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Developmental Biology

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से तंत्रिका रेटिना उत्पन्न करना

Published: December 22, 2023 doi: 10.3791/66246
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 2, 3, 3, 1,2, 2, 3, 3, 1,2
1Medical School of Chinese PLA, 2Senior Department of Ophthalmology, The Third Medical Center of Chinese PLA General Hospital, 3Stem Cell and Regenerative Medicine Lab, Beijing Institute of Radiation Medicine
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल एक अनुकूलित 3 डी तंत्रिका रेटिना प्रेरण प्रणाली का वर्णन करता है जो उच्च पुनरावृत्ति और दक्षता के साथ रेटिना ऑर्गेनोइड के आसंजन और संलयन को कम करता है।

Abstract

रेटिनोपैथी दुनिया भर में अंधेपन के मुख्य कारणों में से एक है। रेटिनोपैथी के शीघ्र निदान और समय पर उपचार के लिए इसके रोगजनन की जांच करना आवश्यक है। दुर्भाग्य से, नैतिक बाधाएं मनुष्यों से साक्ष्य के संग्रह में बाधा डालती हैं। हाल ही में, कई अध्ययनों से पता चला है कि मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (पीएससी) को विभिन्न प्रेरण प्रोटोकॉल का उपयोग करके रेटिना ऑर्गेनोइड (आरओ) में विभेदित किया जा सकता है, जिसमें रोग मॉडलिंग, ड्रग स्क्रीनिंग और स्टेम सेल-आधारित उपचारों के लिए रेटिनोपैथी में भारी क्षमता होती है। यह अध्ययन तंत्रिका रेटिना उत्पन्न करने के लिए एक अनुकूलित प्रेरण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है (एनआर) कि काफी vesiculation और संलयन की संभावना कम कर देता है, दिन तक उत्पादन की सफलता दर में वृद्धि 60. पृथक्करण के बाद पीएससी की आत्म-पुनर्गठन की क्षमता के आधार पर, कुछ पूरक कारकों के साथ संयुक्त, यह नई विधि विशेष रूप से एनआर भेदभाव को चला सकती है। इसके अलावा, दृष्टिकोण सरल, लागत प्रभावी है, उल्लेखनीय पुनरावृत्ति और दक्षता प्रदर्शित करता है, रेटिना रोगों के व्यक्तिगत मॉडल के लिए उत्साहजनक संभावनाएं प्रस्तुत करता है, और सेल थेरेपी, ड्रग स्क्रीनिंग और जीन थेरेपी परीक्षण जैसे अनुप्रयोगों के लिए भरपूर मात्रा में सेल जलाशय प्रदान करता है।

Introduction

आंख मानव संवेदी अंगों के बीच जानकारी के प्राथमिक स्रोत के रूप में कार्य करती है, जिसमें रेटिना स्तनधारीआंखों में प्रमुख दृश्य संवेदी ऊतक है। रेटिनोपैथी नेत्र रोगों के प्राथमिक वैश्विक कारणों में से एक है, जिससे अंधापनहोता है। दुनिया भर में लगभग 2.85 मिलियन लोग रेटिनोपैथी के कारण दृष्टि हानि की अलग-अलग डिग्री से पीड़ितहैं। नतीजतन, प्रारंभिक निदान और समय पर उपचार के लिए इसके रोगजनन की जांच करना महत्वपूर्ण है। मानव रेटिनोपैथी पर अधिकांश अध्ययन मुख्य रूप से पशु मॉडल 4,5,6 पर ध्यान केंद्रित किया है. हालांकि, मानव रेटिना एक जटिल, बहुस्तरीय ऊतक है जिसमें विभिन्न कोशिका प्रकार शामिल हैं। पारंपरिक दो आयामी (2 डी) सेल संस्कृति और पशु मॉडल सिस्टम आम तौर पर ईमानदारी से सामान्य spatiotemporal विकास और देशी मानव रेटिना 7,8 की दवा चयापचय पुनरावृत्ति करने में विफल.

हाल ही में, 3 डी संस्कृति तकनीक प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (पीएससी)9,10से ऊतक जैसे अंगों को उत्पन्न करने के लिए विकसित हुई है। एक 3 डी निलंबन संस्कृति प्रणाली में मानव पीएससी से उत्पन्न रेटिना ऑर्गेनोइड (आरओ) में न केवल सात रेटिना सेल प्रकार होते हैं, बल्कि विवो 11,12,13में मानव रेटिना के समान एक अलग स्तरीकृत संरचना भी प्रदर्शित करते हैं। मानव पीएससी व्युत्पन्न आरओ लोकप्रियता और व्यापक उपलब्धता हासिल की है और वर्तमान में विकास और मानव रेटिना 14,15 की बीमारी का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में सबसे अच्छा कर रहे हैं. पिछले कुछ दशकों में, कई शोधकर्ताओं ने प्रदर्शित किया है कि मानव पीएससी, भ्रूण स्टेम सेल (ईएससी) और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) सहित, विभिन्न प्रेरण प्रोटोकॉल का उपयोग करके आरओ में अंतर कर सकते हैं। इन प्रगति रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग, और स्टेम सेल आधारित चिकित्सा 16,17,18 के लिए रेटिनोपैथी में भारी क्षमता पकड़.

हालांकि, मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (पीएससी) से तंत्रिका रेटिना (एनआर) की पीढ़ी एक जटिल, बोझिल और समय लेने वाली प्रक्रिया है। इसके अलावा, ऊतक organoids में बैच से बैच बदलाव परिणाम19,20 की कम प्रजनन क्षमता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. कई आंतरिक और बाह्य कारक रेटिना ऑर्गेनोइड (आरओ) की उपज को प्रभावित कर सकते हैं, जैसे कि कोशिकाओं की संख्या या प्रजातियां और प्रतिलेखन कारकों और छोटे-अणु यौगिकों का उपयोग 21,22,23. चूंकि पहला मानव आरओ ससाई प्रयोगशाला11 द्वारा उत्पन्न किया गया था, इसलिए प्रेरण प्रक्रिया 13,21,24,25की आसानी और प्रभावशीलता को बढ़ाने के लिए वर्षों में कई संशोधनों का प्रस्ताव किया गया है। दुर्भाग्य से, आज तक, सभी प्रयोगशालाओं में आरओ उत्पन्न करने के लिए कोई स्वर्ण मानक प्रोटोकॉल स्थापित नहीं किया गया है। वास्तव में, विभिन्न प्रेरण विधियों के परिणामस्वरूप आरओ में विसंगति की एक निश्चित डिग्री है, साथ ही रेटिना मार्करों की अभिव्यक्ति में व्यापक भिन्नता औरउनकी संरचना 22,26 की मजबूती है। ये मुद्दे नमूना संग्रह और अध्ययन निष्कर्षों की व्याख्या को गंभीर रूप से जटिल कर सकते हैं। इसलिए, आरओ पीढ़ी की न्यूनतम विविधता के साथ दक्षता को अधिकतम करने के लिए एक अधिक समेकित और मजबूत भेदभाव प्रोटोकॉल की आवश्यकता है।

यह अध्ययन विस्तृत निर्देशों के साथ कुवाहारा एट अल.12 और डॉपर एट अल.27 के संयोजन के आधार पर एक अनुकूलित प्रेरण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। नई विधि ऑर्गेनॉइड वेसिक्यूलेशन और फ्यूजन की संभावना को काफी कम कर देती है, जिससे एनआर उत्पन्न करने की सफलता दर बढ़ जाती है। यह विकास रेटिना विकारों के लिए रोग मॉडलिंग, ड्रग स्क्रीनिंग और सेल थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए बहुत अच्छा वादा करता है।

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Protocol

यह अध्ययन हेलसिंकी की घोषणा के सिद्धांतों के अनुसार आयोजित किया गया था और चीनी पीएलए जनरल अस्पताल की संस्थागत नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। WA09 (H9) ESC लाइन WiCell रिसर्च इंस्टीट्यूट से प्राप्त की गई थी।

1. संस्कृति मीडिया और अभिकर्मक तैयारी

  1. मानव ईएससी संस्कृति माध्यम और मार्ग समाधान
    1. रखरखाव माध्यम (एमएम): पूर्ण एमएम के 500 एमएल तैयार करें (बेसल माध्यम + 5x पूरक; सामग्री की तालिकादेखें) सड़न सवार। कमरे के तापमान (आरटी) पर 5x पूरक या रात भर 2-8 डिग्री सेल्सियस पर पिघलना। आरटी के लिए प्रीवार्म। उपयोग करने से पहले अच्छी तरह से हिलाओ जब तक कि पूरक बादल से मुक्त न हो।
    2. 1% बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम): बर्फ पर प्रति ट्यूब ईसीएम ( सामग्री की तालिकादेखें) के 200 माइक्रोन को वितरित करने के लिए पूर्व-ठंडा पिपेट टिप और बाँझ ट्यूबों का उपयोग करें। ट्यूबों को -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें। ईसीएम को बर्फ पर पिघलाएं और 1:100 बजे प्री-कूल्ड डीएमईएम/एफ12 से पतला करें।
    3. 0.5 एमएम पीएच = 8.0 ईडीटीए: 0.5 एमएम ईडीटीए के 500 एमएल तैयार करने के लिए, 0.5 एम ईडीटीए के 500 माइक्रोन और एनएसीएल के 0.9 ग्राम को 1x डलबेको के फॉस्फेट-बफर खारा (डीपीबीएस) के 500 एमएल में जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें)। अच्छी तरह मिलाएं और 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. रेटिना भेदभाव माध्यम
    1. ग्रोथ फैक्टर-फ्री केमिकल डिफाइंड मीडियम (gfCDM): 45% Iscove के संशोधित Dulbecco के मीडियम-ग्लूटामैक्स (IMDM-GlutaMAX), 45% हैम के F12-GlutaMAX (F12-ग्लूटामैक्स), 10% नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट (KSR), 1% कोलेस्ट्रॉल लिपिड कॉन्संट्रेट, और 450 μM thioglycerol ( सामग्री की तालिकादेखें) के संयोजन से gfCDM तैयार करें।
  3. छोटे अणु यौगिक
    1. Y-27632 2HCl: डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (DMSO) के 3.122 एमएल में 50 मिलीग्राम Y-27632 पाउडर जोड़ें। 2 साल के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर 50 एमएम की एकाग्रता पर वाई-27632 ( सामग्री की तालिकादेखें) को प्रकाश से दूर रखते हुए फैलाएं और स्टोर करें। उपयोग के लिए स्टॉक को 2,500 गुना (20 माइक्रोन) पतला करें, जो जीएफसीडीएम के प्रति एमएल वाई -27632 के 0.4 माइक्रोन के बराबर है।
    2. IWR1-endo: 10 मिमी स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए IWR1-endo के 10 मिलीग्राम ( सामग्री की तालिकादेखें) को भंग करने के लिए DMSO के 2.4424 एमएल जोड़ें। विभाज्य बांटना और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर 2 साल तक स्टोर करें। प्रेरण के लिए 3 माइक्रोन एकाग्रता के लिए जीएफसीडीएम के 10 एमएम आईडब्ल्यूआर1-एंडो प्रति एमएल के 0.3 माइक्रोन जोड़ें।
    3. SB431542: 50 मिमी SB431542 तैयार करने के लिए, डीएमएसओ के 0.5203 एमएल में 10 मिलीग्राम SB431542 ( सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं। अधिकतम 2 वर्षों के लिए विलायक में -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 10 माइक्रोन की कामकाजी एकाग्रता पर SB431542 की तैयारी के लिए, जीएफसीडीएम के 10 एमएल में 50 एमएम स्टॉक समाधान के 2 माइक्रोन जोड़ें।
    4. LDN-193189 2HCl: स्टॉक समाधान का 10.4297 मिमी प्राप्त करने के लिए DMSO के 10.4297 mL में LDN-193189 2HCl के 5 मिलीग्राम को भंग करें। -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस (निर्माता द्वारा अनुशंसित) पर स्टोर करें। जीएफसीडीएम के प्रत्येक 10 एमएल में स्टॉक के 0.1 माइक्रोन जोड़ें, जिसके परिणामस्वरूप प्रेरण के लिए एलडीएन-193189 का 100 एनएम होता है।
    5. पुनः संयोजक मानव अस्थि मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन 4 (बीएमपी 4): 4 एमएम एचसीएल में 50-200 माइक्रोग्राम/एमएल पर पुनर्गठन करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। पुनर्गठन के बाद 1 साल के लिए 1 महीने या -20 डिग्री सेल्सियस के लिए 2 डिग्री सेल्सियस से 8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 1.5 एनएम बीएमपी 4 का उपयोग करके एनआर का प्रेरण करें।
  4. दीर्घकालिक एनआर संस्कृति माध्यम
    1. रेटिनोइक एसिड (आरए): आरए पाउडर के 6 मिलीग्राम को मापें ( सामग्री की तालिकादेखें) और डीएमएसओ के 3.9941 एमएल में जोड़ें। -80 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिमी के विभाज्य में स्टोर करें और 3 महीने के भीतर उपयोग करें। 0.5 माइक्रोन की कामकाजी एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, तंत्रिका रेटिना भेदभाव माध्यम (एनआरडीएम) के 100 एमएल में मास्टर मिश्रण के 10 माइक्रोन जोड़ें। उपयोग करने से ठीक पहले जोड़ें।
      नोट: तैयारी और भंडारण के दौरान प्रकाश से दूर रखें।
    2. Taurine: एक 200 मिमी स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए DMSO के 7.9904 एमएल करने के लिए 200 मिलीग्राम वजन taurine पाउडर ( सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें. 2-8 डिग्री सेल्सियस पर वितरित और स्टोर करें। एनआरडीएम के 100 एमएल प्रति स्टॉक समाधान के 50 माइक्रोन जोड़कर 0.1 एमएम टॉरिन की कामकाजी एकाग्रता हासिल की जाती है।
    3. एनआरडीएम: डीएमईएम/एफ12-ग्लूटामैक्स माध्यम, 1% एन2 पूरक, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 0.5 एमएम आरए और 0.1 एमएम टॉरिन के साथ एनआरडीएम की रचना करें ( सामग्री की तालिका देखें)। घटकों की गतिविधि सुनिश्चित करने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह या 6 महीने के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. ब्लॉकिंग बफर: उपयोग के लिए 1% कार्यशील समाधान प्राप्त करने के लिए DPBS के साथ 9:10 पतला करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। 5 साल तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए कक्षा II जैव सुरक्षा कैबिनेट में अन्य सभी प्रक्रियाएं करें, वजन को छोड़कर। यदि तैयारी प्रक्रिया के दौरान तौला अभिकर्मकों को जोड़ना आवश्यक है, तो निस्पंदन के लिए 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करें।

2. H9-ESCs का संवर्धन

  1. H9-ESCs का विगलन
    1. एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 1% ईसीएम के 1 एमएल जोड़ें. एक 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए सेते हैं.
      नोट: अच्छी तरह से दीवारों के साथ ईसीएम के अतिरिक्त से बचें, क्योंकि यह सतह पर चिपक सकता है।
    2. तरल नाइट्रोजन टैंक से एक एच 9-ईएससी क्रायोवियल स्टॉक लें और जल्दी से इसे 30 एस के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी में हिलाएं।
      नोट: शीशी को पूरी तरह से पिघलने न दें।
    3. शीशी निकालें और ध्यान से 75% कीटाणुनाशक शराब स्प्रे का उपयोग कर यह निष्फल है. क्रायोवियल से पिघले हुए एच 9-ईएससी को 15 एमएल ट्यूब में जोड़ें जिसमें 10 माइक्रोन वाई -27632 के साथ 9 एमएल एमएम होता है।
    4. आरटी पर 5 मिन के लिए 190 × ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। सेल हानि से बचने के लिए सतह पर तैरनेवाला के लगभग 50 माइक्रोन छोड़कर, 1 एमएल विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला के अधिकांश को सावधानी से हटा दें।
    5. सेल तलछट में Y27632 के 10 माइक्रोन युक्त एमएम के 1 एमएल जोड़ें और धीरे-धीरे 5-10 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके 1 एमएल विंदुक के साथ सेल तलछट को फिर से निलंबित करें।
    6. इनक्यूबेशन के 1 घंटे के बाद ईसीएम कोटिंग निकालें। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 10 माइक्रोन वाई -27632 युक्त पूर्व गर्म एमएम के 2 एमएल जोड़ें.
    7. अच्छी तरह से प्रति सेल निलंबन के 0.5 एमएल बांटना. धीरे बाद में थाली हिला कोशिकाओं के भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए.
    8. इसे छूने के बिना कम से कम 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    9. माध्यम को दैनिक रूप से बदलें। जब क्लोन घनत्व 70% और उससे अधिक तक पहुंच जाता है, तो पासिंग की आवश्यकता होती है।
  2. H9-ESCs की पासिंग
    1. ऊपर वर्णित ईसीएम-लेपित प्लेट तैयार करें (चरण 2.1.1) और प्रति अच्छी तरह से एमएम के 2 एमएल जोड़ें।
    2. 6 अच्छी तरह से प्लेटों से खर्च माध्यम निकालें. डीपीबीएस के 1 एमएल के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से दो बार धो लें।
    3. धीरे-धीरे ईडीटीए के 1 एमएल जोड़कर प्रत्येक अच्छी तरह से धोएं, और आरटी पर 4-7 मिन के लिए ईडीटीए के 1 एमएल के साथ इनक्यूबेटिंग।
      नोट: इनक्यूबेशन के दौरान, माइक्रोस्कोप के तहत 3 मिन के लिए 6-वेल प्लेट की जांच करें। अगले चरण के लिए तुरंत आगे बढ़ें यदि अधिकांश कोशिकाएं डिश से अलग होने के करीब हैं। कोशिकाओं पर नकारात्मक प्रभाव को कम करने के लिए लंबे समय तक इनक्यूबेशन से बचें।
    4. EDTA त्यागें और पाचन गर्भपात करने के लिए एमएम के 1 एमएल जोड़ें.
    5. धीरे अच्छी तरह से थाली नल जब तक कोशिकाओं के बहुमत अलग कर रहे हैं.
    6. ध्यान से एक 5 एमएल विंदुक के साथ एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में सेल निलंबन हस्तांतरण. धीरे से ऊपर और नीचे H9-ESC कालोनियों को फिर से निलंबित करें 3-5 बार उन्हें एक पाश्चर पिटेट के साथ मिश्रण करने के लिए। एक नए ईसीएम-लेपित 6-अच्छी तरह से संस्कृति पकवान में सेल निलंबन के 20-100 माइक्रोन स्थानांतरित करें और इसे आगे और पीछे हिलाएं।
    7. जब सेल घनत्व एक खुर्दबीन के तहत पर्याप्त के रूप में मनाया जाता है, यह छूने के बिना कम से कम 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं.
    8. मीडिया को रोज बदलें। 70% क्लोन घनत्व और उससे ऊपर, मार्ग की आवश्यकता होती है।

3. मानव एनआर का निर्माण

नोट: एक बार कालोनियों लगभग 70% संगम प्राप्त करने के बाद, वे चित्रा 1 में उल्लिखित प्रक्रियात्मक चरणों का उपयोग रेटिना organoids (आरओ) में भेदभाव की ओर निर्देशित किया जा सकता है.

  1. दिन 0 - भ्रूण शरीर (ईबी) गठन
    1. डीपीबीएस के 2 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोने के बाद, अच्छी तरह से 20 माइक्रोन वाई 27632 युक्त सीडीएस ( सामग्री की तालिकादेखें) के 0.5 एमएल जोड़ें। एक आर्द्र 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए सेते हैं।
      नोट: एक खुर्दबीन के नीचे की जाँच करें. कोशिकाओं पर हानिकारक प्रभावों से बचने के लिए जितना संभव हो इनक्यूबेशन के समय को कम करें।
    2. 20 माइक्रोन वाई 27632 युक्त एमएम के 3 एमएल जोड़कर पाचन को निरस्त करें। 5 मिनट के लिए 190 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    3. 20 माइक्रोन वाई 27632 युक्त जीएफसीडीएम के 1 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें, और कोशिकाओं की गिनती करें। 1.2 × 106 कोशिकाओं (1.2 × 104 कोशिकाओं प्रति कुएं) के लिए जीएफसीडीएम के 10 एमएल के लिए संबंधित मात्रा जोड़ें, जो 20 माइक्रोन वाई -27632, 3 माइक्रोन आईडब्ल्यूआर 1-एंडो, 10 माइक्रोन SB431542, और 100 एनएम एलडीएन -193189 ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ पूर्व-शामिल है।
    4. 96 वी-तल शंक्वाकार कुओं के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 100 माइक्रोन जोड़ें। प्लेट को आर्द्र 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में दिन 6 तक रखें।
      नोट: ईबीएस के पालन को बढ़ाने के लिए कम से कम 24 घंटे के लिए व्यंजन को स्थानांतरित न करें।
  2. दिन 6 - रेटिना प्रेरण
    1. 6 दिन, ईबीएस पर संस्कृति माध्यम का एक पूरा परिवर्तन की अनुमति देने के लिए 55 एनजी/एमएल बीएमपी 4 युक्त gfCDM के 10 एमएल जोड़ें. इनक्यूबेटर के लिए थाली लौटें.
      नोट: हवा के बुलबुले से बचने के लिए 96 वी-तल शंक्वाकार अच्छी तरह से की दीवारों की ओर पिपेट। माध्यम बदलते समय किसी भी ऑर्गेनोइड को लेने से बचें।
    2. दिन 9, दिन 12 और दिन 15 पर आधा-मध्यम परिवर्तन करें। धीरे-धीरे बीएमपी 4 को पतला करने के लिए ताजा जीएफसीडीएम के साथ आधे माध्यम को बदलें।
  3. दिन 18 - दीर्घकालिक एनआर संस्कृति
    1. 18 दिन, ध्यान से 5 एमएल पाश्चर पिपेट का उपयोग कर 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए गठित ईबीएस हस्तांतरण और धीरे एनआरडीएम के साथ फिर से कुल्ला. ईबीएस को कम-सोखना 6-अच्छी तरह से या 24-अच्छी प्लेटों में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। इनक्यूबेटर के लिए थाली लौटें.
    2. माध्यम को हर 3 दिनों में ताजा एनआरडीएम से बदलें।
      नोट: मध्यम परिवर्तन के दौरान प्रकाश बंद करें क्योंकि आरए प्रकाश के प्रति संवेदनशील है। बुरी तरह से विभेदित ऑर्गेनोइड निकालें, और एक माइक्रोस्कोप के तहत अलग पक्षपाती ऑर्गेनोइड्स।

4. मानव एनआर का विश्लेषण

  1. आरओ का माउंटिंग
    1. आरओ के तीन बैचों को प्रेरित करने के लिए एच 9-ईएससी की विभिन्न पीढ़ियों का चयन करें।
      नोट: तीन मूल्यांकन विधियों (Kuwahara एट अल.12, Döpper एट अल.27, और वर्तमान अध्ययन में संशोधित विधि) में से प्रत्येक के लिए एनआर बनाने की संख्या की तीन प्लेटों प्रेरण सफलता दर का आकलन करने के लिए गणना कर रहे हैं. प्रेरण सफल माना जाता है अगर प्रकाश माइक्रोस्कोपी दिन 30 पर neuroepithelial जैसी संरचनाओं के गठन का पता चलता है.
  2. आरओ का इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना
    1. 3-5 आरओ को 1.5 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें। अतिरिक्त मध्यम से पिपेट और आरटी पर डीपीबीएस के 1 एमएल के साथ एक बार आरओ धो लें। आरओ को डूबने दें और डीपीबीएस को ध्यान से हटा दें। 1.5 एमएल ट्यूब प्रति 4% पैराफॉर्मलडिहाइड ( सामग्री की तालिकादेखें) के 1 एमएल जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें।
      नोट: दिन 6 और दिन 18 पर आरओ, 2 घंटे फिक्स। दिन 30 पर 12 घंटे और दिन 60 पर 14 घंटे के लिए फिक्स.
    2. निर्धारण के बाद, ढाल शराब का उपयोग करके निर्जलीकरण करें। आरओ को 50%, 60% और 70% अल्कोहल में प्रत्येक 15 मिनट के लिए खड़े होने के लिए छोड़ दें, और बाद में 80%, 90%, 95%, 100% और 100% अल्कोहल में प्रत्येक 10 मिनट के लिए। फिर, 10 मिनट के लिए 100% शराब और xylene का 1:1 मिश्रण जोड़ें, इसके बाद प्रत्येक 10 मिनट के लिए दो बार xylene जोड़ें।
    3. आरओ को 40 मिनट के लिए पिघले हुए पैराप्लास्ट ( सामग्री की तालिकादेखें) से भरे धातु के सांचों में रखें, और फिर आरओ को ठीक करने के लिए बर्फ पर नए नए साँचे बुझाएं। सांचों में एम्बेडिंग बक्से रखें और उन्हें रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें। इसके बाद, एम्बेडिंग बॉक्स को ध्यान से अलग करें। अंत में, उन्हें आरटी पर स्टोर करें।
    4. एक पैराफिन स्लाइसर के साथ निरंतर वर्गों (5 माइक्रोन मोटाई) बनाएँ. आसंजन माइक्रोस्कोप स्लाइड पर स्लाइस फिक्स, सूखी, और आरटी पर दुकान.
    5. प्रतिजन मरम्मत12,27 से पहले dewaxing और पुनर्जलीकरण प्रदर्शन.
    6. डीडीएच2ओ (डबल डिस्टिल्ड एच2ओ) के 190 एमएल में 20x पीएच 6.0 साइट्रेट एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान (सामग्री की तालिकादेखें) के 10 एमएल जोड़ें। उबलने तक 4 मिनट के लिए उच्च मोड पर माइक्रोवेव में गरम करें। पैराफिन वर्गों को जोड़ने के बाद, प्रतिजन मरम्मत को पूरा करने के लिए 20 मिनट के लिए कम मोड पर वर्गों गर्मी.
    7. पैराफिन वर्गों को हवादार क्षेत्र में स्वाभाविक रूप से ठंडा होने दें और फिर उन्हें आर्द्र कक्ष में रख दें।
    8. अनुभागों को रेखांकित करने के लिए पैप पेन ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें। झिल्ली को तोड़ने के लिए 30 मिनट के लिए आरटी पर 0.2% ट्राइटन एक्स-100 के साथ इनक्यूबेट करें, इसके बाद प्रत्येक 5 मिनट के लिए टीपीबीएस के साथ तीन बार स्लाइड धोएं।
    9. 10% गधा सीरम के साथ ब्लॉक 10 डिग्री सेल्सियस प्रति धुंधला क्षेत्र के साथ एक आर्द्र कक्ष में 1 घंटे के लिए आरटी पर डीपीबीएस में पतला।
    10. 10% गधा सीरम में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें। एक आर्द्रता कक्ष में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं। अनबाउंड एंटीबॉडी को हटाने के लिए प्रत्येक 10 मिनट के लिए टीपीबीएस के साथ तीन बार नमूने धोएं।
      नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी निम्नानुसार हैं: एंटी-PAX6 (1: 250), एंटी-SOX2 (1: 200), एंटी-KI67 (1: 200), एंटी-CHX10 (1: 200), एंटी-β ट्यूबुलिन III (1: 250) और एंटी-नेस्टिन (1: 200) ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    11. एक आर्द्र कक्ष में आरटी पर 1 घंटे के लिए डीपीबीएस में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं। टीपीबीएस के साथ धोने के चरण को प्रत्येक 10 मिनट के लिए तीन बार दोहराएं।
      नोट: फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी की शमन को रोकने के लिए अंधेरे में रखें। माध्यमिक एंटीबॉडी एलेक्सा फ्लोर 488 गधा विरोधी माउस आईजीजी और एलेक्सा फ्लोर 568 के साथ संयुग्मित हैं जो 1:400 के कमजोर पड़ने पर गधा विरोधी खरगोश आईजीजी के साथ संयुग्मित हैं ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    12. अंधेरे में आरटी पर 10 मिनट के लिए डीएपीआई (1: 500; सामग्री की तालिकादेखें) युक्त डीपीबीएस के साथ इनक्यूबेट करें। प्रत्येक 10 मिनट के लिए TPBS के साथ तीन बार धो लें.
    13. स्लाइड पर एंटी-फ्लोरोसेंट सीलर ( सामग्री की तालिकादेखें) की उचित मात्रा ड्रॉप करें और कवर स्लिप के साथ कवर करें।
    14. एक प्रवाह की तरह ऊतक सेल मात्रात्मक विश्लेषक ( सामग्री की तालिकादेखें), या इसी तरह का उपयोग कल्पना करें।
    15. सूक्ष्म विश्लेषण के बाद अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर स्लाइड।

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Representative Results

संशोधित प्रोटोकॉल का एक चित्रमय अवलोकन चित्रा 1 में दिखाया गया है. एच 9-ईएससी का उपयोग आरओ उत्पन्न करने के लिए किया गया था जब कोशिकाओं को 70% -80% के घनत्व तक उगाया गया था। 96 वी-तल शंक्वाकार कुओं में एच 9-ईएससी के एकल-सेल निलंबन दिन 1 पर एकत्रित हुए और दिन 6 तक अच्छी तरह से परिचालित गोल ईबी का गठन किया। जैसे-जैसे संस्कृति का समय बढ़ता गया, ईबीएस की मात्रा धीरे-धीरे बढ़ती गई। 30 दिन, न्यूरोपीथेलियल जैसी संरचनाएं स्पष्ट रूप से बनाई गई थीं और दीर्घकालिक एनआर भेदभाव के दौरान मोटी हो गई थीं।

इसके अलावा, संशोधित विधि की तुलना दो अन्य तरीकों (कुवाहारा एट अल.12 और डॉपर एट अल.27) के साथ इसकी पुनरावृत्ति और दक्षता (अनुपूरक चित्रा 1) का मूल्यांकन करने के लिए की गई थी। इस अध्ययन में यह भी देखा गया कि संशोधित विधि के बाद दिन 1 पर ईबीएस की आकृति विज्ञान अन्य दो तरीकों की तुलना में थोड़ा खराब था। हालांकि, संशोधित विधि का उपयोग करके गठित न्यूरोपीथेलियल संरचनाएं दिन 18(चित्रा 2)पर अधिक निरंतर थीं। 30 दिन, संशोधित विधि का उपयोग करके प्राप्त शुरुआती एनआर आकार और आकार में समान थे और एक नियमित गोल आकार(चित्रा 3)दिखाया। अन्य दो विधियों की तुलना में, संशोधित विधि द्वारा गठित एनआर में पुटिका और आसंजन की कम घटना थी। इसके अलावा, एच 9-ईएससी के आधार पर, संशोधित विधि का उपयोग कर एनआर पैदा करने की सफलता दर क्रमशः कुवाहारा एट अल और डॉपर एट अल के तरीकों12,27 के लिए 26.9% और 69.24% से बढ़कर 87.39% हो गई (चित्र 3M)।

रेटिना विकास(चित्रा 4)से संबंधित मार्करों की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए एनआरएस के पैराफिन-एम्बेडेड वर्गों पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना किया गया था। परिणामों ने एक संशोधित विधि का उपयोग करके एच 9-ईएससी से प्राप्त एनआर में रेटिना से जुड़े मानव जीन की अभिव्यक्ति दिखाई। प्रकट होने वाला पहला सेल उपप्रकार रेटिना गैंग्लियन सेल है, जो मुख्य रूप से एनआर के बेसल पक्ष पर जमा होता है। टीयूजे 1 धुंधला रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (चित्रा 4I-L) के अक्षतंतु की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इसके अलावा, रेटिना पूर्वज कोशिकाओं के मार्करों को आंतरिक (PAX6+) और बाहरी (CHX10+) परतों(चित्रा 4A-H)दोनों में पाया गया था। प्रसार मार्कर KI67 के लिए सकारात्मक कोशिकाओं को बाहरी परत(चित्रा 4ए-डी)में वितरित किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: योजनाबद्ध अवलोकन। संशोधित संस्कृति प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध अवलोकन विशिष्ट समय बिंदुओं पर विभिन्न कारकों और तंत्रिका रेटिना विकास की प्रतिनिधि छवियों के अलावा दिखाता है। SFEBq: त्वरित एकत्रीकरण के साथ भ्रूण शरीर की तरह समुच्चय के सीरम मुक्त अस्थायी संस्कृति; केएसआर: नॉकआउट सीरम प्रतिस्थापन; gfCDM: वृद्धि कारक मुक्त रासायनिक रूप से परिभाषित माध्यम; एनआरडीएम: तंत्रिका रेटिना भेदभाव माध्यम; बीएमपी 4: हड्डी मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन 4. स्केल बार: 200 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: प्रारंभिक चरण में तीन अलग-अलग प्रोटोकॉल से प्राप्त रेटिना ऑर्गेनोइड की प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियां। 1 दिन, केवल संशोधित विधि ईबीएस (ए, ई, आई) से नहीं थी। 6 दिन, ईबीएस सभी तीन तरीकों (बी, एफ, जे) में गठित। 18 दिन, प्रारंभिक तंत्रिका रेटिना का गठन किया गया था, और तीन प्रेरण विधियों (सी, जी, के) के बीच अलग-अलग आकृति विज्ञान पाया गया था। 21 दिन, संशोधित विधि द्वारा उत्पन्न तंत्रिका रेटिना ने निरंतर न्यूरोपीथेलियल संरचना (डी, एच, एल) दिखाई। स्केल बार: 200 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: 30, 45, 60 दिनों में निलंबन संस्कृति में परिपक्व 3 डी तंत्रिका रेटिना। 30 दिन, तंत्रिका रेटिना सभी तीन तरीकों (ए, ई, आई) में गठित हुई। तीर कुवाहारा एट अल की विधि (बी) में सिस्टिक संरचनाओं को इंगित करते हैं। सफेद बिंदीदार बक्से एक दूसरे (डी, एफ, एच) के ऑर्गेनोइड्स आसंजन और संलयन के क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं। संशोधित प्रोटोकॉल से उत्पन्न रेटिना ऑर्गेनोइड अन्य दो तरीकों (सी, जी, जे, के, एल) की तुलना में आकार और आकृति विज्ञान में समान हैं। स्केल बार: 100 माइक्रोन (सफेद); 200 माइक्रोन (काला)। H9-ESCs (M) का उपयोग करते हुए तीन विधियों द्वारा प्रेरण सफलता दर का सांख्यिकीय चार्ट। महत्व का परीक्षण करने के लिए विचरण के एकतरफा विश्लेषण का उपयोग किया गया था (त्रुटि पट्टियाँ मानक त्रुटि दिखाती हैं, n = 864, **P < 0.01, ***P < 0.001)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: संशोधित प्रोटोकॉल में तंत्रिका रेटिना की विशेषता। दिन 6, दिन 18, दिन 30 और दिन 60 पर तंत्रिका रेटिना की इम्यूनोस्टेनिंग छवियां। हरे दाग KI67 (प्रसार सेल), PAX6 (रेटिना पूर्वज सेल), और नेस्टिन (तंत्रिका स्टेम सेल) के लिए हैं। लाल दाग CHX10 (रेटिना पूर्वज सेल), SOX2 (तंत्रिका पूर्वज सेल), और TUJ1 (रेटिना गैंग्लियन सेल) के लिए हैं। स्केल बार: 100 माइक्रोन (ए, बी, ई, एफ, आई, जे); 200 माइक्रोन (सी, डी, जी, एच, के, एल)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: तीन रेटिना ऑर्गेनॉइड प्रेरण प्रोटोकॉल के लिए प्रवाह चार्ट की तुलना। SFEBq: त्वरित एकत्रीकरण के साथ भ्रूण शरीर की तरह समुच्चय के सीरम मुक्त अस्थायी संस्कृति; केएसआर: नॉकआउट सीरम प्रतिस्थापन; gfCDM: वृद्धि कारक मुक्त रासायनिक रूप से परिभाषित माध्यम; एनआरडीएम: तंत्रिका रेटिना भेदभाव माध्यम; बीएमपी 4: हड्डी मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन 4. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 2: भ्रूण शरीर (ईबी) की आकृति विज्ञान कुवाहरेट अल की विधि से प्रेरित है। मृत कोशिका गुच्छों की क्रमिक उपस्थिति 6 दिन (एडी, काले तीर) पर बीएमपी 4 के अलावा के बाद ईबीएस के आसपास मनाया गया था। दिन 6 (ई-एल) के बाद बड़े रूपात्मक अंतर देखे गए, और कुछ ईबी भी पूरी तरह से निष्क्रिय (एच, एल) थे। ईएससी: भ्रूण स्टेम सेल, पीबीएमसी : परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल, आईपीएससी: प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल। स्केल बार: 200 माइक्रोन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

मानव आरओ स्थानिक और अस्थायी भ्रूण रेटिना के विकास recapituate कर सकते हैं, और जल्दी आरओ विकास15 के बराबर चरणों में भ्रूण रेटिना के लिए समानता का एक उच्च डिग्री का प्रदर्शन. ऊतक आकृति विज्ञान और आणविक अभिव्यक्ति के संदर्भ में, मानव आरओ रेटिना ऊतक की वास्तविक विकास स्थिति को बारीकी से प्रतिबिंबित करता है, जो रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग और पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र में जबरदस्त और अभूतपूर्व अवसर प्रदान करता है। वर्तमान में, इन विट्रो में मानव पीएससी से आरओ उत्पन्न करने के लिए कई अलग-अलग तरीके स्थापित किए गए हैं,और दक्षता में सुधार के लिए निरंतर संशोधन और अनुकूलन चल रहे हैं। ससाई प्रयोगशाला ने पहली बार मानव ईएससी11 से पीएससी-व्युत्पन्न आरओ की पीढ़ी की सूचना दी। मानव ईएससी को पहले एकल-सेल निलंबन में तैयार किया गया था, और फिर समान संख्या में कोशिकाओं को 96 वी-तल वाले शंक्वाकार कुओं में वरीयता दी गई थी, जिसमें परिपत्र जैसे ईबीएस बनाने के लिए तेजी से एकत्रीकरण किया गया था। कुंजी सेल सिग्नलिंग मार्गों के बाहरी जोड़ ने ईबीएस में ऑप्टिक पुटिकाओं के गठन को बढ़ावा दिया, जो बाद में निलंबन संस्कृति में टुकड़े टुकड़े में आरओ में परिपक्व हो गया। एनआर में एक ग्लियाल सेल प्रकार और छह अलग-अलग न्यूरोनल सेल प्रकार होते हैं, जो रेटिना के विकास के कई पहलुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं, जैसे सेल मॉर्फोजेनेसिस, न्यूरॉन भेदभाव और एपिकल-बेसल ध्रुवीयता9. हालांकि समुच्चय के केवल 10% एक डबल दीवार ऑप्टिक कप संरचना का गठन किया, यह अधिक उन्नत आरओ11 के उत्पादन के विकास में एक प्रमुख मील का पत्थर था.

इसके बाद, झोंग एट अल एक नया विकल्प है, जिसमें hiPSCs पहले संगम के करीब उगाया गया, अस्थायी छोटे समुच्चय13 में रासायनिक या यांत्रिक विघटन के बाद शुरू की. फिर, छोटे समुच्चय ने निलंबन संस्कृति में ईबीएस का गठन किया, जो प्लेट के नीचे से अलग हो गया, आगे तंत्रिका दिशा में अंतर किया। झोंग एट अल ने अपेक्षाकृत अच्छी तरह से विकसित फोटोरिसेप्टर बाहरी खंडों के साथ पूरी तरह से टुकड़े टुकड़े में 3 डी रेटिना का प्रदर्शन किया जो प्रकाश उत्तेजना का जवाब देता था। इस विधि सेल सिग्नलिंग रास्ते के कम बाहरी विनियमन की आवश्यकता है और मुख्य रूप से एक आत्म निर्देशित तरीके से9 में प्रदर्शन किया गया था. तीसरी तकनीकी क्रांति लोव समूह25 द्वारा एम्बेडिंग विधि की शुरूआत थी। इसमें एकल-लुमेन उपकला संरचना बनाने के लिए ईसीएम में एचईएससी समुच्चय को एम्बेड करना शामिल था। एंजाइमी फैलाव के बाद, परिपक्व आरओ बनाने के लिए समुच्चय को निलंबन संस्कृति में बनाए रखा गया था। यद्यपि सभी तीन विधियां तुलनीय संरचना और कार्य के साथ आरओ को सफलतापूर्वक प्रेरित कर सकती हैं, बड़े पैमाने पर अनुप्रयोगों में उनकी उच्च विविधता और कम सफलता दर23 के कारण समय लेने वाली और श्रमसाध्य होने का नुकसान है।

उपरोक्त विधियों के अलावा, कुवाहारा एट अल ने एक नई प्रेरण विधि का प्रस्ताव दिया, अर्थात्, प्रमुख कारक ढाल गिरावट विधि12. उन्होंने पाया कि एनआर 6 दिन से घटती एकाग्रता पर बीएमपी 4 के अतिरिक्त द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है। इस प्रेरण प्रणाली ने आकार और आकृति विज्ञान की एकरूपता के साथ आरओ बनाने के लिए कम बाहरी कारकों का उपयोग किया। हालांकि, अध्ययनों से पता चला है कि गठित ईबीएस सिस्टिक घावों से ग्रस्त थे, और इस पद्धति की प्रेरण सफलता दर लगभग 40%12,28थी। डॉपर एट अल ईबीएस27 को स्थिर करने के लिए प्रेरण के प्रारंभिक चरण में तीन छोटे अणु अवरोधकों के साथ एक वाणिज्यिक माध्यम के संयोजन से सफलता दर में सुधार करने के लिए इस प्रोटोकॉल को संशोधित किया. इसके विपरीत, रेटिना के तंत्रिका उपकला की कोशिकाएं अधिक आसानी से एक दूसरे का पालन करती हैं, जिससे दीर्घकालिक निलंबन संस्कृति के दौरान प्रत्येक आरओ की अलग संस्कृति की आवश्यकता होती है। Döpper एट अल की विधि जटिलताओं और प्रयोगात्मक संचालन की लागत बढ़ जाती है और बड़े पैमाने पर प्रेरण27 के लिए उपयुक्त नहीं है. अनुकूलित आरओ उत्पादन प्रोटोकॉल ने प्रेरण दक्षता में सुधार किया। वर्तमान संशोधित विधि की तुलना कुवाहारा एट अल और डॉपर एट अल के तरीकों से की गई थी।

इस अध्ययन से पता चला है कि कुवाहारा एट अल और डॉपर एट अल दोनों के तरीकों ने दिन 1 पर चिकनी किनारों के साथ ईबीएस का गठन किया, जबकि वर्तमान संशोधित विधि को ईबीएस बनाने के लिए अपेक्षाकृत लंबे समय की आवश्यकता थी, लगभग 6 दिन तक। कुवाहारा एट अल की विधि का उपयोग करके प्राप्त ईबीएस की मात्रा डोपर एट अल की विधि का उपयोग करके प्राप्त की तुलना में बड़ी थी, और डोपर एट अल की विधि का उपयोग करके प्राप्त ईबीएस ने तरल प्रवाह के तहत तरलता में वृद्धि दिखाई। विशेष रूप से, कुवाहारा एट अल की विधि (अनुपूरक चित्रा 2) का उपयोग करते समय दिन 6 पर बीएमपी 4 के अलावा के बाद मृत कोशिका के गुच्छे धीरे-धीरे ईबीएस के आसपास दिखाई दिए। 18 दिन तक, कुवाहारा एट अल की विधि के ईबीएस में महत्वपूर्ण रूपात्मक अंतर देखे गए, और कुछ ईबी पूरी तरह से निष्क्रिय हो गए (अनुपूरक चित्रा 2)। डॉपर एट अल की विधि में, अधिकांश ईबी गोल और अच्छी तरह से परिचालित थे, और उनके चारों ओर केवल बिखरे हुए मृत कोशिकाओं की एक छोटी संख्या का प्रदर्शन किया गया था। संशोधित विधि ने मामूली रूपात्मक मतभेदों के साथ तंग और अच्छी तरह से संरचित ईबीएस का गठन किया, और उनके चारों ओर कुछ मृत कोशिकाएं देखी गईं।

इसके अलावा, इस अध्ययन में यह भी पाया गया कि कुछ ईबी ने 6-अच्छी प्लेटों में स्थानांतरण के बाद प्रारंभिक चरण में कुवाहारा एट अल द्वारा पुटिकाएं उत्पन्न कीं, जिसके परिणामस्वरूप आरओ बनाने में विफलता हुई। आरओ का आसंजन और संलयन 40 दिन के आसपास हुआ, जिसने प्रयोगों की उपयोगिता को काफी कम कर दिया। डॉपर एट अल की विधि की संस्कृति प्रणाली अधिक जटिल है, और कुवाहारा एट अल की विधि की तुलना में अधिक परिचालन कदम और उच्च लागत की आवश्यकता है। डोपर एट अल द्वारा अधिकांश आरओ ने अनिवार्य रूप से एक दूसरे के साथ आसंजन और संलयन भी विकसित किए। इस अध्ययन में संशोधित विधि ने सफलतापूर्वक इन विट्रो में 3D NRs उत्पन्न किए जो मानव रेटिना से संबंधित मार्करों CHX10, KI67, PAX6, SOX2, TUJ1 और NESTIN को व्यक्त करते हैं। और संशोधित विधि द्वारा अधिकांश आरओ आकार और आकृति विज्ञान में सुसंगत थे, और रेटिना भेदभाव के देर के चरणों के दौरान बहुत कम पुटिका या आसंजन विकसित हुए।

अन्य दो तरीकों की तुलना में, नई संस्कृति प्रणाली में एक सरल परिचालन कदम और कम लागत थी। संशोधित विधि में महत्वपूर्ण कदम मीडिया में तीन छोटे अणु अवरोधकों को जोड़ना है और यह सुनिश्चित करना है कि ईबीएस की संरचना को स्थिर करने के लिए प्लेट को पहले छह दिनों के लिए स्थानांतरित नहीं किया जाता है। प्रारंभिक चरण में प्लेटों की गति या किसी भी सेल हेरफेर ईबीएस के गठन को प्रभावित कर सकता है। अन्य दो तरीकों की तुलना में, संशोधित विधि ने दिन 1 पर माध्यम नहीं बदला और 15 दिन पर छोटे अणु अवरोधकों के उपयोग को भी कम कर दिया। संक्षेप में, संशोधित विधि के संचालन चरणों को कुछ हद तक सरल बनाया जाता है, और प्रयोगात्मक लागत मीडिया और अभिकर्मकों के कम उपयोग के साथ बचाई जाती है। हालांकि, संशोधित विधि अभी भी वर्तमान ऑर्गेनॉइड कल्चर सिस्टम की सामान्य समस्याओं को हल नहीं कर सकती है। इसके अलावा, आरओ प्रेरण दक्षता काफी हद तक एचपीएससी की गुणवत्ता और भेदभाव क्षमता पर निर्भर करती है। इस अध्ययन में, केवल एच 9-ईएससी का उपयोग कर एनआर पीढ़ी की दक्षता पूरी तरह से गणना की गई थी। हमने वर्तमान अध्ययन में नई विधि के साथ विभिन्न एचपीएससी लाइनों में आरओ को सफलतापूर्वक प्रेरित किया, और एच 9, एच 1 और पीबीएमसी -आईपीएससी सहित समान प्रेरण दक्षता हासिल की। तीन सेल लाइनों के बीच प्रेरण दक्षता में कोई सांख्यिकीय अंतर नहीं है। भविष्य में, इस पद्धति का उपयोग करके विभिन्न एचपीएससी की प्रेरण दक्षता का पता लगाने के लिए अधिक अध्ययनों की आवश्यकता है।

अंत में, अनुकूलित रेटिना प्रेरण प्रोटोकॉल सरल और सस्ती है, उच्च पुनरावृत्ति और दक्षता है, रेटिना रोगों के आशाजनक व्यक्तिगत मॉडल प्रदान करता है, और सेल थेरेपी के लिए एक प्रचुर मात्रा में सेल स्रोत प्रदान करता है, दवा स्क्रीनिंग, और जीन थेरेपी परीक्षण.

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Disclosures

सभी लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

कोई नहीं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.01 M TPBS Servicebio G0002 Washing slices
4% Paraformaldehyde Servicebio G1101-500ML Fix retinal organoids
5 mL Pasteur pipette NEST Biotechnology 318516 Pipette retinal organoids
96 V-bottomed conical wells Sumitomo Bakelit MS-9096VZ
Adhesion Microscope Slides CITOTEST 188105 Fix slices
AggreWell medium STEMCELL Technologies 5893 Medium
Anhydrous ethanol SINOPHARM 10009218 Dehydrate 
Anti-CHX10 Santa Cruz sc-365519 Primary antibody
Antifade Solution ZSGB-BIO ZLI-9556
Anti-KI67 Abcam ab16667 Primary antibody
Anti-NESTIN Sigma N5413 Primary antibody
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) Beyotime AT809 Primary antibody
Anti-PAX6 Abcam ab195045 Primary antibody
Cell dissociation solution(CDS) STEMCELL Technologies 7922 Cell dissociation
CHIR99021 Selleckchem S2924 GSK-3α/β inhibitor
Cholesterol Lipid Concentrate Gibco 12531018 250×
Citrate Antigen Retrieval Solution Servicebio G1202-250ML 20×, pH 6.0
CS10 STEMCELL Technologies 1001061 Cell Freezing Medium
DAPI Roche 10236276001 Nuclear counterstain
Dimethyl sulfoxide(DMSO) Sigma D2650
DMEM/F12 Gibco 11330032 Medium
DMEM/F12-GlutaMAX Gibco 10565018 Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 Invitrogen A32766 Secondary Antibody
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Invitrogen A10042 Secondary Antibody
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) Biosharp BL518A 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation
Extracellular matrix (ECM) Corning 354277 Coating plates
F12-Glutamax Gibco 31765035 Medium
Fetal Bovine Serum Gibco A5669701
Flow-like tissue cell quantitative analyzer TissueGnostics TissueFAXS Plus Scan sections
IMDM-GlutaMAX Gibco 31980030 Medium
IWR1-endo Selleckchem S7086 Wnt-inhibitor
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828028
LDN-193189 2HCl Selleckchem S7507 BMP-inhibitor
Low-adhesion 24-well Plates Corning 3473
Low-adhesion 6-well Plates Corning 3471
Maintenance medium (MM) STEMCELL Technologies 85850 Medium
N2 supplement Gibco 17502048
Normal Donkey Serum Solarbio SL050 Blocking buffer
Paraplast Leica 39601006 Tissue embedding
PBS pH 7.4 basic (1x) Gibco C10010500BT Without Ca+,Mg+
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) R&D 314-BP Key protein factor
Retinoic acid Sigma R2625 Powder, keep out of light
SB431542 Selleckchem S1067 ALK5-inhibitor
SU5402 Selleckchem S7667 Tyrosine kinase inhibitor
Super PAP Pen ZSGB-BIO ZLI-9305
Taurine Sigma T0625-10G
Thioglycerol Sigma M1753
Triton X-100 Sigma X100 Permeabilization
WA09 embryonic stem cell line WiCell Research Institute Cell line
Xylene SINOPHARM 10023418 Dewaxing
Y-27632 2HCL Selleckchem S1049 ROCK-inhibitor

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 202
मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से तंत्रिका रेटिना उत्पन्न करना
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Li, W., Li, H., Yan, H., Gao, L., Wang, X., Zhao, L., Yan, Y., Ye, Z., Xi, J., Yue, W., Li, Z. Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (202), e66246, doi:10.3791/66246 (2023).

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