Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

יצירת רשתית עצבית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Published: December 22, 2023 doi: 10.3791/66246
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 2, 3, 3, 1,2, 2, 3, 3, 1,2
1Medical School of Chinese PLA, 2Senior Department of Ophthalmology, The Third Medical Center of Chinese PLA General Hospital, 3Stem Cell and Regenerative Medicine Lab, Beijing Institute of Radiation Medicine
* These authors contributed equally

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מערכת אינדוקציה תלת-ממדית אופטימלית של הרשתית העצבית המפחיתה את ההידבקות והאיחוי של אורגנואידים ברשתית עם חזרתיות ויעילות גבוהות.

Abstract

רטינופתיה היא אחד הגורמים העיקריים לעיוורון ברחבי העולם. חקירת הפתוגנזה שלה חיונית לאבחון מוקדם וטיפול בזמן של רטינופתיה. למרבה הצער, מחסומים אתיים מעכבים איסוף ראיות מבני אדם. לאחרונה, מחקרים רבים הראו כי תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (PSCs) יכולים להיות ממוינים לאורגנואידים ברשתית (ROs) באמצעות פרוטוקולי אינדוקציה שונים, שיש להם פוטנציאל עצום ברטינופתיה למידול מחלות, סינון תרופות וטיפולים מבוססי תאי גזע. מחקר זה מתאר פרוטוקול אינדוקציה אופטימלי ליצירת רשתית עצבית (NR) המפחיתה באופן משמעותי את ההסתברות לשלפוחית ואיחוי, ומגדילה את שיעור ההצלחה של הייצור עד היום ה-60. בהתבסס על היכולת של PSCs לארגן מחדש את עצמם לאחר דיסוציאציה, בשילוב עם גורמים משלימים מסוימים, שיטה חדשה זו יכולה באופן ספציפי להניע התמיינות NR. יתר על כן, הגישה אינה מסובכת, חסכונית, מפגינה חזרתיות ויעילות ראויות לציון, מציגה סיכויים מעודדים למודלים מותאמים אישית של מחלות רשתית, ומספקת מאגר תאים בשפע ליישומים כגון תרפיה תאית, בדיקות סקר תרופתיות ובדיקות ריפוי גנטי.

Introduction

העין משמשת כמקור המידע העיקרי בין איברי החישה האנושיים, כאשר הרשתית היא הרקמה החישה הראייתית העיקרית בעיני יונקים1. רטינופתיה עומדת כאחד הגורמים העולמיים העיקריים למחלות עיניים, המובילות לעיוורון2. כ-2.85 מיליון אנשים ברחבי העולם סובלים בדרגות שונות של ליקוי ראייה עקב רטינופתיה3. כתוצאה מכך, חקירת הפתוגנזה שלה חיונית לאבחון מוקדם וטיפול בזמן. רוב המחקרים על רטינופתיה אנושית התמקדו בעיקר במודלים של בעלי חיים 4,5,6. עם זאת, הרשתית האנושית היא רקמה מורכבת ורב-שכבתית הכוללת סוגי תאים שונים. תרביות תאים דו-ממדיות מסורתיות (2D) ומערכות מודל של בעלי חיים בדרך כלל אינן מצליחות לשחזר נאמנה את ההתפתחות המרחבית-זמנית הרגילה ואת חילוף החומרים התרופתי של הרשתית האנושית הטבעית 7,8.

לאחרונה, טכניקות תרבית תלת-ממדיות התפתחו כדי ליצור איברים דמויי רקמות מתאי גזע פלוריפוטנטיים (PSCs)9,10. אורגנואידים ברשתית (ROs) הנוצרים מתאי PSC אנושיים במערכת תרבית תרחיף תלת-ממדית לא רק מכילים שבעה סוגי תאי רשתית, אלא גם מציגים מבנה מרובד מובהק הדומה לרשתית האנושית in vivo 11,12,13. ROs שמקורם ב-PSC בבני אדם צברו פופולריות וזמינות נרחבת וכיום הם המודלים הטובים ביותר במבחנה לחקר ההתפתחות והמחלות של הרשתית האנושית14,15. במהלך העשורים האחרונים, חוקרים רבים הוכיחו כי PSCs אנושיים, כולל תאי גזע עובריים (ESC) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), יכולים להתמיין לתאי RO באמצעות פרוטוקולי אינדוקציה שונים. התקדמות זו טומנת בחובה פוטנציאל עצום ברטינופתיה למידול מחלות, בדיקות סקר לתרופות וטיפולים מבוססי תאי גזע 16,17,18.

עם זאת, יצירת הרשתית העצבית (NR) מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (PSC) היא תהליך מורכב, מסורבל וגוזל זמן. יתר על כן, שינויים בין אצווה לאצווה באורגנואידים של רקמות עשויים להוביל לשכפול נמוך יותר של תוצאות19,20. גורמים פנימיים וחיצוניים רבים יכולים להשפיע על התשואה של אורגנואידים ברשתית (ROs), כגון מספר או מינים של תאים התחלתיים ושימוש בגורמי שעתוק ותרכובות מולקולות קטנות 21,22,23. מאז RO האנושי הראשון נוצר על ידי מעבדת סאסאי11, הוצעו שינויים מרובים במהלך השנים כדי לשפר את הקלות והיעילות של תהליך האינדוקציה 13,21,24,25. למרבה הצער, עד כה, לא נקבע פרוטוקול תקן זהב לייצור ROs בכל המעבדות. ואכן, קיימת מידה מסוימת של אי התאמה ב- ROs הנובעת משיטות אינדוקציה שונות, כמו גם שונות רבה בביטוי סמני הרשתית והחוסן של המבנה שלהם22,26. סוגיות אלה עלולות לסבך מאוד את איסוף הדגימות ואת פענוח ממצאי המחקר. לכן, יש צורך בפרוטוקול בידול מאוחד וחזק יותר כדי למקסם את היעילות עם הטרוגניות מינימלית של דור RO.

מחקר זה מתאר פרוטוקול אינדוקציה אופטימלי המבוסס על שילוב של Kuwahara et al.12 ו- Döpper et al.27 עם הוראות מפורטות. השיטה החדשה מפחיתה באופן משמעותי את ההסתברות של שלפוחית אורגנואיד ואיחוי, ומגדילה את שיעור ההצלחה של יצירת NR. פיתוח זה טומן בחובו הבטחה גדולה עבור מודלים של מחלות, בדיקות סקר תרופתיות ויישומי תרפיה תאית להפרעות רשתית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה נערך בהתאם לעקרונות הצהרת הלסינקי ואושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית של בית החולים הכללי של ה- PLA הסיני. קו WA09 (H9) ESC התקבל ממכון המחקר WiCell.

1. תרבות, מדיה והכנת ריאגנטים

  1. מדיום תרבות ESC אנושית ופתרון מעבר
    1. מדיום תחזוקה (MM): הכינו 500 מ"ל של MM שלם (תוספת בינונית בסיסית + 5x; ראו טבלת חומרים) באופן אספטי. יש להפשיר תוסף פי 5 בטמפרטורת החדר (RT) או למשך הלילה בטמפרטורה של 2-8°C. יש לחמם מראש ל-RT. יש לערבב היטב לפני השימוש עד לקבלת התוסף ללא עננות.
    2. מטריצה חוץ-תאית 1% (ECM): השתמש בקצה פיפט מקורר מראש ובצינורות סטריליים כדי לפלוט 200 מיקרוליטר של ECM (ראה טבלת חומרים) לכל צינור על קרח. אחסנו את הצינורות במקפיא בטמפרטורה של -20°C. יש להמיס ECM על קרח ולדלל עם DMEM/F12 מקורר מראש בשעה 1:100.
    3. 0.5 mM pH = 8.0 EDTA: כדי להכין 500 מ"ל של 0.5 mM EDTA, הוסף 500 μL של 0.5 M EDTA ו- 0.9 גרם של NaCl ל- 500 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (DPBS) של 1x Dulbecco (ראה טבלת חומרים). מערבבים היטב ומאחסנים ב-2-8°C.
  2. מדיום התמיינות רשתית
    1. מדיום מוגדר כימית ללא גורמי גדילה (gfCDM): הכינו את ה-gfCDM על ידי שילוב של 45% Dulbecco's Medium-GlutaMAX (IMDM-GlutaMAX) של Iscoveco, 45% F12-GlutaMAX של Ham (F12-Glutamax), 10% תחליף סרום נוקאאוט (KSR), תרכיז שומנים 1% כולסטרול ו-450 מיקרומטר תיוגליצרול (ראו טבלת חומרים).
  3. תרכובות מולקולות קטנות
    1. Y-27632 2HCl: הוסף 50 מ"ג של אבקת Y-27632 ל-3.122 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO). יש לחלק ולאחסן Y-27632 (ראה טבלת חומרים) בריכוז של 50 מ"מ בטמפרטורה של -80°C למשך שנתיים, תוך התרחקות מאור. יש לדלל את המלאי 2,500 פעמים (20 מיקרומטר) לשימוש, שווה ערך ל-0.4 מיקרוליטר Y-27632 למ"ל gfCDM.
    2. IWR1-endo: הוסף 2.4424 מ"ל של DMSO כדי להמיס 10 מ"ג של IWR1-endo (ראה טבלת חומרים) כדי לקבל פתרון מלאי של 10 mM. מוציאים aliquots ולאחסן אותם ב -80 ° C עד 2 שנים. הוסף 0.3 μL של 10 mM IWR1-endo לכל מ"ל של gfCDM עבור ריכוז 3 μM עבור אינדוקציה.
    3. SB431542: להכנת 50 מ"מ SB431542, יש להוסיף 10 מ"ג SB431542 (ראו טבלת חומרים) ל-0.5203 מ"ל DMSO ולערבב היטב. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C בממס למשך שנתיים לכל היותר. להכנת SB431542 בריכוז עבודה של 10 מיקרומטר, הוסף 2 μL של תמיסת מלאי 50 mM ל 10 מ"ל של gfCDM.
    4. LDN-193189 2HCl: יש להמיס 5 מ"ג של LDN-193189 2HCl (ראה טבלת חומרים) ב-10.4297 מ"ל DMSO כדי לקבל תמיסת מלאי של 1 מילימול. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C או -80°C (לפי המלצת היצרן). הוסף 0.1 μL של המלאי לכל 10 מ"ל של gfCDM, וכתוצאה מכך 100 ננומטר של LDN-193189 עבור אינדוקציה.
    5. חלבון מורפוגנטי רקומביננטי של עצם האדם 4 (BMP4): מורכב מחדש ב 50-200 מיקרוגרם / מ"ל ב 4 mM HCl (ראה טבלת חומרים). יש לאחסן בטמפרטורה של 2°C עד 8°C למשך חודש אחד או -20°C למשך שנה לאחר החוקה מחדש. בצע אינדוקציה של NR באמצעות BMP4 1.5 ננומטר.
  4. מדיום תרבות NR לטווח ארוך
    1. חומצה רטינואית (RA): יש למדוד 6 מ"ג של אבקת RA (ראו טבלת חומרים) ולהוסיף ל-3.9941 מ"ל DMSO. יש לאחסן ב-aliquots של 5 mM בטמפרטורה של -80°C ולהשתמש תוך 3 חודשים. כדי להשיג ריכוז עבודה של 0.5 מיקרומטר, הוסף 10 מיקרוליטר של תערובת האב ל -100 מ"ל של מדיום התמיינות רשתית עצבית (NRDM). יש להוסיף ממש לפני השימוש.
      הערה: יש להרחיק מאור במהלך ההכנה והאחסון.
    2. טאורין: הוסף אבקת טאורין (ראה טבלת חומרים) במשקל 200 מ"ג עד 7.9904 מ"ל DMSO כדי לקבל תמיסת מלאי של 200 מילימטר. יש לחלק ולאחסן בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס. ריכוז עבודה של 0.1 mM טאורין מושג על ידי הוספת 50 μL של תמיסת מלאי לכל 100 מ"ל של NRDM.
    3. NRDM: הרכב NRDM עם DMEM/F12-GlutaMAX בינוני, תוסף N2 1%, 10% סרום בקר עוברי, 0.5 mM RA ו-0.1 mM טאורין (ראו טבלת חומרים). יש לאחסן בטמפרטורה של 2-8°C למשך עד שבועיים או 6 חודשים בטמפרטורה של -20°C כדי להבטיח את פעילות הרכיבים.
  5. מאגר חסימה: דלל 1:9 עם DPBS כדי לקבל פתרון עבודה של 10% לשימוש (ראה טבלת חומרים). יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C למשך עד 5 שנים.
    הערה: בצע את כל ההליכים האחרים בארון בטיחות ביולוגית Class II כדי להבטיח סטריליות, למעט שקילה. אם יש צורך להוסיף ריאגנטים שקולים במהלך תהליך ההכנה, השתמש במסננים של 0.22 מיקרומטר לסינון.

2. גידול H9-ESCs

  1. הפשרת H9-ESCs
    1. הוסף 1 מ"ל של 1% ECM לכל באר של צלחת 6 בארות. דגירה במשך שעה אחת באינקובטור ב 37 ° C באטמוספירה 5% CO2 .
      הערה: הימנע מתוספת של ECM לאורך קירות הבאר, מכיוון שהוא עלול להידבק למשטח.
    2. קח מלאי קריוביאלי H9-ESC ממיכל החנקן הנוזלי ונער אותו במהירות במים של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
      הערה: אין לאפשר לבקבוקון להפשיר לחלוטין.
    3. מוציאים את הבקבוקון ומעקרים אותו בזהירות באמצעות תרסיס אלכוהול חיטוי 75%. הוסף את H9-ESC המופשר מהקריוביאל לצינור 15 מ"ל המכיל 9 מ"ל מ"מ עם 10 מיקרומטר Y-27632.
    4. צנטריפוגה את הצינור ב 190 × גרם במשך 5 דקות ב RT. בזהירות להסיר את רוב supernatant עם פיפטה 1 מ"ל, משאיר כ 50 μL של supernatant כדי למנוע אובדן תאים.
    5. הוסף 1 מ"ל של MM המכיל 10 מיקרומטר של Y27632 למשקעי התא והשהה מחדש בעדינות את משקעי התא עם פיפטה של 1 מ"ל על ידי פיפט למעלה ולמטה 5-10 פעמים.
    6. הסר את ציפוי ECM לאחר שעה אחת של דגירה. הוסף 2 מ"ל של MM מחומם מראש המכיל 10 מיקרומטר Y-27632 לכל באר.
    7. יש להוציא 0.5 מ"ל של תרחיף תאים לכל באר. נערו בעדינות את הצלחת לרוחב כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים.
    8. יש לדגור על הצלחת בטמפרטורה של 37°C מתחת ל-5% CO2 למשך 24 שעות לפחות מבלי לגעת בה.
    9. שנה את המדיום מדי יום. כאשר צפיפות השיבוט מגיעה ל-70% ומעלה, נדרשת העברה.
  2. מעבר של H9-ESCs
    1. הכינו את הצלחת המצופה ECM כמתואר לעיל (שלב 2.1.1) והוסיפו 2 מ"ל מ"מ לכל באר.
    2. מוציאים את המדיום המשומש מהצלחות בנות 6 הבארות. לשטוף כל באר פעמיים עם 1 מ"ל של DPBS.
    3. שטפו היטב פעמיים על ידי הוספה איטית של 1 מ"ל EDTA, ודגירת 1 מ"ל של EDTA למשך 4-7 דקות ב-RT.
      הערה: במהלך הדגירה, בדוק את צלחת 6 בארות במשך 3 דקות תחת מיקרוסקופ. המשך מיד לשלב הבא אם רוב התאים קרובים להתנתקות מהמנה. הימנע דגירה זמן רב כדי להפחית את ההשפעה השלילית על התאים.
    4. יש להשליך EDTA ולהוסיף 1 מ"ל של MM כדי להפיל את העיכול.
    5. טפחו בעדינות על צלחת הבאר עד שרוב התאים מנותקים.
    6. בזהירות להעביר את השעיית התא לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל עם פיפטה 5 מ"ל. השהה מחדש בעדינות את מושבות H9-ESC למעלה ולמטה 3-5 פעמים כדי לערבב אותן עם פיתת פסטר. העבירו 20-100 מיקרוליטר של תרחיף תאים בצלחת תרבית חדשה מצופה ECM עם 6 בארות ונערו אותה קדימה ואחורה.
    7. כאשר צפיפות התא נצפית כמספקת תחת מיקרוסקופ, לדגור על הצלחת ב 37 ° C תחת 5% CO2 במשך 24 שעות לפחות מבלי לגעת בו.
    8. שנה את המדיה מדי יום. בצפיפות שיבוט של 70% ומעלה, נדרש מעבר.

3. יצירת NRs אנושיים

הערה: ברגע שהמושבות משיגות מפגש של כ-70%, ניתן לכוון אותן להתמיינות לאורגנואידים ברשתית (ROs) באמצעות השלבים הפרוצדורליים המתוארים באיור 1.

  1. יום 0 - היווצרות גוף עוברי (EB)
    1. לאחר שטיפת התאים עם 2 מ"ל של DPBS, להוסיף 0.5 מ"ל של CDS (ראה טבלת חומרים) המכיל 20 מיקרומטר Y27632 לבאר. יש לדגור במשך 3 דקות בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח של 5% CO2 .
      הערה: בדוק תחת מיקרוסקופ. להפחית את זמן הדגירה ככל האפשר כדי למנוע השפעות מזיקות על התאים.
    2. בטל את העיכול על ידי הוספת 3 מ"ל של MM המכיל 20 מיקרומטר Y27632. צנטריפוגה ב 190 × גרם במשך 5 דקות ולהשליך supernatant.
    3. השהה מחדש את גלולת התא ב 1 מ"ל של gfCDM המכיל 20 מיקרומטר Y27632, ולספור את התאים. הוסף את אמצעי האחסון המתאים עבור 1.2 × 106 תאים (1.2 × 104 תאים לכל באר) ל- 10 מ"ל של gfCDM, המשולב מראש עם 20 מיקרומטר Y-27632, 3 מיקרומטר IWR1-endo, 10 מיקרומטר SB431542 ו- 100 ננומטר LDN-193189 (ראה טבלת חומרים).
    4. הוסף 100 μL של תרחיף תאים לכל באר של 96 בארות חרוטיות בעלות תחתית V. מניחים את הצלחת באינקובטור לח של 5% CO2 עד ליום 6.
      הערה: אין להזיז את הכלים במשך 24 שעות לפחות כדי לשפר את ההיצמדות של EBs.
  2. יום 6 - השראת רשתית
    1. ביום 6, הוסף 10 מ"ל של gfCDM המכיל 55 ng / mL BMP4 כדי לאפשר שינוי מוחלט של מדיום התרבית על EBs. מחזירים את הצלחת לאינקובטור.
      הערה: פיפטה לכיוון קירות הבאר החרוטית בעלת תחתית V 96 כדי למנוע בועות אוויר. הימנע לוקח כל אורגנואידים בעת שינוי המדיום.
    2. בצע שינוי חצי בינוני ביום 9, יום 12 ויום 15. החלף מחצית מהבינוני ב- gfCDM טרי כדי לדלל בהדרגה את BMP4.
  3. יום 18 - תרבות NR ארוכת טווח
    1. ביום ה -18, העבירו בזהירות את ה- EBs שנוצרו לצינורות צנטריפוגות של 15 מ"ל באמצעות פיפטות פסטר 5 מ"ל ושטפו שוב בעדינות עם NRDM. העבירו את ה-EBs ללוחות בעלי 6 בארות או 24 בארות עם ספיחה נמוכה (ראו טבלת חומרים). מחזירים את הצלחת לאינקובטור.
    2. החלף את המדיום ב- NRDM טרי כל 3 ימים.
      הערה: כבה את האור במהלך השינוי הבינוני מכיוון שה- RA רגיש לאור. הסר אורגנואידים ממוינים בצורה גרועה, והפרד אורגנואידים דבקים תחת מיקרוסקופ.

4. ניתוח של NRs אנושיים

  1. הרכבה של ROs
    1. בחר דורות שונים של H9-ESCs כדי לגרום לשלוש אצוות של ROs.
      הערה: שלוש לוחיות של מספר ה-NRs היוצרים עבור כל אחת משלוש השיטות המוערכות (Kuwahara et al.12, Döpper et al.27, והשיטה ששונתה במחקר הנוכחי) מחושבות כדי להעריך את שיעור ההצלחה באינדוקציה. אינדוקציה נחשבת מוצלחת אם מיקרוסקופ אור חושף היווצרות של מבנים דמויי נוירואפיתל ביום ה -30.
  2. צביעה אימונופלואורסצנטית של ROs
    1. העבר 3-5 ROs לצינורות 1.5 מ"ל. פיפטה מעל מדיום עודף ולשטוף את ROs פעם אחת עם 1 מ"ל של DPBS ב RT. לאפשר ROs לשקוע בזהירות להסיר את DPBS. הוסף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde (ראה טבלה של חומרים) לכל צינור 1.5 מ"ל ולתקן ב 4 ° C.
      הערה: ROs ביום 6 וביום 18, לתקן 2 שעות. תקן עבור 12 שעות ביום 30 ו 14 שעות ביום 60.
    2. לאחר הקיבוע, להתייבש באמצעות אלכוהול הדרגתי. השאירו את ה-ROs לעמוד במשך 15 דקות כל אחד ב-50%, 60% ו-70% אלכוהול, ולאחר מכן למשך 10 דקות כל אחד ב-80%, 90%, 95%, 100% ו-100% אלכוהול. לאחר מכן, הוסיפו תערובת של 1:1 של 100% אלכוהול וקסילן למשך 10 דקות, ולאחר מכן הוסיפו קסילן פעמיים למשך 10 דקות כל אחד.
    3. הניחו את ROs בתבניות מתכת מלאות בפרפלסט מותך (ראו טבלת חומרים) למשך 40 דקות, ולאחר מכן הרוו את התבניות על קרח כדי לתקן את ROs. מניחים קופסאות הטבעה לתוך התבניות ומקפיאים אותם ב -20 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן, נתק בזהירות את תיבות ההטבעה. לבסוף, אחסן אותם ב- RT.
    4. צור חתכים רציפים (5 מיקרומטר עובי) עם פרוסת פרפין. תקן פרוסות בשקופיות מיקרוסקופ הידבקות, יבש ואחסן ב- RT.
    5. בצע dewaxing ו rehydration לפני תיקון אנטיגן12,27.
    6. הוסף 10 מ"ל של 20x pH 6.0 תמיסת אחזור אנטיגן ציטראט (ראה טבלת חומרים) ל 190 מ"ל של ddH2O (H2O מזוקק כפול). מחממים במיקרוגל במצב גבוה במשך 4 דקות עד לרתיחה. לאחר הוספת קטעי פרפין, חממו את החלקים במצב נמוך למשך 20 דקות כדי להשלים את תיקון האנטיגן.
    7. תנו לחלקי הפרפין להתקרר באופן טבעי באזור מאוורר ולאחר מכן הכניסו אותם לתא לח.
    8. השתמש בעט פאפ (ראה טבלת חומרים) כדי לחלק לרמות את המקטעים. יש לדגור עם 0.2% Triton X-100 ב-RT למשך 30 דקות כדי לשבור את הממברנות, ולאחר מכן לשטוף את המגלשות שלוש פעמים עם TPBS, למשך 5 דקות כל אחת.
    9. יש לחסום עם 10% נסיוב חמורים מדולל ב-DPBS ב-RT למשך שעה אחת בתא לח עם 10 מיקרוליטר לכל אזור צביעה.
    10. מוסיפים נוגדנים ראשוניים מדוללים בסרום חמור 10%. יש לדגור למשך הלילה ב-4°C (75 °F) בתא לחות. יש לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם TPBS למשך 10 דקות כל אחת כדי להסיר את הנוגדן הלא קשור.
      הערה: נוגדנים ראשוניים הם כדלקמן: anti-PAX6 (1: 250), anti-SOX2 (1: 200), anti-KI67 (1: 200), anti-CHX10 (1: 200), anti-β tubulin III (1: 250) ו anti-NESTIN (1: 200) (ראה טבלה של חומרים).
    11. לדגור עם נוגדנים משניים מדוללים DPBS במשך 1 שעה ב RT בתא לח. חזור על שלב הכביסה עם TPBS שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחת.
      הערה: יש לשמור בחושך כדי למנוע מרווה של הנוגדן המשני הפלואורסצנטי. נוגדנים משניים הם Alexa Fluor 488 מצומד עם חמור נגד עכבר IgG ו Alexa Fluor 568 מצומד עם חמור נגד ארנב IgG בדילול של 1:400 (ראה טבלה של חומרים).
    12. דגירה עם DPBS המכיל DAPI (1: 500; ראה טבלת חומרים) במשך 10 דקות ב- RT בחושך. יש לשטוף שלוש פעמים עם TPBS במשך 10 דקות כל אחת.
    13. יש לטפטף כמות מתאימה של חומר איטום נגד פלואורסצנטיות (ראו טבלת חומרים) על השקף ולכסות בהחלקות כיסוי.
    14. הצג באופן חזותי באמצעות מנתח כמותי של תאי רקמה דמויי זרימה (ראה טבלת חומרים), או דומה.
    15. אחסן שקופיות בטמפרטורה של -20°C בחושך לאחר ניתוח מיקרוסקופי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

סקירה גרפית של הפרוטוקול שהשתנה מוצגת באיור 1. H9-ESCs שימשו ליצירת ROs כאשר התאים גדלו לצפיפות של 70%-80%. תרחיפים חד-תאיים של H9-ESCs ב-96 בארות חרוטיות בעלות תחתית V הצטברו ביום הראשון ויצרו EBs עגולים מוגבלים היטב ביום ה-6. ככל שזמן התרבות גדל, נפח ה- EBs גדל בהדרגה. ביום ה-30, מבנים דמויי נוירואפיתל נוצרו בבירור והתעבו במהלך התמיינות ארוכת טווח של NR.

בנוסף, השיטה המתוקנת הושוותה לשתי שיטות אחרות (Kuwahara et al.12 ו-Döpper et al.27) כדי להעריך את יכולת החזרתיות והיעילות שלה (איור משלים 1). מחקר זה גם הבחין כי המורפולוגיה של EBs ביום הראשון לאחר השיטה המתוקנת הייתה מעט גרועה יותר מאשר בשתי השיטות האחרות. אולם המבנים הנוירואפיתליאליים שנוצרו בשיטה ששונתה היו רציפים יותר ביום ה-18 (איור 2). ביום ה-30, ה-NRs המוקדמים שהתקבלו בשיטה שהשתנתה היו דומים בצורתם ובגודלם והראו צורה עגולה רגילה (איור 3). בהשוואה לשתי השיטות האחרות, NRs שנוצרו על ידי השיטה שונה היו שכיחות נמוכה יותר של שלפוחית והדבקה. יתר על כן, בהתבסס על H9-ESCs, שיעור ההצלחה של יצירת NRs באמצעות השיטה המתוקנת עלה ל 87.39% מ 26.9% ו 69.24% עבור השיטות של Kuwahara et al. ו Döpper et al. של12,27, בהתאמה (איור 3M).

צביעה אימונופלואורסצנטית בוצעה על חלקים משובצי פרפין של NRs כדי להעריך את הביטוי של סמנים הקשורים להתפתחות הרשתית (איור 4). התוצאות הראו ביטוי של גנים אנושיים הקשורים לרשתית ב-NRs שמקורם ב-H9-ESCs בשיטה שונה. תת-סוג התא הראשון שהופיע הוא תא גנגליון הרשתית, שהצטבר בעיקר בצד הבסיסי של ה-NRs. צביעת TUJ1 שימשה לזיהוי האקסונים של תאי הגנגליון ברשתית (איור 4I-L). יתר על כן, סמנים של תאי אב ברשתית התגלו הן בשכבה הפנימית (PAX6+) והן בשכבה החיצונית (CHX10+) (איור 4A-H). תאים חיוביים לסמן ההתפשטות KI67 התפזרו בשכבה החיצונית (איור 4A-D).

Figure 1
איור 1: סקירה סכמטית. הסקירה הסכמטית של פרוטוקול התרבית שהשתנתה מראה את הוספת הגורמים השונים בנקודות זמן ספציפיות ואת התמונות המייצגות של התפתחות הרשתית העצבית. SFEBq: תרבית צפה ללא סרום של אגרגטים דמויי גוף עוברי עם צבירה מחדש מהירה; KSR: החלפת סרום נוקאאוט; gfCDM: מדיום מוגדר כימית ללא גורם גדילה; NRDM: מדיום התמיינות רשתית עצבית; BMP4: חלבון מורפוגנטי עצם 4. מוטות קנה מידה: 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תמונות שדה בהיר מייצגות של אורגנואידים ברשתית שנגזרו משלושה פרוטוקולים שונים בשלב המוקדם. ביום הראשון, רק השיטה ששונתה לא הגיעה מה- EBs (A,E,I). ביום השישי, EBs נוצרו בכל שלוש השיטות (B,F,J). ביום ה-18 נוצרו רשתיות עצביות מוקדמות, ונמצאה מורפולוגיה שונה בין שלוש שיטות האינדוקציה (C,G,K). ביום ה-21, הרשתית העצבית שנוצרה בשיטה המתוקנת הראתה מבנה נוירואפיתל רציף (D,H,L). פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: רשתית עצבית תלת-ממדית בוגרת בתרבית תרחיף בימים 30, 45, 60. ביום ה-30 נוצרה רשתית עצבית בכל שלוש השיטות (A,E,I). חיצים מצביעים על מבנים ציסטיים בשיטה של קוואהרה ואחרים (B). תיבות מנוקדות לבנות מייצגות את אזור ההיצמדות והאיחוי של אורגנואידים זה לזה (D,F,H). אורגנואידים ברשתית הנוצרים מהפרוטוקול המתוקן דומים בגודל ובמורפולוגיה בהשוואה לשתי השיטות האחרות (C,G,J,K,L). פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר (לבן); 200 מיקרומטר (שחור). תרשים סטטיסטי של שיעור ההצלחה באינדוקציה לפי שלוש השיטות המשתמשות ב-H9-ESCs (M). ניתוח חד-כיווני של שונות שימש לבדיקת המובהקות (קווי שגיאה מראים שגיאת תקן, n = 864, **P < 0.01, ***P < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: אפיון הרשתית העצבית בפרוטוקול שהשתנה. תמונות immunostaining של הרשתית העצבית ביום 6, יום 18, יום 30 ויום 60. כתמים ירוקים מיועדים ל-KI67 (תא מתרבה), PAX6 (תא אב ברשתית) ו-NESTIN (תאי גזע עצביים). כתמים אדומים מיועדים ל-CHX10 (תא אב ברשתית), SOX2 (תא אב עצבי) ו-TUJ1 (תא גנגליון ברשתית). פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר (A,B,E,F,I,J); 200 מיקרומטר (C,D,G,H,K,L). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים משלים 1: השוואה בין תרשימי זרימה עבור שלושת פרוטוקולי השראת אורגנואידים ברשתית. SFEBq: תרבית צפה ללא סרום של אגרגטים דמויי גוף עוברי עם צבירה מחדש מהירה; KSR: החלפת סרום נוקאאוט; gfCDM: מדיום מוגדר כימית ללא גורם גדילה; NRDM: מדיום התמיינות רשתית עצבית; BMP4: חלבון מורפוגנטי עצם 4. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: המורפולוגיה של הגוף העוברי (EB) המושרה בשיטה של Kuwaharaet al. הופעה הדרגתית של גושי תאים מתים נצפתה סביב EBs לאחר הוספת BMP4 ביום 6 (A-D, חצים שחורים). הבדלים מורפולוגיים גדולים נצפו, לאחר יום 6 (E-L), וחלק מה- EBs אף הושבתו לחלוטין (H,L). ESC: תא גזע עוברי, PBMC: תא חד גרעיני דם היקפי, IPSC: תא גזע פלוריפוטנטי מושרה. פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ROs אנושיים יכולים לשחזר באופן מרחבי וזמני את התפתחות הרשתית העוברית, ו- ROs מוקדמים מפגינים רמה גבוהה של דמיון לרשתית העובר בשלבים מקבילים של התפתחות15. במונחים של מורפולוגיה של רקמות וביטוי מולקולרי, RO אנושי משקף באופן הדוק את מצב הצמיחה בפועל של רקמת הרשתית, ומספק הזדמנויות עצומות וחסרות תקדים בתחומי מידול מחלות, בדיקות סקר תרופות ורפואה רגנרטיבית. נכון לעכשיו, מספר שיטות שונות הוקמו כדי ליצור ROs מ PSCs אנושיים במבחנה, ושינויים מתמשכים ואופטימיזציות נמצאים בעיצומם כדי לשפר עוד יותר את היעילות9. מעבדת סאסאי דיווחה לראשונה על יצירת ROs שמקורם ב-PSC מתאי גזע עובריים אנושיים11. תאי גזע עובריים אנושיים הוכנו תחילה לתרחיפים חד-תאיים, ולאחר מכן נזרעו מספר שווה של תאים ב-96 בארות חרוטיות בעלות תחתית V, עם צבירה מהירה ליצירת EBs דמויי מעגלי. התוספת החיצונית של מסלולי איתות תאי מפתח קידמה את היווצרותן של שלפוחיות אופטיות ב- EBs, שהבשילו לאחר מכן ל- ROs למינציה בתרבית תרחיף. NR מכיל סוג אחד של תאי גלייה ושישה סוגים שונים של תאים עצביים, המייצגים היבטים רבים של התפתחות הרשתית, כגון מורפוגנזה של תאים, התמיינות נוירונים וקוטביות אפיקלית-בסיסית9. למרות שרק 10% מהאגרגטים יצרו מבנה של כוסות אופטיות בעלות דופן כפולה, הייתה זו אבן דרך משמעותית באבולוציה של ייצור ROs11 מתקדמים יותר.

לאחר מכן, Zhong et al. הציגו חלופה חדשה, שבה hiPSCs גודלו תחילה קרוב למפגשים, ולאחר מכן התפוררות כימית או מכנית לתוך אגרגטים קטנים צפים13. לאחר מכן, הצברים הקטנים יצרו EBs בתרבית תרחיף, אשר התנתקו בנפרד מתחתית הצלחת, והתבינו עוד יותר בכיוון העצבי. Zhong et al. הדגימו רשתית תלת-ממדית מרובדת לחלוטין עם מקטעים חיצוניים מפותחים יחסית של פוטורצפטור שהגיבו לגירוי אור. שיטה זו דרשה פחות ויסות חיצוני של מסלולי איתות תאיים ובוצעה בעיקר באופן מכוון עצמי9. המהפכה הטכנולוגית השלישית הייתה הכנסת שיטת ההטבעה על ידי קבוצת Lowe25. זה כלל הטבעה של אגרגטים hESC ב- ECM כדי ליצור מבנה אפיתל יחיד לומן. לאחר פיזור אנזימטי, הצברים נשמרו בתרבית מתלה כדי ליצור ROs בוגרים. למרות שכל שלוש השיטות יכולות לגרום בהצלחה ROs עם מבנה ותפקוד דומים, יישומים בקנה מידה גדול יש את החסרונות של להיות זמן רב מייגע בגלל ההטרוגניות הגבוהה שלהם שיעור הצלחה נמוך23.

בנוסף לשיטות הנ"ל, Kuwahara et al. הציעו שיטת אינדוקציה חדשה, כלומר, שיטת הירידה ההדרגתית של גורם המפתח12. הם מצאו כי NR יכול להיווצר על ידי תוספת של BMP4 בריכוז הולך ופוחת מהיום השישי. מערכת אינדוקציה זו השתמשה בפחות גורמים חיצוניים כדי ליצור ROs עם אחידות מוגברת בגודל ובמורפולוגיה. עם זאת, מחקרים דיווחו כי EBs שנוצרו היו נוטים נגעים ציסטיים, ואת שיעור ההצלחה אינדוקציה של שיטה זו היה כ 40% 12,28. Döpper et al. שינו פרוטוקול זה כדי לשפר את שיעור ההצלחה על ידי שילוב של מדיום מסחרי עם שלושה מעכבי מולקולות קטנות בשלב המוקדם של האינדוקציה כדי לייצב את EBs27. לעומת זאת, תאים של האפיתל העצבי של הרשתית נצמדים זה לזה ביתר קלות, מה שמצריך תרבית נפרדת של כל RO במהלך תרבית השעיה ארוכת טווח. השיטה של Döpper et al. מגדילה את הסיבוכים והעלויות של פעולות ניסיוניות ואינה מתאימה לאינדוקציה בקנה מידה גדול27. פרוטוקול ייצור RO ממוטב שיפר את יעילות האינדוקציה. השיטה הנוכחית הושוותה לשיטות של Kuwahara et al. ו- Döpper et al.

מחקר זה הראה כי הן השיטות של קוואהרה ועמיתיו והן של Döpper et al. יצרו EBs עם קצוות חלקים ביום הראשון, בעוד שהשיטה הנוכחית שהשתנתה דרשה זמן רב יחסית ליצירת EBs, בערך עד יום 6. נפח ה- EBs שהתקבלו בשיטה של Kuwahara et al. היה גדול יותר מזה שהתקבל בשיטה של Döpper et al., וה- EBs שהתקבלו באמצעות השיטה של Döpper et al. הראו נזילות מוגברת תחת זרימת נוזלים. יש לציין כי גושי תאים מתים הופיעו בהדרגה סביב EBs לאחר הוספת BMP4 ביום 6 בעת שימוש בשיטה של Kuwahara et al. (איור משלים 2). ביום ה-18 נצפו הבדלים מורפולוגיים משמעותיים בשיטה של קוואהארה ועמיתיו, וחלק מה-EBs הושבתו לחלוטין (איור משלים 2). בשיטתם של Döpper et al., רוב EBs היו מעוגלים ומוגבלים היטב, והציגו רק מספר קטן של תאים מתים מפוזרים סביבם. השיטה המתוקנת יצרה EBs הדוקים ומובנים היטב עם הבדלים מורפולוגיים קלים, וכמה תאים מתים נצפו סביבם.

יתר על כן, מחקר זה מצא גם כי כמה EBs יצרו שלפוחיות על ידי Kuwahara et al. בשלב המוקדם לאחר העברה ללוחות 6 בארות, וכתוצאה מכך כישלון ליצור ROs. הידבקות ואיחוי של ROs התרחשו בסביבות היום ה-40, מה שהפחית משמעותית את התועלת של הניסויים. מערכת התרביות של השיטה של Döpper et al. מסובכת יותר, ודורשת יותר צעדים תפעוליים ועלות גבוהה יותר מאשר השיטה של Kuwahara et al. רוב ROs על ידי Döpper ואחרים גם פיתחו באופן בלתי נמנע הידבקויות ואיחוי אחד עם השני. השיטה ששונתה במחקר זה יצרה בהצלחה NRs תלת-ממדיים במבחנה שביטאו את הסמנים הקשורים לרשתית האנושית CHX10, KI67, PAX6, SOX2, TUJ1 ו-NESTIN. ורוב ROs בשיטה ששונתה היו עקביים בגודל ובמורפולוגיה, ומעט מאוד שלפוחיות או הידבקויות התפתחו בשלבים המאוחרים של התמיינות הרשתית.

בהשוואה לשתי השיטות האחרות, למערכת התרבות החדשה היו צעדים תפעוליים פשוטים יותר ועלויות נמוכות יותר. השלב הקריטי בשיטה המתוקנת הוא להוסיף שלושה מעכבי מולקולות קטנות למדיה ולוודא שהצלחת לא תזוז במשך ששת הימים הראשונים כדי לייצב את המבנה של EBs. תנועת לוחות או כל מניפולציה של תאים בשלב המוקדם עשויה להשפיע על היווצרות EBs. בהשוואה לשתי השיטות האחרות, השיטה המתוקנת לא שינתה את התווך ביום 1 וגם הפחיתה את השימוש במעכבי מולקולות קטנות ביום 15. בקיצור, שלבי הפעולה של השיטה ששונתה מפושטים במידה מסוימת, ועלות הניסוי נשמרת עם פחות שימוש במדיה וריאגנטים. עם זאת, השיטה המתוקנת עדיין אינה יכולה לפתור את הבעיות הנפוצות של מערכת תרבית האורגנואידים הנוכחית. בנוסף, יעילות האינדוקציה של ROs תלויה במידה רבה באיכות וביכולת הבידול של hPSCs. במחקר זה, רק היעילות של יצירת NR באמצעות H9-ESC חושבה לחלוטין. במחקר הנוכחי יצרנו בהצלחה ROs בקווי hPSCs שונים, בשיטה החדשה, והשגנו את אותה יעילות אינדוקציה, כולל H9, H1 ו-PBMC-iPSC. אין הבדל סטטיסטי ביעילות האינדוקציה בין שלושת קווי התאים. בעתיד, מחקרים נוספים יצטרכו לחקור את יעילות האינדוקציה של hPSCs שונים באמצעות שיטה זו.

לסיכום, פרוטוקול השראת הרשתית הממוטב הוא פשוט וזול, בעל יכולת חזרה ויעילות גבוהות, מציע מודלים מותאמים אישית מבטיחים של מחלות רשתית, ומספק מקור תאי שופע לטיפול תאי, בדיקות סקר תרופתיות ובדיקות ריפוי גנטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

Acknowledgments

ללא.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.01 M TPBS Servicebio G0002 Washing slices
4% Paraformaldehyde Servicebio G1101-500ML Fix retinal organoids
5 mL Pasteur pipette NEST Biotechnology 318516 Pipette retinal organoids
96 V-bottomed conical wells Sumitomo Bakelit MS-9096VZ
Adhesion Microscope Slides CITOTEST 188105 Fix slices
AggreWell medium STEMCELL Technologies 5893 Medium
Anhydrous ethanol SINOPHARM 10009218 Dehydrate 
Anti-CHX10 Santa Cruz sc-365519 Primary antibody
Antifade Solution ZSGB-BIO ZLI-9556
Anti-KI67 Abcam ab16667 Primary antibody
Anti-NESTIN Sigma N5413 Primary antibody
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) Beyotime AT809 Primary antibody
Anti-PAX6 Abcam ab195045 Primary antibody
Cell dissociation solution(CDS) STEMCELL Technologies 7922 Cell dissociation
CHIR99021 Selleckchem S2924 GSK-3α/β inhibitor
Cholesterol Lipid Concentrate Gibco 12531018 250×
Citrate Antigen Retrieval Solution Servicebio G1202-250ML 20×, pH 6.0
CS10 STEMCELL Technologies 1001061 Cell Freezing Medium
DAPI Roche 10236276001 Nuclear counterstain
Dimethyl sulfoxide(DMSO) Sigma D2650
DMEM/F12 Gibco 11330032 Medium
DMEM/F12-GlutaMAX Gibco 10565018 Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 Invitrogen A32766 Secondary Antibody
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Invitrogen A10042 Secondary Antibody
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) Biosharp BL518A 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation
Extracellular matrix (ECM) Corning 354277 Coating plates
F12-Glutamax Gibco 31765035 Medium
Fetal Bovine Serum Gibco A5669701
Flow-like tissue cell quantitative analyzer TissueGnostics TissueFAXS Plus Scan sections
IMDM-GlutaMAX Gibco 31980030 Medium
IWR1-endo Selleckchem S7086 Wnt-inhibitor
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828028
LDN-193189 2HCl Selleckchem S7507 BMP-inhibitor
Low-adhesion 24-well Plates Corning 3473
Low-adhesion 6-well Plates Corning 3471
Maintenance medium (MM) STEMCELL Technologies 85850 Medium
N2 supplement Gibco 17502048
Normal Donkey Serum Solarbio SL050 Blocking buffer
Paraplast Leica 39601006 Tissue embedding
PBS pH 7.4 basic (1x) Gibco C10010500BT Without Ca+,Mg+
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) R&D 314-BP Key protein factor
Retinoic acid Sigma R2625 Powder, keep out of light
SB431542 Selleckchem S1067 ALK5-inhibitor
SU5402 Selleckchem S7667 Tyrosine kinase inhibitor
Super PAP Pen ZSGB-BIO ZLI-9305
Taurine Sigma T0625-10G
Thioglycerol Sigma M1753
Triton X-100 Sigma X100 Permeabilization
WA09 embryonic stem cell line WiCell Research Institute Cell line
Xylene SINOPHARM 10023418 Dewaxing
Y-27632 2HCL Selleckchem S1049 ROCK-inhibitor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoon, M., Okawa, H., Della Santina,, Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
  2. Steinmetz, J. D., et al. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
  3. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
  4. Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).
  5. Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).
  6. Peng, Y. R., et al. Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina. Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).
  7. Ribeiro, J., et al. Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors. Cell Rep. 35 (3), 109022 (2021).
  8. Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
  9. Manafi, N., et al. Organoids and organ chips in ophthalmology. Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).
  10. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).
  11. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  12. Kuwahara, A., et al. Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nat Commun. 6, 6286 (2015).
  13. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nat Commun. 5, 4047 (2014).
  14. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  15. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  16. Li, H., et al. Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids. FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).
  17. Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
  18. Mandai, M. Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review. Regen Ther. 22, 59-67 (2023).
  19. Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. 3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer. Cell Biosci. 12 (1), 39 (2022).
  20. Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 9, 640212 (2021).
  21. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
  22. Sanjurjo-Soriano, C., et al. RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478 (2022).
  23. Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation. Front Cell Neurosci. 15, 638439 (2021).
  24. Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
  25. Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
  26. Yamasaki, S., et al. Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture. Regen Ther. 19, 24-34 (2022).
  27. Döpper, H., et al. Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120 (2020).
  28. Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535 (2021).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 202
יצירת רשתית עצבית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, W., Li, H., Yan, H., Gao, L.,… More

Li, W., Li, H., Yan, H., Gao, L., Wang, X., Zhao, L., Yan, Y., Ye, Z., Xi, J., Yue, W., Li, Z. Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (202), e66246, doi:10.3791/66246 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter