Summary
Le présent protocole décrit un système optimisé d’induction neuronale de la rétine en 3D qui réduit l’adhésion et la fusion des organoïdes rétiniens avec une répétabilité et une efficacité élevées.
Abstract
La rétinopathie est l’une des principales causes de cécité dans le monde. L’étude de sa pathogenèse est essentielle pour le diagnostic précoce et le traitement rapide de la rétinopathie. Malheureusement, des obstacles éthiques entravent la collecte de preuves auprès des humains. Récemment, de nombreuses études ont montré que les cellules souches pluripotentes humaines (CSP) peuvent être différenciées en organoïdes rétiniens (OI) à l’aide de différents protocoles d’induction, qui ont un énorme potentiel dans la rétinopathie pour la modélisation de la maladie, le criblage de médicaments et les thérapies à base de cellules souches. Cette étude décrit un protocole d’induction optimisé pour générer une rétine neurale (NR) qui réduit considérablement la probabilité de vésiculation et de fusion, augmentant ainsi le taux de réussite de la production jusqu’au 60e jour. Basée sur la capacité des CSP à s’auto-réorganiser après dissociation, combinée à certains facteurs complémentaires, cette nouvelle méthode peut spécifiquement conduire à la différenciation des NR. De plus, l’approche est simple, rentable, présente une répétabilité et une efficacité remarquables, présente des perspectives encourageantes pour les modèles personnalisés de maladies rétiniennes et fournit un réservoir cellulaire abondant pour des applications telles que la thérapie cellulaire, le criblage de médicaments et les tests de thérapie génique.
Introduction
L’œil est la principale source d’information parmi les organes sensoriels humains, la rétine étant le principal tissu sensoriel visuel des yeux des mammifères1. La rétinopathie est l’une des principales causes mondiales de maladies oculaires, conduisant à la cécité2. Environ 2,85 millions de personnes dans le monde souffrent de divers degrés de déficience visuelle due à la rétinopathie3. Par conséquent, l’étude de sa pathogenèse est cruciale pour un diagnostic précoce et un traitement rapide. La plupart des études sur la rétinopathie humaine se sont principalement concentrées sur des modèles animaux 4,5,6. Cependant, la rétine humaine est un tissu complexe et multicouche comprenant différents types de cellules. Les systèmes traditionnels de culture cellulaire bidimensionnelle (2D) et de modèles animaux ne parviennent généralement pas à récapituler fidèlement le développement spatio-temporel normal et le métabolisme des médicaments de la rétine humaine native 7,8.
Récemment, les techniques de culture 3D ont évolué pour générer des organes ressemblant à des tissus à partir de cellules souches pluripotentes (CSP)9,10. Les organoïdes rétiniens (OI) générés à partir de CSP humaines dans un système de culture en suspension 3D contiennent non seulement sept types de cellules rétiniennes, mais présentent également une structure stratifiée distincte similaire à la rétine humaine in vivo 11,12,13. Les OI dérivées de CSP humaines ont gagné en popularité et sont largement disponibles et sont actuellement les meilleurs modèles in vitro pour étudier le développement et la maladie de la rétine humaine14,15. Au cours des dernières décennies, de nombreux chercheurs ont démontré que les CSP humaines, y compris les cellules souches embryonnaires (CSE) et les cellules souches pluripotentes induites (CSPi), peuvent se différencier en OI à l’aide de divers protocoles d’induction. Ces progrès présentent un énorme potentiel dans la rétinopathie pour la modélisation des maladies, le criblage de médicaments et les thérapies à base de cellules souches 16,17,18.
Cependant, la génération de rétine neurale (NR) à partir de cellules souches pluripotentes humaines (CSP) est un processus complexe, lourd et long. De plus, les variations d’un lot à l’autre dans les organoïdes tissulaires peuvent entraîner une reproductibilité plus faible des résultats19,20. De nombreux facteurs intrinsèques et extrinsèques peuvent influencer le rendement des organoïdes rétiniens (OI), tels que le nombre ou l’espèce de cellules de départ et l’utilisation de facteurs de transcription et de composés à petites molécules 21,22,23. Depuis que la première OI humaine a été générée par le laboratoire Sasai11, de multiples modifications ont été proposées au fil des ans pour améliorer la facilité et l’efficacité du processus d’induction 13,21,24,25. Malheureusement, à ce jour, aucun protocole de référence n’a été établi pour générer des OI dans tous les laboratoires. En effet, il existe un certain degré de divergence dans les OI résultant des différentes méthodes d’induction, ainsi qu’une grande variation dans l’expression des marqueurs rétiniens et la robustesse de leur structure22,26. Ces problèmes peuvent compliquer considérablement la collecte des échantillons et l’interprétation des résultats de l’étude. Par conséquent, un protocole de différenciation plus consolidé et plus robuste est nécessaire pour maximiser l’efficacité avec une hétérogénéité minimale de la génération d’OI.
Cette étude décrit un protocole d’induction optimisé basé sur une combinaison de Kuwahara et al.12 et Döpper et al.27 avec des instructions détaillées. La nouvelle méthode réduit considérablement la probabilité de vésiculation et de fusion des organoïdes, augmentant ainsi le taux de réussite de la génération de NR. Ce développement est très prometteur pour la modélisation des maladies, le criblage de médicaments et les applications de thérapie cellulaire pour les troubles rétiniens.
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Protocol
Cette étude a été menée conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki et approuvée par le Comité d’éthique institutionnel de l’hôpital général de l’APL chinoise. La gamme WA09 (H9) ESC a été obtenue auprès de l’Institut de recherche WiCell.
1. Préparation des milieux de culture et des réactifs
- Milieu de culture ESC humain et solution de passage
- Milieu d’entretien (MM) : Préparer 500 mL de MM complet (milieu de base + supplément 5x ; voir le tableau des matériaux) de manière aseptique. Décongeler 5x supplément à température ambiante (RT) ou toute la nuit à 2-8 °C. Bien mélanger avant utilisation jusqu’à ce que le supplément soit exempt de trouble.
- Matrice extracellulaire (MEC) à 1 % : Utiliser une pointe de pipette pré-refroidie et des tubes stériles pour distribuer 200 μL d’ECM (voir le tableau des matériaux) par tube sur de la glace. Conservez les tubes dans un congélateur à -20 °C. Faire fondre l’ECM sur de la glace et diluer avec du DMEM/F12 pré-refroidi à 1 :100.
- pH de 0,5 mM = 8,0 EDTA : Pour préparer 500 mL d’EDTA 0,5 mM, ajouter 500 μL d’EDTA 0,5 M et 0,9 g de NaCl à 500 mL de 1 solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) (voir le tableau des matières). Bien mélanger et conserver à 2-8 °C.
- Milieu de différenciation rétinienne
- Milieu chimiquement défini sans facteur de croissance (gfCDM) : Préparez le gfCDM en combinant 45 % de milieu Dulbecco’s modifié d’Iscove-GlutaMAX (IMDM-GlutaMAX), 45 % de F12-GlutaMAX de Ham (F12-Glutamax), 10 % de remplacement de sérum knockout (KSR), 1 % de concentré lipidique de cholestérol et 450 μM de thioglycérol (voir le tableau des matériaux).
- Composés à petites molécules
- Y-27632 2HCl : Ajouter 50 mg de poudre d’Y-27632 à 3,122 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO). Distribuer et stocker l’Y-27632 (voir Tableau des matériaux) à une concentration de 50 mM à -80 °C pendant 2 ans, à l’abri de la lumière. Diluer la mère 2 500 fois (20 μM) pour l’utiliser, ce qui équivaut à 0,4 μL d’Y-27632 par mL de gfCDM.
- IWR1-endo : Ajouter 2,4424 mL de DMSO pour dissoudre 10 mg d’IWR1-endo (voir le tableau des matériaux) pour obtenir une solution mère de 10 mM. Distribuez les aliquotes et conservez-les à -80 °C jusqu’à 2 ans. Ajouter 0,3 μL de 10 mM IWR1-endo par mL de gfCDM pour la concentration de 3 μM pour l’induction.
- SB431542 : Pour préparer 50 mM de SB431542, ajouter 10 mg de SB431542 (voir le tableau des matières) à 0,5203 mL de DMSO et bien mélanger. Conserver à -80 °C dans un solvant pendant 2 ans maximum. Pour la préparation de SB431542 à une concentration de travail de 10 μM, ajouter 2 μL de la solution mère à 50 mM à 10 mL de gfCDM.
- LDN-193189 2HCl : Dissoudre 5 mg de LDN-193189 2HCl (voir le tableau des matériaux) dans 10,4297 mL de DMSO pour obtenir 1 mM de solution mère. Conserver à -20 °C ou -80 °C (selon les recommandations du fabricant). Ajouter 0,1 μL de la mère à chaque 10 mL de gfCDM, ce qui donne 100 nM de LDN-193189 pour l’induction.
- Protéine morphogénétique osseuse humaine recombinante 4 (BMP4) : Reconstituer à 50-200 μg/mL dans 4 mM de HCl (voir le tableau des matériaux). Conserver entre 2 °C et 8 °C pendant 1 mois ou -20 °C pendant 1 an après reconstitution. Effectuer l’induction du NR à l’aide de 1,5 nM BMP4.
- Milieu de culture NR à long terme
- Acide rétinoïque (AR) : Mesurer 6 mg de poudre de RA (voir le tableau des matières) et ajouter à 3,9941 mL de DMSO. Conserver dans des aliquotes de 5 mM à −80 °C et utiliser dans les 3 mois. Pour obtenir une concentration de travail de 0,5 μM, ajoutez 10 μL du mélange principal à 100 ml de milieu de différenciation neurale de la rétine (NRDM). Ajouter juste avant utilisation.
REMARQUE : Tenir à l’abri de la lumière pendant la préparation et le stockage. - Taurine : Ajouter de la poudre de taurine (voir le tableau des matières) pesant 200 mg à 7,9904 mL de DMSO pour obtenir une solution mère de 200 mM. Distribuer et conserver entre 2 et 8 °C. Une concentration de travail de 0,1 mM de taurine est obtenue en ajoutant 50 μL de solution mère pour 100 mL de NRDM.
- NRDM : Composer le NRDM avec du milieu DMEM/F12-GlutaMAX, un supplément de 1 % de N2, 10 % de sérum de bovin fœtal, 0,5 mM de RA et 0,1 mM de taurine (voir le tableau des matières). Conserver à 2-8 °C jusqu’à 2 semaines ou 6 mois à -20 °C pour assurer l’activité des composants.
- Acide rétinoïque (AR) : Mesurer 6 mg de poudre de RA (voir le tableau des matières) et ajouter à 3,9941 mL de DMSO. Conserver dans des aliquotes de 5 mM à −80 °C et utiliser dans les 3 mois. Pour obtenir une concentration de travail de 0,5 μM, ajoutez 10 μL du mélange principal à 100 ml de milieu de différenciation neurale de la rétine (NRDM). Ajouter juste avant utilisation.
- Tampon de blocage : Diluer 1 :9 avec du DPBS pour obtenir une solution de travail à 10 % à utiliser (voir le tableau des matériaux). Conserver à -20 °C jusqu’à 5 ans.
REMARQUE : Effectuer toutes les autres procédures dans une enceinte de sécurité biologique de classe II pour assurer la stérilité, à l’exception de la pesée. Si l’ajout de réactifs pesés pendant le processus de préparation est nécessaire, utilisez des filtres de 0,22 μm pour la filtration.
2. Culture des CSE-H9
- Dégel des CSE-H9
- Ajouter 1 mL de MEC à 1 % dans chaque puits d’une plaque à 6 puits. Incuber pendant 1 h dans un incubateur à 37 °C dans une atmosphère à 5% de CO2 .
REMARQUE : Évitez d’ajouter de l’ECM le long des parois du puits, car il pourrait coller à la surface. - Prélever un stock cryovial H9-ESC dans le réservoir d’azote liquide et le secouer rapidement dans de l’eau à 37 °C pendant 30 s.
REMARQUE : Ne laissez pas le flacon décongeler complètement. - Retirez le flacon et stérilisez-le soigneusement à l’aide d’un spray d’alcool désinfectant à 75 %. Ajouter le H9-ESC décongelé du cryoflacon dans un tube de 15 mL contenant 9 mL de MM avec 10 μM d’Y-27632.
- Centrifuger le tube à 190 × g pendant 5 min à RT. Retirer délicatement la majeure partie du surnageant avec une pipette de 1 mL, en laissant environ 50 μL de surnageant pour éviter la perte de cellules.
- Ajouter 1 mL de MM contenant 10 μM de Y27632 au sédiment cellulaire et remettre doucement le sédiment cellulaire en suspension avec une pipette de 1 mL en pipetant de haut en bas 5 à 10 fois.
- Retirez le revêtement ECM après 1 h d’incubation. Ajouter 2 mL de MM préchauffé contenant 10 μM d’Y-27632 dans chaque puits.
- Distribuer 0,5 mL de suspension cellulaire par puits. Secouez doucement la plaque latéralement pour assurer une répartition uniforme des cellules.
- Incuber la plaque à 37 °C sous 5% de CO2 pendant au moins 24 h sans la toucher.
- Changez de milieu tous les jours. Lorsque la densité de clones atteint 70 % et plus, le passage est nécessaire.
- Ajouter 1 mL de MEC à 1 % dans chaque puits d’une plaque à 6 puits. Incuber pendant 1 h dans un incubateur à 37 °C dans une atmosphère à 5% de CO2 .
- Passage des H9-ESC
- Préparez la plaque revêtue d’ECM comme décrit ci-dessus (étape 2.1.1) et ajoutez 2 mL de MM par puits.
- Retirez le milieu usé des plaques à 6 puits. Lavez chaque puits deux fois avec 1 mL de DPBS.
- Lavez chaque puits deux fois en ajoutant lentement 1 mL d’EDTA et en incubant avec 1 mL d’EDTA pendant 4 à 7 min à RT.
REMARQUE : Pendant l’incubation, examiner la plaque à 6 puits pendant 3 minutes au microscope. Passez immédiatement à l’étape suivante si la plupart des cellules sont sur le point de se détacher de la boîte. Évitez l’incubation prolongée pour réduire l’impact négatif sur les cellules. - Jeter l’EDTA et ajouter 1 mL de MM pour interrompre la digestion.
- Tapotez doucement la plaque de puits jusqu’à ce que la majorité des cellules soient détachées.
- Transvaser délicatement la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 mL à l’aide d’une pipette de 5 mL. Remettez doucement en suspension les colonies H9-ESC de haut en bas 3 à 5 fois pour les mélanger avec une pitette Pasteur. Transférez 20 à 100 μL de suspension cellulaire dans une nouvelle boîte de culture à 6 puits recouverte d’ECM et agitez-la d’avant en arrière.
- Lorsque la densité cellulaire est jugée suffisante au microscope, incuber la plaque à 37 °C sous 5 % de CO2 pendant au moins 24 h sans la toucher.
- Changez de support tous les jours. À 70 % de densité de clones et plus, le passage est nécessaire.
3. Génération de NR humains
REMARQUE : Une fois que les colonies atteignent une confluence d’environ 70 %, elles peuvent être dirigées vers la différenciation en organoïdes rétiniens (OI) en utilisant les étapes procédurales décrites à la figure 1.
- Jour 0 - Formation du corps embryoïde (EB)
- Après avoir lavé les cellules avec 2 mL de DPBS, ajouter 0,5 mL de CDS (voir le tableau des matières) contenant 20 μM Y27632 dans le puits. Incuber pendant 3 min à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 .
REMARQUE : Vérifiez au microscope. Réduisez au maximum le temps d’incubation pour éviter les effets néfastes sur les cellules. - Abandonner la digestion en ajoutant 3 mL de MM contenant 20 μM Y27632. Centrifuger à 190 × g pendant 5 min et jeter le surnageant.
- Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 1 mL de gfCDM contenant 20 μM d’Y27632 et compter les cellules. Ajouter le volume correspondant pour 1,2 × 106 cellules (1,2 × 104 cellules par puits) à 10 mL de gfCDM, qui est pré-incorporé avec 20 μM Y-27632, 3 μM IWR1-endo, 10 μM SB431542 et 100 nM LDN-193189 (voir le tableau des matériaux).
- Ajouter 100 μL de suspension cellulaire dans chaque puits de 96 puits coniques à fond en V. Placez la plaque dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 jusqu’au jour 6.
REMARQUE : Ne déplacez pas les plats pendant au moins 24 heures pour améliorer l’adhérence des EB.
- Après avoir lavé les cellules avec 2 mL de DPBS, ajouter 0,5 mL de CDS (voir le tableau des matières) contenant 20 μM Y27632 dans le puits. Incuber pendant 3 min à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 .
- Jour 6 - Induction de la rétine
- Le jour 6, ajouter 10 mL de gfCDM contenant 55 ng/mL de BMP4 pour permettre un changement complet du milieu de culture sur les EB. Remettez la plaque dans l’incubateur.
REMARQUE : Pipeter vers les parois du puits conique à fond en V 96 pour éviter les bulles d’air. Évitez de prendre des organoïdes lors du changement de milieu. - Effectuez un changement mi-moyen le jour 9, le jour 12 et le jour 15. Remplacez la moitié du milieu par du gfCDM frais pour diluer progressivement le BMP4.
- Le jour 6, ajouter 10 mL de gfCDM contenant 55 ng/mL de BMP4 pour permettre un changement complet du milieu de culture sur les EB. Remettez la plaque dans l’incubateur.
- Jour 18 - Culture NR à long terme
- Le jour 18, transférez soigneusement les EB formés dans des tubes à centrifuger de 15 mL à l’aide de pipettes Pasteur de 5 mL et rincez à nouveau doucement avec NRDM. Transférez les EB sur des plaques à faible adsorption à 6 ou 24 puits (voir le tableau des matériaux). Remettez la plaque dans l’incubateur.
- Remplacez le milieu par du NRDM frais tous les 3 jours.
REMARQUE : Éteignez la lumière pendant le changement de médium car le RA est sensible à la lumière. Retirez les organoïdes mal différenciés et séparez les organoïdes adhérents au microscope.
4. Analyse des NR humains
- Montage des RO
- Sélectionner différentes générations de H9-ESC pour induire trois lots d’OI.
NOTE : Trois planches du nombre de NR en formation pour chacune des trois méthodes évaluées (Kuwahara et al.12, Döpper et al.27, et la méthode modifiée dans la présente étude) sont calculées pour évaluer le taux de réussite de l’induction. L’induction est considérée comme réussie si la microscopie optique révèle la formation de structures neuroépithéliales au jour 30.
- Sélectionner différentes générations de H9-ESC pour induire trois lots d’OI.
- Coloration immunofluorescente des OI
- Transférer 3 à 5 osmoses inverses dans des tubes de 1,5 ml. Pipeter l’excès de milieu et laver les OI une fois avec 1 mL de DPBS à RT. Laisser couler les OI et retirer délicatement le DPBS. Ajouter 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % (voir le tableau des matières) par tube de 1,5 mL et fixer à 4 °C.
REMARQUE : RO le jour 6 et le jour 18, correction de 2 h. Correction de 12 h le jour 30 et de 14 h le jour 60. - Après fixation, déshydrater à l’aide d’alcool dégradé. Laissez les RO reposer pendant 15 minutes chacun dans 50 %, 60 % et 70 % d’alcool, puis pendant 10 minutes chacun dans 80 %, 90 %, 95 %, 100 % et 100 % d’alcool. Ensuite, ajoutez un mélange 1 :1 d’alcool à 100 % et de xylène pendant 10 min, suivi de xylène deux fois pendant 10 min chacun.
- Placez les RO dans des moules métalliques remplis de paraplaste fondu (voir Tableau des matériaux) pendant 40 min, puis trempez les moules sur de la glace pour fixer les RO. Placez les boîtes d’enrobage dans les moules et congelez-les à -20 °C pendant la nuit. Ensuite, détachez soigneusement les boîtes d’encastrement. Enfin, stockez-les chez RT.
- Créez des sections continues (5 μm d’épaisseur) avec une trancheuse à paraffine. Fixez les tranches sur les lames de microscope à adhérence, séchez-les et stockez-les à RT.
- Effectuer le déparaffinage et la réhydratation avant la réparation de l’antigène12,27.
- Ajouter 10 mL de solution de récupération d’antigène de citrate 20x pH 6,0 (voir le tableau des matériaux) à 190 mL de ddH2O (H2O distillé deux fois). Chauffer au micro-ondes à puissance élevée pendant 4 min jusqu’à ébullition. Après avoir ajouté des sections de paraffine, chauffez les sections en mode bas pendant 20 minutes pour terminer la réparation de l’antigène.
- Laissez les sections de paraffine refroidir naturellement dans un endroit ventilé, puis placez-les dans une chambre humide.
- Utilisez un stylo Pap (voir la table des matières) pour décrire les sections. Incuber avec 0,2 % de Triton X-100 à RT pendant 30 min pour briser les membranes, puis laver les lames trois fois avec du TPBS, pendant 5 min chacune.
- Bloc avec 10 % de sérum d’ânesse dilué dans du DPBS à RT pendant 1 h dans une chambre humide avec 10 μL par zone de coloration.
- Ajouter des anticorps primaires dilués dans du sérum d’âne à 10 %. Incuber une nuit à 4 °C dans une chambre humide. Laver les échantillons trois fois avec du TPBS pendant 10 minutes chacun pour éliminer l’anticorps non lié.
REMARQUE : Les anticorps primaires sont les suivants : anti-PAX6 (1 :250), anti-SOX2 (1 :200), anti-KI67 (1 :200), anti-CHX10 (1 :200), anti-tubuline III β (1 :250) et anti-NESTIN (1 :200) (voir le tableau des matières). - Incuber avec des anticorps secondaires dilués dans du DPBS pendant 1 h à RT dans une chambre humidifiée. Répétez l’étape de lavage avec TPBS trois fois pendant 10 min chacune.
REMARQUE : Conserver dans l’obscurité pour éviter l’extinction de l’anticorps secondaire fluorescent. Les anticorps secondaires sont Alexa Fluor 488 conjugué à des IgG anti-souris d’âne et Alexa Fluor 568 conjugué à des IgG anti-lapin d’âne à une dilution de 1 :400 (voir Tableau des matières). - Incuber avec du DPBS contenant du DAPI (1 :500 ; voir Tableau des matériaux) pendant 10 min à RT dans l’obscurité. Lavez trois fois avec du TPBS pendant 10 minutes chacune.
- Déposez une quantité appropriée de scellant anti-fluorescent (voir le tableau des matériaux) sur la lame et couvrez-la de lamelles.
- Visualisez à l’aide d’un analyseur quantitatif de cellules tissulaires de type flux (voir Tableau des matériaux) ou similaire.
- Stocker les lames à -20 °C dans l’obscurité après analyse microscopique.
- Transférer 3 à 5 osmoses inverses dans des tubes de 1,5 ml. Pipeter l’excès de milieu et laver les OI une fois avec 1 mL de DPBS à RT. Laisser couler les OI et retirer délicatement le DPBS. Ajouter 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % (voir le tableau des matières) par tube de 1,5 mL et fixer à 4 °C.
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Representative Results
Une vue d’ensemble graphique du protocole modifié est présentée à la figure 1. Les H9-ESC ont été utilisés pour générer des OI lorsque les cellules ont été cultivées à une densité de 70 % à 80 %. Des suspensions unicellulaires de H9-ESC dans 96 puits coniques à fond en V se sont agrégées le jour 1 et ont formé des EB ronds bien circonscrits au jour 6. Au fur et à mesure que le temps de culture augmentait, le volume d’EB augmentait progressivement. Au jour 30, des structures neuroépithéliales étaient clairement formées et épaissies au cours de la différenciation à long terme des NR.
De plus, la méthode modifiée a été comparée à deux autres méthodes (Kuwahara et al.12 et Döpper et al.27) pour évaluer sa répétabilité et son efficacité (figure supplémentaire 1). Cette étude a également observé que la morphologie des EB au jour 1 suivant la méthode modifiée était légèrement moins bonne que dans les deux autres méthodes. Cependant, les structures neuroépithéliales qui se sont formées à l’aide de la méthode modifiée étaient plus continues au jour 18 (Figure 2). Au jour 30, les premiers NR obtenus à l’aide de la méthode modifiée étaient de forme et de taille similaires et présentaient une forme ronde régulière (Figure 3). Par rapport aux deux autres méthodes, les NR formés par la méthode modifiée présentaient une incidence plus faible de vésiculation et d’adhérence. De plus, d’après les CSE-H9, le taux de réussite de la génération de NR à l’aide de la méthode modifiée est passé de 26,9 % et 69,24 % pour les méthodes12,27 de Kuwahara et al. et de Döpper et al. (figure 3M).
Une coloration par immunofluorescence a été réalisée sur des sections des NR incluses dans la paraffine pour évaluer l’expression de marqueurs liés au développement rétinien (Figure 4). Les résultats ont montré l’expression de gènes humains associés à la rétine dans les NR dérivés de H9-ESC en utilisant une méthode modifiée. Le premier sous-type cellulaire à apparaître est la cellule ganglionnaire rétinienne, qui s’est principalement accumulée sur la face basale des NR. De plus, des marqueurs de cellules progénitrices rétiniennes ont été détectés dans les couches interne (PAX6+) et externe (CHX10+) (Figure 4A-H). Les cellules positives pour le marqueur de prolifération KI67 étaient réparties dans la couche externe (figure 4A-D).
Figure 1 : Vue d’ensemble schématique. L’aperçu schématique du protocole de culture modifié montre l’ajout de différents facteurs à des moments précis et les images représentatives du développement de la rétine neurale. SFEBq : culture flottante sans sérum d’agrégats embryoïdes ressemblant à des corps avec réagrégation rapide ; KSR : remplacement du sérum knock-out ; gfCDM : milieu chimiquement défini sans facteur de croissance ; NRDM : milieu de différenciation de la rétine neurale ; BMP4 : protéine morphogénétique osseuse 4.Barres d’échelle : 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Les images représentatives en fond clair d’organoïdes rétiniens dérivées de trois protocoles différents à un stade précoce. Le jour 1, seule la méthode modifiée n’a pas été utilisée par les EB (A, E, I). Au jour 6, des EB se sont formés dans les trois méthodes (B, F, J). Au jour 18, des rétines neurales précoces se sont formées et une morphologie différente a été trouvée parmi les trois méthodes d’induction (C, G, K). Au jour 21, la rétine neurale générée par la méthode modifiée a montré une structure neuroépithéliale continue (D, H, L). Barres d’échelle : 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Rétine neurale 3D mature en culture en suspension aux jours 30, 45, 60. Au jour 30, la rétine neurale s’est formée dans les trois méthodes (A, E, I). Les flèches indiquent les structures kystiques dans la méthode de Kuwahara et al. (B). Les cases en pointillés blancs représentent la région d’adhésion et de fusion des organoïdes les uns aux autres (D, F, H). Les organoïdes rétiniens générés à partir du protocole modifié sont similaires en taille et en morphologie par rapport aux deux autres méthodes (C, G, J, K, L). Barres d’échelle : 100 μm (blanc) ; 200 μm (noir). Tableau statistique du taux de réussite de l’induction par les trois méthodes utilisant H9-ESC (M). Une analyse de variance à un facteur a été utilisée pour tester la signification (les barres d’erreur indiquent l’erreur-type, n = 864, **P < 0,01, ***P < 0,001). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Caractérisation de la rétine neurale dans le protocole modifié. Images d’immunomarquage de la rétine neurale au jour 6, au jour 18, au jour 30 et au jour 60. Les colorants verts sont pour KI67 (cellule proliférante), PAX6 (cellule progénitrice rétinienne) et NESTIN (cellule souche neurale). Les colorants rouges sont pour CHX10 (cellule progénitrice rétinienne), SOX2 (cellule progénitrice neurale) et TUJ1 (cellule ganglionnaire rétinienne). Barres d’échelle : 100 μm (A, B, E, F, I, J) ; 200 μm (C, D, G, H, K, L). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Comparaison des organigrammes pour les trois protocoles d’induction d’organoïdes rétiniens. SFEBq : culture flottante sans sérum d’agrégats embryoïdes ressemblant à des corps avec réagrégation rapide ; KSR : remplacement du sérum knock-out ; gfCDM : milieu chimiquement défini sans facteur de croissance ; NRDM : milieu de différenciation de la rétine neurale ; BMP4 : protéine morphogénétique osseuse 4. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : La morphologie du corps embryoïde (EB) induite par la méthode de Kuwaharaet al. L’apparition progressive d’amas de cellules mortes a été observée autour des EB après l’ajout de BMP4 au jour 6 (A-D, flèches noires). De grandes différences morphologiques ont été observées, après le jour 6 (E-L), et certains EB étaient même complètement inactivés (H,L). ESC : cellule souche embryonnaire, PBMC : cellule mononucléée du sang périphérique, IPSC : cellule souche pluripotente induite. Barres d’échelle : 200 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Les OI humaines peuvent récapituler spatialement et temporellement le développement de la rétine fœtale, et les OI précoces présentent un degré élevé de similitude avec la rétine fœtale à des stades de développement équivalents15. En termes de morphologie tissulaire et d’expression moléculaire, l’OI humaine reflète étroitement l’état de croissance réel du tissu rétinien, offrant des opportunités énormes et sans précédent dans les domaines de la modélisation des maladies, du criblage de médicaments et de la médecine régénérative. Actuellement, plusieurs méthodes différentes ont été établies pour générer des OI à partir de CSP humaines in vitro, et des modifications et optimisations continues sont en cours pour améliorer encore l’efficacité9. Le laboratoire Sasai a rapporté pour la première fois la génération d’OI dérivées de CSP à partir de CSE humaines11. Les CSE humaines ont d’abord été préparées en suspensions unicellulaires, puis un nombre égal de cellules ont été ensemencées dans 96 puits coniques à fond en V, avec une agrégation rapide pour former des EB de type circulaire. L’ajout externe de voies de signalisation cellulaire clés a favorisé la formation de vésicules optiques dans les EB, qui ont ensuite mûri en RO laminées en culture en suspension. Le NR contient un type de cellules gliales et six types de cellules neuronales différents, représentant de nombreux aspects du développement rétinien, tels que la morphogenèse cellulaire, la différenciation des neurones et la polarité apicale-basale9. Bien que seulement 10 % des agrégats aient formé une structure à double paroi en coupelle optique, il s’agissait d’une étape majeure dans l’évolution de la production d’osmoses inversesplus avancées 11.
Par la suite, Zhong et al. ont introduit une nouvelle alternative, dans laquelle les hiPSC ont d’abord été cultivées à proximité de confluences, suivies d’une désintégration chimique ou mécanique en petits agrégats flottants13. Ensuite, les petits agrégats ont formé des EB en culture en suspension, qui se sont détachés séparément du fond de la plaque, se différenciant davantage dans la direction neurale. Zhong et al. ont démontré une rétine 3D complètement laminée avec des segments externes photorécepteurs relativement bien développés qui répondent à la stimulation lumineuse. Cette méthode nécessitait moins de régulation externe des voies de signalisation cellulaire et était principalement réalisée de manière autodirigée9. La troisième révolution technologique a été l’introduction de la méthode d’encastrement par le groupeLowe 25. Cela impliquait l’intégration d’agrégats de CSEh dans la MEC pour former une structure épithéliale à lumière unique. Après dispersion enzymatique, les agrégats ont été maintenus dans une culture en suspension pour former des OI matures. Bien que les trois méthodes puissent induire avec succès des OI avec une structure et une fonction comparables, les applications à grande échelle ont l’inconvénient d’être longues et laborieuses en raison de leur grande hétérogénéité et de leur faible taux de réussite23.
En plus des méthodes ci-dessus, Kuwahara et al. ont proposé une nouvelle méthode d’induction, à savoir la méthode de déclin du gradient de facteur clé12. Ils ont constaté que le NR pouvait être généré par l’ajout de BMP4 à une concentration décroissante à partir du jour 6. Ce système d’induction utilisait moins de facteurs externes pour former des RO avec une uniformité accrue de taille et de morphologie. Cependant, des études ont rapporté que les EB formés étaient sujets aux lésions kystiques et que le taux de réussite de l’induction de cette méthode était d’environ 40 %12,28. Döpper et al. ont modifié ce protocole pour améliorer le taux de réussite en combinant un milieu commercial avec trois inhibiteurs à petites molécules au stade précoce de l’induction pour stabiliser les EBs27. En revanche, les cellules de l’épithélium neural de la rétine adhèrent plus facilement les unes aux autres, ce qui nécessite une culture séparée de chaque OI pendant la culture en suspension à long terme. La méthode de Döpper et al. augmente les complications et les coûts des opérations expérimentales et ne convient pas à l’induction à grande échelle27. Le protocole de production d’osmose inverse optimisé a amélioré l’efficacité de l’induction. La méthode modifiée actuelle a été comparée aux méthodes de Kuwahara et al. et de Döpper et al.
Cette étude a montré que les méthodes de Kuwahara et al. et de Döpper et al. formaient des EB avec des bords lisses au jour 1, alors que la méthode modifiée actuelle nécessitait un temps relativement long pour former des EB, environ jusqu’au jour 6. Le volume des EB obtenus à l’aide de la méthode de Kuwahara et al. était plus grand que celui obtenu à l’aide de la méthode de Döpper et al., et les EB obtenus à l’aide de la méthode de Döpper et al. ont montré une fluidité accrue sous écoulement liquide. Notamment, des amas de cellules mortes sont progressivement apparus autour des EB après l’ajout de BMP4 au jour 6 en utilisant la méthode de Kuwahara et al. (Figure supplémentaire 2). Au jour 18, des différences morphologiques significatives ont été observées dans les EB de la méthode de Kuwahara et al., et certains EB étaient complètement inactivés (Figure supplémentaire 2). Dans la méthode de Döpper et al., la majorité des EB étaient arrondis et bien circonscrits, et ne présentaient qu’un petit nombre de cellules mortes éparpillées autour d’eux. La méthode modifiée a formé des EB serrés et bien structurés avec de légères différences morphologiques, et quelques cellules mortes ont été observées autour d’eux.
De plus, cette étude a également révélé que certains EB généraient des vésicules par Kuwahara et al. au stade précoce suivant le transfert sur des plaques à 6 puits, ce qui entraînait un échec de la formation d’OI. L’adhésion et la fusion des OI se sont produites vers le jour 40, ce qui a considérablement diminué l’utilité des expériences. Le système de culture de la méthode de Döpper et al. est plus compliqué et nécessite plus d’étapes opérationnelles et un coût plus élevé que la méthode de Kuwahara et al. La majorité des RO de Döpper et al. ont également inévitablement développé des adhésions et des fusions les uns avec les autres. La méthode modifiée de cette étude a réussi à générer des NR 3D in vitro qui expriment les marqueurs liés à la rétine humaine CHX10, KI67, PAX6, SOX2, TUJ1 et NESTIN. Et la plupart des RO par la méthode modifiée étaient de taille et de morphologie constantes, et très peu de vésicules ou d’adhérences se sont développées au cours des derniers stades de la différenciation rétinienne.
Par rapport aux deux autres méthodes, le nouveau système de culture avait des étapes opérationnelles plus simples et des coûts réduits. L’étape critique de la méthode modifiée consiste à ajouter trois inhibiteurs à petites molécules dans le milieu et à s’assurer que la plaque n’est pas déplacée pendant les six premiers jours pour stabiliser la structure des EB. Le mouvement des plaques ou toute manipulation cellulaire à un stade précoce peut affecter la formation d’EB. Par rapport aux deux autres méthodes, la méthode modifiée n’a pas changé le milieu au jour 1 et a également réduit l’utilisation d’inhibiteurs à petites molécules le jour 15. En bref, les étapes de fonctionnement de la méthode modifiée sont simplifiées dans une certaine mesure et le coût expérimental est économisé avec moins d’utilisation de milieux et de réactifs. Cependant, la méthode modifiée ne peut toujours pas résoudre les problèmes courants du système actuel de culture d’organoïdes. De plus, l’efficacité de l’induction des OI dépend en grande partie de la qualité et de la capacité de différenciation des CSPh. Dans cette étude, seule l’efficacité de la production de NR à l’aide de H9-ESC a été entièrement calculée. Nous avons réussi à induire des OI dans différentes lignées de CSPh avec la nouvelle méthode de la présente étude, et avons obtenu la même efficacité d’induction, y compris H9, H1 et PBMC-iPSC. Il n’y a pas de différence statistique dans l’efficacité de l’induction entre les trois lignées cellulaires. À l’avenir, d’autres études devront explorer l’efficacité d’induction de différentes CSPh en utilisant cette méthode.
En conclusion, le protocole d’induction rétinienne optimisé est simple et peu coûteux, a une répétabilité et une efficacité élevées, offre des modèles personnalisés prometteurs de maladies rétiniennes et fournit une source cellulaire abondante pour la thérapie cellulaire, le criblage de médicaments et les tests de thérapie génique.
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Disclosures
Tous les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts.
Acknowledgments
Aucun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Washing slices |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101-500ML | Fix retinal organoids |
| 5 mL Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318516 | Pipette retinal organoids |
| 96 V-bottomed conical wells | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | Fix slices |
| AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | Medium |
| Anhydrous ethanol | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrate |
| Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Primary antibody |
| Antifade Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
| Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Primary antibody |
| Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Primary antibody |
| Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) | Beyotime | AT809 | Primary antibody |
| Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Primary antibody |
| Cell dissociation solution(CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | Cell dissociation |
| CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β inhibitor |
| Cholesterol Lipid Concentrate | Gibco | 12531018 | 250× |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | Servicebio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
| CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | Cell Freezing Medium |
| DAPI | Roche | 10236276001 | Nuclear counterstain |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
| DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Secondary Antibody |
| Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Secondary Antibody |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation |
| Extracellular matrix (ECM) | Corning | 354277 | Coating plates |
| F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Medium |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A5669701 | |
| Flow-like tissue cell quantitative analyzer | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Scan sections |
| IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
| IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-inhibitor |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-inhibitor |
| Low-adhesion 24-well Plates | Corning | 3473 | |
| Low-adhesion 6-well Plates | Corning | 3471 | |
| Maintenance medium (MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | Medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking buffer |
| Paraplast | Leica | 39601006 | Tissue embedding |
| PBS pH 7.4 basic (1x) | Gibco | C10010500BT | Without Ca+,Mg+ |
| Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) | R&D | 314-BP | Key protein factor |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Powder, keep out of light |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5-inhibitor |
| SU5402 | Selleckchem | S7667 | Tyrosine kinase inhibitor |
| Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
| Taurine | Sigma | T0625-10G | |
| Thioglycerol | Sigma | M1753 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilization |
| WA09 embryonic stem cell line | WiCell Research Institute | Cell line | |
| Xylene | SINOPHARM | 10023418 | Dewaxing |
| Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-inhibitor |
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