentamente 1 mL di EDTA e incubando con 1 mL di EDTA per 4-7 minuti a RT.
NOTA: Durante l'incubazione, esaminare la piastra a 6 pozzetti per 3 minuti al microscopio. Procedere immediatamente al passaggio successivo se la maggior parte delle cellule sta per staccarsi dalla capanna. Evitare l'incubazione prolungata per ridurre l'impatto negativo sulle cellule. - Eliminare l'EDTA e aggiungere 1 mL di MM per interrompere la digestione.
- Picchiettare delicatamente la piastra del pozzetto fino a quando la maggior parte delle cellule non si è staccata.
- Trasferire con cautela la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL con una pipetta da 5 mL. Risospendere delicatamente le colonie H9-ESC su e giù per 3-5 volte per mescolarle con una pitetta di Pasteur. Trasferire 20-100 μL di sospensione cellulare in una nuova piastra di coltura a 6 pozzetti rivestita con ECM e agitarla avanti e indietro.
- Quando la densità cellulare è rilevata come sufficiente al microscopio, incubare la piastra a 37 °C con il 5% di CO2 per almeno 24 ore senza toccarla.
- Cambia il supporto ogni giorno. Al 70% di densità del clone e oltre, è necessario il passaggio.
3. Generazione di NR umani
NOTA: Una volta che le colonie raggiungono circa il 70% di confluenza, possono essere indirizzate verso la differenziazione in organoidi retinici (RO) utilizzando i passaggi procedurali descritti nella Figura 1.
- Giorno 0 - Formazione del corpo embrioide (EB)
- Dopo aver lavato le cellule con 2 mL di DPBS, aggiungere 0,5 mL di CDS (vedere la tabella dei materiali) contenente 20 μM Y27632 al pozzetto. Incubare per 3 minuti a 37 °C in incubatore umidificato al 5% di CO2 .
NOTA: Controllare al microscopio. Ridurre il più possibile il tempo di incubazione per evitare effetti dannosi sulle cellule. - Interrompere la digestione aggiungendo 3 mL di MM contenente 20 μM Y27632. Centrifugare a 190 × g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di gfCDM contenente 20 μM Y27632 e contare le cellule. Aggiungere il volume corrispondente per 1,2 × 106 cellule (1,2 × 104 cellule per pozzetto) a 10 mL di gfCDM, che è pre-incorporato con 20 μM Y-27632, 3 μM IWR1-endo, 10 μM SB431542 e 100 nM LDN-193189 (vedere la tabella dei materiali).
- Aggiungere 100 μL di sospensione cellulare a ciascun pozzetto di pozzetti conici con fondo a 96 V. Mettere la piastra in un'incubatrice umidificata al 5% di CO2 fino al giorno 6.
NOTA: Non spostare le stoviglie per almeno 24 ore per migliorare l'aderenza degli EB.
- Dopo aver lavato le cellule con 2 mL di DPBS, aggiungere 0,5 mL di CDS (vedere la tabella dei materiali) contenente 20 μM Y27632 al pozzetto. Incubare per 3 minuti a 37 °C in incubatore umidificato al 5% di CO2 .
- Giorno 6 - Induzione della retina
- Il giorno 6, aggiungere 10 mL di gfCDM contenente 55 ng/mL di BMP4 per consentire un cambio completo del terreno di coltura sugli EB. Rimettere la piastra nell'incubatrice.
NOTA: Pipettare verso le pareti del pozzetto conico con fondo a 96 V per evitare bolle d'aria. Evitare di prendere organoidi quando si cambia il terreno. - Effettuare il cambio semi-medio il giorno 9, il giorno 12 e il giorno 15. Sostituire metà del terreno con gfCDM fresco per diluire gradualmente il BMP4.
- Il giorno 6, aggiungere 10 mL di gfCDM contenente 55 ng/mL di BMP4 per consentire un cambio completo del terreno di coltura sugli EB. Rimettere la piastra nell'incubatrice.
- Giorno 18 - Cultura NR a lungo termine
- Il giorno 18, trasferire con cura gli EB formati in provette da centrifuga da 15 mL utilizzando pipette Pasteur da 5 mL e risciacquare delicatamente con NRDM. Trasferire gli EB su piastre a 6 o 24 pozzetti a basso adsorbimento (vedere la tabella dei materiali). Rimettere la piastra nell'incubatrice.
- Sostituire il terreno con NRDM fresco ogni 3 giorni.
NOTA: Spegnere la luce durante il cambio del fluido perché l'AR è sensibile alla luce. Rimuovere gli organoidi mal differenziati e separare gli organoidi aderenti al microscopio.
4. Analisi delle NR umane
- Montaggio degli RO
- Selezionare diverse generazioni di H9-ESC per indurre tre lotti di RO.
NOTA: Per valutare il tasso di successo dell'induzione, vengono calcolate tre piastre del numero di NR di formatura per ciascuno dei tre metodi valutati (Kuwahara et al.12, Döpper et al.27 e il metodo modificato nel presente studio). L'induzione è considerata efficace se la microscopia ottica rivela la formazione di strutture simili a quelle neuroepiteliali al giorno 30.
- Selezionare diverse generazioni di H9-ESC per indurre tre lotti di RO.
- Colorazione immunofluorescente di RO
- Trasferire 3-5 RO in provette da 1,5 mL. Pipettare il terreno in eccesso e lavare gli RO una volta con 1 mL di DPBS a RT. Lasciare che gli RO affondino e rimuovere con cautela i DPBS. Aggiungere 1 mL di paraformaldeide al 4% (vedere la tabella dei materiali) per provetta da 1,5 mL e fissare a 4 °C.
NOTA: RO il giorno 6 e il giorno 18, fissare 2 ore. Fissare per 12 ore il giorno 30 e 14 ore il giorno 60. - Dopo la fissazione, disidratare con alcool a gradiente. Lasciare riposare gli RO per 15 minuti ciascuno con alcol al 50%, 60% e 70% e successivamente per 10 minuti ciascuno con alcol all'80%, 90%, 95%, 100% e 100%. Quindi, aggiungere una miscela 1:1 di alcol al 100% e xilene per 10 minuti, seguita da xilene due volte per 10 minuti ciascuna.
- Posizionare gli RO in stampi metallici riempiti di paraplasto fuso (vedi Tabella dei materiali) per 40 minuti, quindi spegnere gli stampi su ghiaccio per fissare gli RO. Posizionare le scatole da incasso negli stampi e congelarle a -20 °C per una notte. Successivamente, staccare con cautela le scatole da incasso. Infine, conservali presso RT.
- Creare sezioni continue (spessore 5 μm) con un'affettatrice per paraffina. Fissare le fette sui vetrini del microscopio di adesione, asciugarle e conservarle a RT.
- Eseguire la deceratura e la reidratazione prima della riparazione dell'antigene12,27.
- Aggiungere 10 mL di soluzione per il recupero dell'antigene citrato 20x pH 6,0 (vedere la tabella dei materiali) a 190 mL di ddH2O (H2O a doppia distillazione). Scaldare nel microonde in modalità alta per 4 minuti fino all'ebollizione. Dopo aver aggiunto le sezioni di paraffina, riscaldare le sezioni in modalità bassa per 20 minuti per completare la riparazione dell'antigene.
- Lasciare raffreddare naturalmente le sezioni di paraffina in un'area ventilata e poi metterle in una camera umida.
- Usa un pap pen (vedi Tabella dei materiali) per delineare le sezioni. Incubare con Triton X-100 allo 0,2% a RT per 30 minuti per rompere le membrane, quindi lavare i vetrini tre volte con TPBS, per 5 minuti ciascuno.
- Bloccare con siero d'asina al 10% diluito in DPBS a RT per 1 ora in camera umida con 10 μL per area di colorazione.
- Aggiungere gli anticorpi primari diluiti in siero d'asina al 10%. Incubare per una notte a 4 °C in camera umida. Lavare i campioni tre volte con TPBS per 10 minuti ciascuno per rimuovere l'anticorpo non legato.
NOTA: Gli anticorpi primari sono i seguenti: anti-PAX6 (1: 250), anti-SOX2 (1: 200), anti-KI67 (1: 200), anti-CHX10 (1: 200), anti-β tubulina III (1: 250) e anti-NESTIN (1: 200) (vedi Tabella dei materiali). - Incubare con anticorpi secondari diluiti in DPBS per 1 ora a RT in camera umidificata. Ripetere la fase di lavaggio con TPBS tre volte per 10 minuti ciascuna.
NOTA: Tenere al buio per evitare l'estinzione dell'anticorpo secondario fluorescente. Gli anticorpi secondari sono Alexa Fluor 488 coniugato con IgG anti-topo asino e Alexa Fluor 568 coniugato con IgG anti-coniglio asino ad una diluizione di 1:400 (vedi Tabella dei materiali). - Incubare con DPBS contenente DAPI (1: 500; vedere la tabella dei materiali) per 10 minuti a RT al buio. Lavare tre volte con TPBS per 10 minuti ciascuna.
- Far cadere una quantità adeguata di sigillante antifluorescente (vedere la tabella dei materiali) sul vetrino e coprire con i vetrini di copertura.
- Visualizzare utilizzando un analizzatore quantitativo di cellule tissutali a flusso (vedere la tabella dei materiali) o simile.
- Conservare i vetrini a -20 °C al buio dopo l'analisi microscopica.
- Trasferire 3-5 RO in provette da 1,5 mL. Pipettare il terreno in eccesso e lavare gli RO una volta con 1 mL di DPBS a RT. Lasciare che gli RO affondino e rimuovere con cautela i DPBS. Aggiungere 1 mL di paraformaldeide al 4% (vedere la tabella dei materiali) per provetta da 1,5 mL e fissare a 4 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Una panoramica grafica del protocollo modificato è mostrata nella Figura 1. Le H9-ESC sono state utilizzate per generare RO quando le cellule sono state cresciute fino a una densità del 70%-80%. Sospensioni a cella singola di H9-ESC in 96 pozzetti conici con fondo a V si sono aggregate il giorno 1 e hanno formato EB rotondi ben circoscritti entro il giorno 6. Con l'aumentare del tempo di coltura, il volume degli EB è aumentato gradualmente. Il giorno 30, le strutture simili a neuroepiteliali erano chiaramente formate e ispessite durante la differenziazione NR a lungo termine.
Inoltre, il metodo modificato è stato confrontato con altri due metodi (Kuwahara et al.12 e Döpper et al.27) per valutarne la ripetibilità e l'efficienza (Figura 1 supplementare). Questo studio ha anche osservato che la morfologia degli EB il giorno 1 dopo il metodo modificato era leggermente peggiore rispetto agli altri due metodi. Tuttavia, le strutture neuroepiteliali che si sono formate utilizzando il metodo modificato erano più continue il giorno 18 (Figura 2). Il giorno 30, i primi NR ottenuti utilizzando il metodo modificato erano simili per forma e dimensioni e mostravano una forma rotonda regolare (Figura 3). Rispetto agli altri due metodi, i NR formati dal metodo modificato hanno avuto una minore incidenza di vescicolazione e adesione. Inoltre, sulla base delle H9-ESC, il tasso di successo della generazione di NR utilizzando il metodo modificato è aumentato all'87,39% dal 26,9% e dal 69,24% dei metodi di Kuwahara et al. e Döpper et al.12,27, rispettivamente (Figura 3M).
La colorazione in immunofluorescenza è stata eseguita su sezioni dei NR incluse in paraffina per valutare l'espressione di marcatori correlati allo sviluppo della retina (Figura 4). I risultati hanno mostrato l'espressione di geni umani associati alla retina nelle NR derivate da H9-ESC utilizzando un metodo modificato. Il primo sottotipo di cellula a comparire è la cellula gangliare retinica, che si è accumulata principalmente sul lato basale delle NR. La colorazione TUJ1 è stata utilizzata per identificare gli assoni delle cellule gangliari retiniche (Figura 4I-L). Inoltre, sono stati rilevati marcatori di cellule progenitrici retiniche sia nello strato interno (PAX6+) che in quello esterno (CHX10+) (Figura 4A-H). Le cellule positive per il marcatore di proliferazione KI67 sono state distribuite nello strato esterno (Figura 4A-D).
Figura 1: Panoramica schematica. La panoramica schematica del protocollo di coltura modificato mostra l'aggiunta di diversi fattori in punti temporali specifici e le immagini rappresentative dello sviluppo della retina neurale. SFEBq: coltura galleggiante senza siero di aggregati embrioidi simili a corpi con rapida riaggregazione; KSR: sostituzione del siero knockout; gfCDM: terreno chimicamente definito privo di fattori di crescita; NRDM: mezzo di differenziamento della retina neurale; BMP4: proteina morfogenetica ossea 4.Barre di scala: 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Le immagini rappresentative in campo chiaro degli organoidi retinici derivate da tre diversi protocolli nella fase iniziale. Il giorno 1, solo il metodo modificato non è stato eseguito dagli EB (A,E,I). Il giorno 6, gli EB si sono formati in tutti e tre i metodi (B,F,J). Il giorno 18, si sono formate le prime retine neurali ed è stata trovata una morfologia diversa tra i tre metodi di induzione (C,G,K). Il giorno 21, la retina neurale generata dal metodo modificato ha mostrato una struttura neuroepiteliale continua (D,H,L). Barre graduate: 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Retina neurale 3D matura in coltura in sospensione ai giorni 30, 45, 60. Il giorno 30, la retina neurale si è formata in tutti e tre i metodi (A,E,I). Le frecce indicano le strutture cistiche nel metodo di Kuwahara et al. (B). I riquadri bianchi tratteggiati rappresentano la regione di adesione e fusione degli organoidi l'uno all'altro (D,F,H). Gli organoidi retinici generati dal protocollo modificato sono simili per dimensioni e morfologia rispetto agli altri due metodi (C,G,J,K,L). Barre graduate: 100 μm (bianche); 200 μm (nero). Grafico statistico del tasso di successo dell'induzione con i tre metodi che utilizzano H9-ESC (M). L'analisi unidirezionale della varianza è stata utilizzata per testare la significatività (le barre di errore mostrano l'errore standard, n = 864, **P < 0,01, ***P < 0,001). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Caratterizzazione della retina neurale nel protocollo modificato. Immagini immunocoloranti della retina neurale al giorno 6, giorno 18, giorno 30 e giorno 60. Le colorazioni verdi sono per KI67 (cellula proliferante), PAX6 (cellula progenitrice retinica) e NESTIN (cellula staminale neurale). Le colorazioni rosse sono per CHX10 (cellula progenitrice retinica), SOX2 (cellula progenitrice neurale) e TUJ1 (cellula gangliare retinica). Barre graduate: 100 μm (A,B,E,F,I,J); 200 μm (C,D,G,H,K,L). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 1 supplementare: Confronto dei diagrammi di flusso per i tre protocolli di induzione degli organoidi retinici. SFEBq: coltura galleggiante senza siero di aggregati embrioidi simili a corpi con rapida riaggregazione; KSR: sostituzione del siero knockout; gfCDM: terreno chimicamente definito privo di fattori di crescita; NRDM: mezzo di differenziamento della retina neurale; BMP4: proteina morfogenetica ossea 4. Fare clic qui per scaricare il file.
Figura 2 supplementare: La morfologia del corpo embrioide (EB) indotta dal metodo di Kuwaharaet al. La comparsa graduale di grumi di cellule morte è stata osservata intorno agli EB dopo l'aggiunta di BMP4 il giorno 6 (A-D, frecce nere). Sono state osservate grandi differenze morfologiche, dopo il giorno 6 (E-L), e alcuni EB erano addirittura completamente inattivati (H,L). ESC: cellula staminale embrionale, PBMC: cellula mononucleata del sangue periferico, IPSC: cellula staminale pluripotente indotta. Barre graduate: 200 μm. Clicca qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gli RO umani possono ricapitolare spazialmente e temporalmente lo sviluppo della retina fetale e i RO precoci mostrano un alto grado di somiglianza con la retina fetale a stadi equivalenti di sviluppo15. In termini di morfologia tissutale ed espressione molecolare, l'RO umana rispecchia da vicino l'effettivo stato di crescita del tessuto retinico, offrendo opportunità straordinarie e senza precedenti nei campi della modellazione delle malattie, dello screening dei farmaci e della medicina rigenerativa. Attualmente, sono stati stabiliti diversi metodi per generare RO da PSC umane in vitro e sono in corso continue modifiche e ottimizzazioni per migliorare ulteriormente l'efficienza9. Il laboratorio Sasai ha riportato per la prima volta la generazione di RO derivate da PSC da ESC umane11. Le ESC umane sono state prima preparate in sospensioni a singola cellula, quindi un numero uguale di cellule è stato seminato in 96 pozzetti conici con fondo a V, con una rapida aggregazione per formare EB di tipo circolare. L'aggiunta esterna di vie di segnalazione cellulari chiave ha promosso la formazione di vescicole ottiche negli EB, che successivamente sono maturate in RO laminate in coltura in sospensione. Il NR contiene un tipo di cellule gliali e sei diversi tipi di cellule neuronali, che rappresentano molti aspetti dello sviluppo della retina, come la morfogenesi cellulare, la differenziazione neuronale e la polarità apicale-basale9. Sebbene solo il 10% degli aggregati formasse una struttura a coppa ottica a doppia parete, questa è stata una pietra miliare nell'evoluzione della produzione di RO più avanzati11.
Successivamente, Zhong et al. hanno introdotto una nuova alternativa, in cui le hiPSC sono state prima cresciute vicino alle confluenze, seguite dalla disintegrazione chimica o meccanica in piccoli aggregati galleggianti13. Quindi, i piccoli aggregati hanno formato EB in coltura in sospensione, che si sono staccati separatamente dal fondo della placca, differenziandosi ulteriormente nella direzione neurale. Zhong et al. hanno dimostrato una retina 3D completamente laminata con segmenti esterni di fotorecettori relativamente ben sviluppati che hanno risposto alla stimolazione luminosa. Questo metodo richiedeva una minore regolazione esterna delle vie di segnalazione cellulare ed è stato eseguito principalmente in modo auto-diretto9. La terza rivoluzione tecnologica è stata l'introduzione del metodo di incorporamento da parte del gruppo Lowe25. Ciò ha comportato l'incorporazione di aggregati hESC nell'ECM per formare una struttura epiteliale a lume singolo. Dopo la dispersione enzimatica, gli aggregati sono stati mantenuti in una coltura in sospensione per formare RO maturi. Sebbene tutti e tre i metodi siano in grado di indurre con successo RO con struttura e funzione comparabili, le applicazioni su larga scala presentano lo svantaggio di essere laboriose e dispendiose in termini di tempo a causa della loro elevata eterogeneità e del basso tasso di successo23.
Oltre ai metodi di cui sopra, Kuwahara et al. hanno proposto un nuovo metodo di induzione, vale a dire il metodo di declino del gradiente del fattore chiave12. Hanno scoperto che NR potrebbe essere generato dall'aggiunta di BMP4 a concentrazione decrescente dal giorno 6. Questo sistema di induzione ha utilizzato un minor numero di fattori esterni per formare RO con una maggiore uniformità di dimensioni e morfologia. Tuttavia, gli studi hanno riportato che gli EB formati erano inclini a lesioni cistiche e il tasso di successo dell'induzione di questo metodo è stato di circa il 40%12,28. Döpper et al. hanno modificato questo protocollo per migliorare il tasso di successo combinando un mezzo commerciale con tre inibitori di piccole molecole nella fase iniziale dell'induzione per stabilizzare gli EB27. Al contrario, le cellule dell'epitelio neurale della retina aderiscono più facilmente l'una all'altra, rendendo necessaria una coltura separata di ciascun RO durante la coltura in sospensione a lungo termine. Il metodo di Döpper et al. aumenta le complicanze e i costi delle operazioni sperimentali e non è adatto per l'induzione su larga scala27. Il protocollo di produzione RO ottimizzato ha migliorato l'efficienza dell'induzione. L'attuale metodo modificato è stato confrontato con i metodi di Kuwahara et al. e Döpper et al.
Questo studio ha dimostrato che sia i metodi di Kuwahara et al. che quelli di Döpper et al. hanno formato EB con bordi lisci il giorno 1, mentre l'attuale metodo modificato ha richiesto un tempo relativamente lungo per formare EB, approssimativamente fino al giorno 6. Il volume degli EB ottenuti con il metodo di Kuwahara et al. era maggiore di quello ottenuto con il metodo di Döpper et al., e gli EB ottenuti con il metodo di Döpper et al. mostravano una maggiore fluidità sotto il flusso del liquido. In particolare, i grumi di cellule morte sono apparsi gradualmente intorno agli EB dopo l'aggiunta di BMP4 il giorno 6 quando si utilizzava il metodo di Kuwahara et al. (Figura supplementare 2). Entro il giorno 18, sono state osservate differenze morfologiche significative negli EB del metodo di Kuwahara et al. e alcuni EB erano completamente inattivati (Figura 2 supplementare). Nel metodo di Döpper et al., la maggior parte degli EB erano arrotondati e ben circoscritti, e mostravano solo un piccolo numero di cellule morte sparse intorno a loro. Il metodo modificato ha formato EB stretti e ben strutturati con lievi differenze morfologiche, e sono state osservate alcune cellule morte intorno ad esse.
Inoltre, questo studio ha anche scoperto che alcuni EB hanno generato vescicole da Kuwahara et al. nella fase iniziale successiva al trasferimento a piastre a 6 pozzetti, con conseguente mancata formazione di RO. L'adesione e la fusione delle RO si sono verificate intorno al 40° giorno, il che ha diminuito significativamente l'utilità degli esperimenti. Il sistema di coltura del metodo di Döpper et al. è più complicato e richiede più passaggi operativi e costi più elevati rispetto al metodo di Kuwahara et al. La maggior parte degli RO di Döpper et al. ha anche inevitabilmente sviluppato aderenze e fusioni tra loro. Il metodo modificato in questo studio ha generato con successo NR 3D in vitro che esprimevano i marcatori correlati alla retina umana CHX10, KI67, PAX6, SOX2, TUJ1 e NESTIN. E la maggior parte degli RO con il metodo modificato erano coerenti nelle dimensioni e nella morfologia, e pochissime vescicole o aderenze si sono sviluppate durante le ultime fasi della differenziazione retinica.
Rispetto agli altri due metodi, il nuovo sistema di coltura presentava passaggi operativi più semplici e costi inferiori. Il passaggio critico nel metodo modificato consiste nell'aggiungere tre piccoli inibitori molecolari nel terreno e garantire che la piastra non venga spostata per i primi sei giorni per stabilizzare la struttura degli EB. Il movimento delle placche o qualsiasi manipolazione cellulare nella fase iniziale potrebbe influenzare la formazione di EB. Rispetto agli altri due metodi, il metodo modificato non ha modificato il terreno il giorno 1 e ha anche ridotto l'uso di inibitori di piccole molecole il giorno 15. In breve, le fasi operative del metodo modificato sono semplificate in una certa misura e il costo sperimentale viene risparmiato con un minor uso di terreni e reagenti. Tuttavia, il metodo modificato non è ancora in grado di risolvere i problemi comuni dell'attuale sistema di coltura degli organoidi. Inoltre, l'efficienza di induzione degli RO dipende in gran parte dalla qualità e dalla capacità di differenziazione delle hPSC. In questo studio, è stata completamente calcolata solo l'efficienza della generazione di NR utilizzando H9-ESC. Abbiamo indotto con successo RO in diverse linee di hPSC con il nuovo metodo nel presente studio e abbiamo ottenuto la stessa efficienza di induzione, tra cui H9, H1 e PBMC-iPSC. Non vi è alcuna differenza statistica nell'efficienza di induzione tra le tre linee cellulari. In futuro, ulteriori studi dovranno esplorare l'efficienza di induzione di diverse hPSC utilizzando questo metodo.
In conclusione, il protocollo di induzione retinica ottimizzato è semplice ed economico, ha un'elevata ripetibilità ed efficienza, offre promettenti modelli personalizzati di malattie retiniche e fornisce un'abbondante fonte di cellule per la terapia cellulare, lo screening farmacologico e i test di terapia genica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Nessuno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Washing slices |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101-500ML | Fix retinal organoids |
| 5 mL Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318516 | Pipette retinal organoids |
| 96 V-bottomed conical wells | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | Fix slices |
| AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | Medium |
| Anhydrous ethanol | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrate |
| Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Primary antibody |
| Antifade Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
| Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Primary antibody |
| Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Primary antibody |
| Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) | Beyotime | AT809 | Primary antibody |
| Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Primary antibody |
| Cell dissociation solution(CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | Cell dissociation |
| CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β inhibitor |
| Cholesterol Lipid Concentrate | Gibco | 12531018 | 250× |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | Servicebio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
| CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | Cell Freezing Medium |
| DAPI | Roche | 10236276001 | Nuclear counterstain |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
| DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Secondary Antibody |
| Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Secondary Antibody |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation |
| Extracellular matrix (ECM) | Corning | 354277 | Coating plates |
| F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Medium |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A5669701 | |
| Flow-like tissue cell quantitative analyzer | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Scan sections |
| IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
| IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-inhibitor |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-inhibitor |
| Low-adhesion 24-well Plates | Corning | 3473 | |
| Low-adhesion 6-well Plates | Corning | 3471 | |
| Maintenance medium (MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | Medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking buffer |
| Paraplast | Leica | 39601006 | Tissue embedding |
| PBS pH 7.4 basic (1x) | Gibco | C10010500BT | Without Ca+,Mg+ |
| Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) | R&D | 314-BP | Key protein factor |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Powder, keep out of light |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5-inhibitor |
| SU5402 | Selleckchem | S7667 | Tyrosine kinase inhibitor |
| Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
| Taurine | Sigma | T0625-10G | |
| Thioglycerol | Sigma | M1753 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilization |
| WA09 embryonic stem cell line | WiCell Research Institute | Cell line | |
| Xylene | SINOPHARM | 10023418 | Dewaxing |
| Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-inhibitor |
References
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina,, Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
- Steinmetz, J. D., et al. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
- Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).
- Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).
- Peng, Y. R., et al. Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina. Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).
- Ribeiro, J., et al. Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors. Cell Rep. 35 (3), 109022 (2021).
- Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
- Manafi, N., et al. Organoids and organ chips in ophthalmology. Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Kuwahara, A., et al. Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nat Commun. 6, 6286 (2015).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nat Commun. 5, 4047 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Li, H., et al. Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids. FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).
- Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
- Mandai, M. Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review. Regen Ther. 22, 59-67 (2023).
- Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. 3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer. Cell Biosci. 12 (1), 39 (2022).
- Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 9, 640212 (2021).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
- Sanjurjo-Soriano, C., et al. RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478 (2022).
- Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation. Front Cell Neurosci. 15, 638439 (2021).
- Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
- Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Yamasaki, S., et al. Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture. Regen Ther. 19, 24-34 (2022).
- Döpper, H., et al. Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120 (2020).
- Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535 (2021).
