Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Анализ инфекции эпителиальных клеток с помощью шигелл

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/66426
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

В настоящем протоколе описаны тесты на инфекции для исследования приверженности шигелл , инвазии и внутриклеточной репликации с использованием эпителиальных клеточных линий in vitro .

Abstract

Адаптированный к человеку кишечный бактериальный патоген шигелла вызывает миллионы инфекций каждый год, создает долгосрочные эффекты роста среди педиатрических пациентов и является основной причиной смерти от диареи во всем мире. Инфекция вызывает водянистую или кровавую диарею в результате того, что патоген проходит через желудочно-кишечный тракт и инфицирует эпителиальные клетки, выстилающие толстую кишку. В условиях ошеломляющего роста устойчивости к антибиотикам и отсутствия в настоящее время одобренных вакцин стандартизированные протоколы исследований имеют решающее значение для изучения этого грозного патогена. Представлены методики изучения молекулярного патогенеза шигелл с использованием in vitro анализа бактериальной адгезии, инвазии и внутриклеточной репликации в эпителиальных клетках толстой кишки. Перед проведением анализа инфекции фенотип вирулентности колоний шигелл был проверен путем поглощения красного красителя Конго на агаровых пластинах. Во время бактериального культивирования также можно рассмотреть возможность использования дополнительных лабораторных сред для имитации условий in vivo . Затем бактериальные клетки используются в стандартизированном протоколе для инфицирования эпителиальных клеток толстой кишки в тканевых культуральных планшетах при установленной множественности инфекции с адаптацией для анализа каждой стадии инфекции. Для анализа на адгезию клетки шигелл инкубируют с пониженными уровнями среды, чтобы способствовать контакту бактерий с эпителиальными клетками. Как для инвазий, так и для внутриклеточной репликации гентамицин применяется в течение различных временных интервалов для уничтожения внеклеточных бактерий и обеспечения возможности оценки инвазии и/или количественной оценки скорости внутриклеточной репликации. Во всех протоколах инфекции перечисляются адгезивные, инвазированные и/или внутриклеточные бактерии путем последовательного разбавления лизатов инфицированных эпителиальных клеток и нанесения бактериальных колониеобразующих единиц относительно титров инфекции на пластинах из конголезского красного агара. Вместе эти протоколы позволяют проводить независимые характеристики и сравнения для каждой стадии инфекции эпителиальных клеток шигеллами для успешного изучения этого патогена.

Introduction

Диарейные заболевания, вызываемые кишечными бактериальными патогенами, представляют собой серьезное глобальное бремя для здравоохранения. В 2016 г. диарейные заболевания стали причиной 1,3 миллиона случаев смерти во всем мире и были четвертой по значимости причиной смерти детей в возрасте до пяти лет. Грамотрицательный кишечный бактериальный патоген шигелла является возбудителем шигеллеза, основной причины смерти от диареи во всем мире3. Шигеллез ежегодно вызывает значительную заболеваемость и смертность среди детей из стран с низким и средним уровнем дохода 4,5, в то время как инфекции в странах с высоким уровнем дохода связаны со вспышками в детских садах, пищевых продуктах и водным путем 6,7,8,9. Неэффективная разработкавакцин10 и растущие показатели устойчивости к противомикробным препаратам (УПП)11,12 осложняют борьбу с крупномасштабными вспышками шигеллы. Последние данные Центров по контролю и профилактике заболеваний показывают, что почти 46% инфекций шигелл в Соединенных Штатах проявили лекарственную устойчивость в 2020 году13,14, в то время как Всемирная организация здравоохранения объявила шигеллы приоритетным патогеном УПП, для которого срочно необходимы новые методылечения15.

Шигелла-инфекции легко передаются фекально-оральным путем при употреблении зараженной пищи или воды или при прямом контакте с человеком. Шигеллы эволюционировали, чтобы стать эффективным, адаптированным к человеку патогеном, с инфекционной дозой 10-100 бактерий, достаточной для того, чтобы вызвать заболевание16. Во время транзита в тонком кишечнике шигеллы подвергаются воздействию сигналов окружающей среды, таких как повышенная температура и желчь17. Обнаружение этих сигналов индуцирует транскрипционные изменения для экспрессии факторов вирулентности, которые усиливают способность бактерий инфицировать толстую кишку человека 17,18,19. Шигеллы не проникают в эпителий толстой кишки с апикальной поверхности, а проходят через эпителиальный слой после поглощения в специализированные антигенпрезентирующие микроскладчатые клетки (М-клетки) в фолликул-ассоциированном эпителии 20,21,22. После трансцитоза клетки шигелл фагоцитируются резидентными макрофагами. Шигеллы быстро ускользают из фагосомы и запускают гибель клеток макрофагов, что приводит к высвобождению провоспалительных цитокинов 5,23,24. Затем шигеллы вторгаются в эпителиальные клетки толстой кишки с базолатеральной стороны, лизируют макропиноцитарную вакуоль и создают репликативную нишу в цитоплазме 5,25. Провоспалительные цитокины, особенно интерлейкин-8 (IL-8), рекрутируют полиморфноядерные нейтрофильные лейкоциты (ПМН) к месту инфекции, что ослабляет эпителиальные плотные соединения и позволяет бактериальной инфильтрации эпителиальной выстилки усугублять базолатеральную инфекцию5. ПМН разрушают инфицированную эпителиальную выстилку, чтобы сдержать инфекцию, что приводит к характерным симптомам бациллярной (кровяной) дизентерии5. Несмотря на то, что механизмы инвазии и внутриклеточной репликации были тщательно охарактеризованы, новые исследования демонстрируют важные новые концепции в отношении инфекции шигелл, включая регуляцию вирулентности во время желудочно-кишечного транзита (ЖКТ)17, приверженность к лечению19, улучшенный базолатеральный доступ через барьерную проницаемость26 и бессимптомное носительство у детей с недостаточностью питания27.

Способность Shigella spp. вызывать диарейные заболевания ограничена людьми и нечеловекообразными приматами (NHP)28. Были разработаны модели кишечных инфекций шигелл для рыбок данио29, мышей30, морских свинок31, кроликов 21,32,33 и свиней34,35. Однако ни одна из этих модельных систем не может точно воспроизвести характеристики заболевания, наблюдаемые при инфицировании человека36. Несмотря на то, что для изучения патогенеза шигелл были созданы NHP-модели, эти модельные системы являются дорогостоящими в реализации и требуют искусственно высоких инфекционных доз, на девять порядков превышающих инфекционную дозу человека 37,38,39,40,41,42. Таким образом, замечательная адаптация шигелл к инфекции человека-хозяина обусловливает необходимость использования культур клеток человеческого происхождения для воссоздания физиологически релевантных моделей для точного исследования патогенеза шигелл.

Здесь подробно описаны процедуры для измерения скорости адгезии шигелл , инвазии и репликации в эпителиальных клетках толстой кишки HT-29. Используя эти стандартизированные протоколы, можно исследовать молекулярные механизмы, с помощью которых гены вирулентности бактерий и сигналы окружающей среды влияют на каждый этап инфекции шигелл , чтобы лучше понять динамическую взаимосвязь между хозяином и патогеном.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка реагентов и материалов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все объемы соответствуют анализу с использованием двух 6-луночных планшетов.

  1. Среда TSB: Добавьте 0,5 л деионизированной (DI) воды к 15 г среды триптического соевого бульона (TSB, см. Таблицу материалов) и автоклав. Хранить при комнатной температуре.
  2. Среда желчных солей (БСЭ + БС): Для приготовления БСЭ, содержащего 0,4% (по массе) желчных солей, ресуспендировать 0,06 г желчных солей (БС, см. Таблицу материалов) в 15 мл автоклавного БСЭ. Фильтр стерилизовать с помощью фильтра PES 0,22 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Желчные соли состоят из смеси холата натрия и дезоксихолата натрия в соотношении 1:1. Готовьте свежие средства непосредственно перед использованием.
  3. DMEM + 10% (v/v) FBS: добавьте 5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) к 45 мл модифицированной орлиной среды (DMEM) Dulbecco. Хранить при температуре 4 °C.
  4. ДМЕМ + гентамицин: В пробирку объемом 50 мл добавьте 50 мл ДМЕМ и 50 мкл гентамицина 50 мг/мл (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед каждым экспериментом готовьте свежую, аликвотную и теплую на водяной бане с температурой 37 °C.
  5. PBS + 1% (v/v) Triton X-100: добавьте 150 мкл Triton X-100 к 15 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед каждым экспериментом готовьте свежую, аликвотную и теплую на водяной бане с температурой 37 °C.
  6. Красные индикаторные пластины TSB + Congo: Добавьте в бутылку объемом 1 л 15 г TSB, 7,5 г отборного агара и 0,125 г красного красителя Congo (см. Таблицу материалов). Добавьте 0,5 л деионизированной воды и автоклав. Налейте 10-20 мл среды в отдельные стерильные чашки Петри (100 мм x 15 мм) и дайте застыть.
    ВНИМАНИЕ: Конголезский красный является канцерогеном и репродуктивным токсином. Убедитесь, что обращение с конголезским красным осуществляется с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты. Дополнительную информацию см. в паспорте безопасности продукта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Около 20 пластин изготовлены из 0,5 л красной среды Конго. Тарелки можно подготовить за 2-3 дня и оставить перевернутыми при комнатной температуре до использования. Для длительного хранения поместите перевернутые пластины в пластиковые гильзы при температуре 4 °C на срок до 3 месяцев.
  7. DMEM + 10% (v/v) FBS и 5% (v/v) диметилсульфоксида (DMSO): добавьте 42,5 мл DMEM, 5 мл FBS и 2,5 мл DMSO в пробирку объемом 50 мл. Хранить при температуре 4 °C.

2. Подготовка бактерий

ПРИМЕЧАНИЕ: Все протоколы лабораторного культивирования и хранения шигелл адаптированы из Payne, S. M.43.

ВНИМАНИЕ: Shigella spp. относятся к группе риска2 44. Выполняйте все лабораторные работы в среде BSL-2 с принятием дополнительных мер безопасности для ограничения случайного воздействия из-за низкой инфекционной дозы Shigella spp.

  1. Рост шигелл из замороженных запасов
    1. Переложите небольшое количество замороженной культуры из криогенного флакона на планшет с красным агаром TSB + Congo с помощью стерильного аппликатора.
    2. Пламенем простерилизуйте инокуляционный контур и дайте ему остыть. Проведите посевной материалом вперед и назад по одному квадранту пластины. Зажгите петлю, дайте ей остыть, затем проведите из первого квадранта во второй квадрант пластины. Повторите то же самое, чтобы распределить посевной материал по третьему и четвертому квадрантам пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно прорисовать посевной материал с помощью свежего стерильного аппликатора между каждым квадрантом.
    3. Переверните планшет и инкубируйте при температуре 37 °C в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация при температуре ≥37 °C необходима для экспрессии факторов вирулентности шигелл , необходимых для наблюдения конголезского красноположительного (CR+) фенотипа45. Колонии авирулентов будут иметь белый вид и не будут инвазивными.
    4. Закройте пластину парафиновой пленкой и храните в холодильнике при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии бактерий остаются жизнеспособными на агаровых пластинах в течение 1-2 недель.
  2. Ночное выращивание шигелл в жидкой культуре
    1. Аликвоту 3 мл среды TSB в стерильные культуральные пробирки по 14 мл.
    2. Выберите одиночную, хорошо изолированную красную (CR+) колонию с помощью стерильного аппликатора и ресуспендируйте в жидкой среде.
    3. Инкубируют культуры в течение ночи (16-18 ч) при 37 °C при встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту (об/мин).

3. Подготовка эукариотических клеток HT-29

ПРИМЕЧАНИЕ: Все объемы соответствуют анализу с использованием двух 6-луночных планшетов. Клеточные линии HT-29 были получены из Американской коллекции типовых культур (ATCC). Протоколы технического обслуживания HT-29 адаптированы из рекомендаций46 ATCC. Перед использованием все среды должны быть предварительно прогреты на водяной бане при температуре 37 °C. Все протоколы технического обслуживания HT-29 должны выполняться в шкафу биобезопасности. Воздерживайтесь от образования пузырьков при смешивании/работе с клетками HT-29 в среде, чтобы избежать резких изменений pH.

  1. Размораживание ячеек HT-29 из замороженного сырья
    1. Разморозьте флакон с ячейками HT-29 на водяной бане с температурой 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что колпачок полностью находится над водой, чтобы избежать загрязнения. Размораживание должно занять не более 2 минут.
    2. Выньте флакон из воды сразу после того, как культура полностью оттает, и обеззаражьте 70% этиловым спиртом. Убедитесь, что все шаги, начиная с этого момента, выполняются с использованием асептических методов.
    3. Добавьте все содержимое флакона в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 9 мл DMEM + 10% FBS. Центрифуга при 125 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
    4. Сцедите надосадочную жидкость в контейнер для отходов и повторно суспендируйте гранулу в 10 мл теплого DMEM + 10% FBS. Переносят ресуспендированные клетки в колбу для тканевой культуры 75см2 (Т75), содержащую 10 мл теплого ДМЭМ + 10% FBS (общий объем 20 мл).
    5. Инкубируют клетки при 37 °C с 5% CO2 до тех пор, пока клетки не достигнут 90% слияния (примерно 6-7 дней).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Слияние оценивается с помощью визуальной аппроксимации.
  2. Посев ячеек HT-29
    1. Предварительно нагрейте 20 мл PBS и 50 мл DMEM + 10% FBS на водяной бане с температурой 37 °C и предварительно подогрейте 3 мл 0,25% (w/v) трипсина-ЭДТА до комнатной температуры.
    2. После того, как клетки HT-29 (из шага 3.1) достигнут 90% слияния, сцедите питательную среду для клеток HT-29 из колбы T75 в контейнер для отходов. Налейте ~10 мл теплого PBS в колбу и осторожно перемешайте, чтобы промыть. Слейте PBS в контейнер для отходов. Еще раз промойте теплым PBS и сцедите.
    3. Добавьте 2-3 мл 0,25% (по массе) трипсина-ЭДТА и аккуратно взболтайте по всей площади поверхности. Инкубировать при 37 °C с 5%СО2 в течение 4 мин.
    4. Извлеките колбу из инкубатора и аккуратно взболтайте Трипсин-ЭДТА, визуально убедившись, что все клетки отделились от поверхности.
    5. Немедленно добавьте 6 мл теплого DMEM + 10% FBS, чтобы деактивировать трипсин. Пипеткой вверх и вниз тщательно перемешать.
    6. Переложите все содержимое в центрифужную пробирку объемом 15 мл и вращайте ее при 500 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
    7. Аккуратно сцедите надосадочную жидкость в контейнер для отходов и повторно суспендируйте гранулу в 6 мл теплого DMEM + 10% FBS.
    8. Сразу после ресуспензии переносят 10 мкл взвешенных клеток HT-29 из середины культуры в ПЦР-пробирку объемом 0,2 мл. Добавьте в ПЦР-пробирку 10 мкл красителя трипанового синего и перемешайте.
    9. Добавьте 10 мкл смеси клеток HT-29 и трипанового синего в одноразовое предметное стекло камеры счетчика клеток Countess (см. Таблицу материалов). Перечислите количество живых клеток и рассчитайте жизнеспособность клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При документировании количества клеток в образце считывайте число под «живым» количеством клеток, а не общее количество клеток. В качестве альтернативы подсчет клеток может быть выполнен вручную с помощью гемоцитометра.
    10. Семена ресуспендировали клетки HT-29 в свежую колбу Т75 или 6-луночную пластину.
      1. Для колбы Т75:
        1. Пипетку аккуратно перемешать, затем переложить 2,5 x 106 ячеек в свежую колбу Т75 в соответствии с приведенным ниже уравнением:
          Equation 1
        2. Добавьте теплую среду DMEM + 10% FBS до конечного объема 20 мл (конечная концентрация 1,25 x 105 клеток/мл).
        3. Равномерно распределите клетки по колбе, осторожно покачивая вперед и назад.
        4. Инкубируют при 37 °C с 5%CO2 до тех пор, пока клетки не достигнут 80% слияния.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимального роста заменяйте фильтрующий материал DMEM + 10% FBS в колбе T75 каждые ~3 дня. Сцедите среду в контейнер для отходов и добавьте в колбу 10 мл теплого PBS. Осторожно перемешайте PBS и слейте его в контейнер для отходов. Затем добавьте в колбу 20 мл свежего теплого ДМЕМ + 10% FBS и верните в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO2 .
      2. Для 6-луночного планшета:
        1. Пипетку аккуратно перемешать, затем переложить 5,85 x 106 клеток в свежую коническую пробирку объемом 50 мл в соответствии с приведенным ниже уравнением:
          Equation 2
        2. Добавьте теплую среду DMEM + 10% FBS до конечного объема 26 мл (конечная концентрация 2,25 x 105 клеток/мл).
        3. Пипетку осторожно перемешать, затем дозировать 2 мл (4,5 x 105 ячеек) в отдельные лунки 6-луночных планшетов.
        4. Равномерно распределите клетки по лунке, осторожно покачивая вверх/вниз и влево/вправо 2-3 раза.
        5. Инкубируют при 37 °C с 5% CO2 до тех пор, пока клетки не достигнут слияния 80%-95% (примерно 3-4 дня).
          ПРИМЕЧАНИЕ: 85% конфлюэнтность рекомендуется для инвазий и внутриклеточной репликации, в то время как 90%-95% конфлюэнтность рекомендуется для анализов адгезии. Клетки должны достичь ~85% слияния после 48 ч инкубации с конечной концентрацией примерно 1 x 106 клеток/лунку. Может потребоваться корректировка количества засеянных клеток и продолжительности инкубации.
  3. Изготовление замороженных бульонов HT-29
    1. Аликвоту 1 мл ДМЭМ + 10% ФБС + 5% ДМСО среды в индивидуальные криогенные флаконы.
    2. Добавьте 1 x 106 клеток HT-29 из шага 3.2.7 в каждый флакон. Рассчитайте объем ячеек по следующей формуле:
      Equation 3
    3. Храните ячейки HT-29 при температуре ниже -130 °C в морозильной камере для хранения паров жидкого азота.

4. Анализ на адгезию

ПРИМЕЧАНИЕ: Все объемы соответствуют анализу с использованием двух 6-луночных планшетов.

  1. Субкультурные культуры с однодневным разведением шигелл в соотношении 1:50 в свежих средах.
    1. Встряхните, затем добавьте 100 мкл каждой ночной культуры к 5 мл свежего БСЭ или БСЭ + БС в пробирку для культивирования подходящего размера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничьте объем культуры до <20% от объема колбы или пробирки для культуры, чтобы обеспечить надлежащую аэрацию.
    2. Инкубируют при 37 °C при встряхивании при 250 об/мин до тех пор, пока клетки не достигнут оптической плотности (OD600) 0,7 (средняя логарифмическая фаза роста шигеллы ); около 2-2,5 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время субкультивирования прибавьте 50 мл DMEM и достаточный объем PBS для всех этапов стирки и поместите на водяную баню с температурой 37 °C. Перед использованием дайте среде нагреться до 37 °C.
  2. Переложите 2 x 10 колониеобразующих единиц (КОЕ) субкультивируемых шигелл в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 2 x 108 КОЕ соответствует примерно 1 мл бактериальных клеток при наружном диаметре600 0,7. Используйте показания OD600 для аппроксимации КОЕ/мл в соответствии с калибровкой каждого отдельного спектрофотометра.
  3. Промойте каждый образец шигеллы 2 раза PBS.
    1. Грануляторы центрифугируют при 17 000 x g в течение 2 мин при комнатной температуре. Отсасывайте надосадочную жидкость, затем добавьте 1 мл теплого PBS и хорошо ресуспендируйте гранулы, осторожно пипетируя образец вверх и вниз до тех пор, пока смесь не станет полностью однородной (8-10x).
    2. Повторите шаг 4.3.1 1 дополнительное время.
    3. Гранулированные клетки центрифугируют при 17 000 x g в течение 2 мин при комнатной температуре, аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулы в 2 мл теплого DMEM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация ресуспендированных бактерий составляет 1 x 108 КОЕ/мл.
  4. Затем добавьте 1 мл (1 x 10,8 КОЕ) ресуспендированной шигеллы в каждую лунку подготовленных монослоев эпителия толстой кишки HT-29 в 6-луночных планшетах (начиная с шага 3.2.10.2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инфекции обычно проводятся при кратности инфекции (MOI; соотношение бактериальных и эпителиальных клеток) равной 100. Чтобы протестировать различные MOI, разбавьте ресуспендированную шигеллу в теплом DMEM до желаемой концентрации, затем добавьте 1 мл разбавленных бактерий к монослоям HT-29. Например, чтобы проверить MOI, равный 10, разбавьте бактерии в соотношении 1:10, добавив 150 мкл бактерий 1 x 108 КОЕ/мл к 1,35 мл теплого DMEM, затем нанесите 1 мл (1 x 107 КОЕ) на клетки HT-29.
  5. Инкубируйте 6-луночные планшеты при 37 °C с 5%CO2 в течение 3 ч.
  6. Во время инкубации определяют титр бактериальной инфекции.
    1. Приготовьте 10-кратные серийные разведения ресуспендированных клеток шигелл (из шага 4.3.3) в PBS.
    2. Распределите 100 мкл разведения 1 x 10-5 и 1 x 10-6 на красные планшеты TSB + Congo и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесение 100 мкл из разведений 1 x 10-5 и 1 x 10-6 соответствует конечному коэффициенту разбавления 1 x 10-6 и 1 x 10-7 соответственно.
  7. После инкубации промыть монослои 4-5 раз ПБС.
    1. Отсасывайте среду из каждой лунки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При аспирации среды из 6-луночных планшетов направляйте наконечник аспиратора вдоль нижней стороны лунок, стараясь избегать контакта с ячейками HT-29.
    2. Добавьте 1 мл теплого PBS в каждую лунку и аккуратно промойте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы аккуратно промыть 6-луночные монослои с помощью PBS, перемещайте пластину вверх-вниз и из стороны в сторону на столешнице. Мытье пластин круговыми движениями и/или снятие пластины с поверхности стола может привести к механическому удалению ячеек из пластика.
    3. Повторите шаги 4.7.1 и 4.7.2 еще 4 раза.
  8. Удалить PBS путем аспирации и лизировать клетки HT-29, добавив 1 мл PBS + 1% Triton X-100 в каждую лунку.
  9. Инкубируйте 6-луночные планшеты при температуре 37 °C в течение 5 минут.
  10. Используйте скребок для клеток или изогнутый наконечник пипетки, чтобы соскоблить лизированные клетки со дна лунки и переложить полный 1 мл в свежую пробирку микроцентрифуги объемом 1,7 мл.
  11. Определите количество клеточно-ассоциированных бактерий.
    1. Встряхивайте каждую пробирку (начиная с шага 4.10) в течение не менее 30 с, чтобы еще больше вытеснить шигеллы из лизированных эукариотических клеток.
    2. Готовят 10-кратные последовательные разведения лизатов в ПБС.
    3. Проложите 100 мкл разведения 1 x 10-2, 1 x 10-3 и 1 x 10-4 на красные планшеты TSB + Congo и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесение 100 мкл из разведения 1 x 10-2, 1 x 10-3 и 1 x 10-4 соответствует конечному коэффициенту разбавления 1 x 10-3, 1 x 10-4 и 1 x 10-5 соответственно.

5. Инвазионный анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Все объемы соответствуют анализу с использованием двух 6-луночных планшетов.

  1. Субкультурные культуры с однодневным разведением шигелл в соотношении 1:50 в свежих средах.
    1. Встряхните, затем добавьте 100 мкл каждой ночной культуры к 5 мл свежего БСЭ или БСЭ + БС в пробирку для культивирования подходящего размера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничьте объем культуры до <20% от объема колбы или пробирки для культуры, чтобы обеспечить надлежащую аэрацию.
    2. Инкубируют при 37 °C при встряхивании при 250 об/мин до тех пор, пока клетки не достигнут наружного диаметра600 0,7 (средняя логарифмическая фаза роста шигеллы ); около 2-2,5 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время субкультивирования прибавьте 50 мл DMEM + 50 мг/мл гентамицина и достаточный объем PBS для всех этапов промывки и поместите на водяную баню с температурой 37 °C. Перед использованием дайте среде нагреться до 37 °C.
  2. Переложите 2 x 108 КОЕ субкультивированных шигелл в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 2 x 108 КОЕ соответствует примерно 1 мл бактериальных клеток при наружном диаметре600 0,7. Используйте показания OD600 для аппроксимации КОЕ/мл в соответствии с калибровкой каждого отдельного спектрофотометра.
  3. Промыть образцы шигелл 1 раз с помощью PBS.
    1. Грануляторы центрифугируют при 17 000 x g в течение 2 мин при комнатной температуре. Отсасывайте надосадочную жидкость, затем добавьте 1 мл теплого PBS и хорошо ресуспендируйте гранулы, осторожно пипетируя образец вверх и вниз до тех пор, пока смесь не станет полностью однородной (8-10x).
    2. Повторите шаг 5.3.1. 1x дополнительное время.
    3. Гранулированные клетки центрифугируют при 17 000 x g в течение 2 мин при комнатной температуре, аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулы в 2 мл теплого DMEM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация ресуспендированных бактерий составляет 1 x 108 КОЕ/мл.
  4. Затем добавьте 1 мл (1 x 108 КОЕ) ресуспендированной шигеллы плюс 1 мл DMEM в каждую лунку подготовленных монослоев эпителия толстой кишки HT-29 в 6-луночных планшетах (начиная с шага 3.2.10.2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инфекции обычно проводятся при кратности инфекции (MOI; соотношение бактериальных и эпителиальных клеток) равной 100. Чтобы протестировать различные MOI, разбавьте ресуспендированную шигеллу в DMEM до желаемой концентрации, затем добавьте 1 мл разбавленных бактерий к монослоям HT-29. Например, чтобы проверить MOI 10, разбавьте бактерии в соотношении 1:10, добавив 150 мкл бактерий 1 x 108 КОЕ/мл к 1,35 мл DMEM, а затем добавьте 1 мл (1 x 107 КОЕ) к клеткам HT-29.
  5. Чтобы способствовать контакту бактерий с клетками HT-29, центрифугируйте 6-луночные планшеты при 2 000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре или 37 °C, если настройка температуры может быть отрегулирована.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование способствует контакту бактерий с клетками HT-29, что позволяет избежать необходимости в факторах адгезии и позволяет бактериям быстро проникать в клетки.
  6. Инкубируют 6-луночные планшеты при 37 °C с 5%CO2 в течение 45 мин.
  7. Во время инкубации определяют титр бактериальной инфекции.
    1. Приготовьте 10-кратные серийные разведения ресуспендированных клеток шигелл (из шага 5.3.3) в PBS.
    2. Распределите 100 мкл разведения 1 x 10-5 и 1 x 10-6 на красные планшеты TSB + Congo и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесение 100 мкл из разведений 1 x 10-5 и 1 x 10-6 соответствует конечному коэффициенту разбавления 1 x 10-6 и 1 x 10-7 соответственно.
  8. Тщательно промыть инфицированные клетки HT-29 3 раза 1 мл PBS.
    1. Отсасывайте среду из каждой лунки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При аспирации среды из 6-луночных планшетов направляйте наконечник аспиратора вдоль нижней стороны лунок, стараясь избегать контакта с ячейками HT-29.
    2. Добавьте 1 мл теплого PBS в каждую лунку и аккуратно промойте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы аккуратно промыть 6-луночные монослои с помощью PBS, перемещайте пластину вверх-вниз и из стороны в сторону на столешнице. Мытье пластин круговыми движениями и/или снятие пластины с поверхности стола может привести к механическому удалению ячеек из пластика.
    3. Повторите шаги 5.8.1 и 5.8.2 еще 2 раза.
  9. Удалите PBS путем аспирации, затем добавьте 2 мл теплого DMEM с добавлением 50 мкг/мл гентамицина в каждую лунку и инкубируйте в течение 30 мин при 37 °C с 5%CO2.
  10. Тщательно промыть инфицированные клетки HT-29 3 раза 1 мл PBS.
    1. Повторите шаг стирки 5.8.
  11. Удалить PBS путем аспирации, затем добавить 2 мл теплого DMEM с добавлением 50 мкг/мл гентамицина в каждую лунку и инкубировать в течение 60 мин при 37 °C с 5% CO2.
  12. Тщательно промыть инфицированные клетки HT-29 3 раза 1 мл PBS.
    1. Повторите шаг стирки 5.8.
  13. Удалить PBS путем аспирации и лизировать клетки HT-29, добавив 1 мл PBS + 1% Triton X-100 в каждую лунку.
  14. Инкубируйте 6-луночные планшеты при температуре 37 °C в течение 5 минут.
  15. Используйте скребок для клеток или изогнутый наконечник пипетки, чтобы соскоблить лизированные клетки со дна лунки и переложить полный 1 мл в свежую пробирку микроцентрифуги объемом 1,7 мл.
  16. Определяют количество внутриклеточных бактерий.
    1. Встряхивайте каждую пробирку (начиная с шага 5.15) в течение не менее 30 с для дальнейшего вытеснения шигелл из лизированных эукариотических клеток.
    2. Готовят 10-кратные последовательные разведения лизатов в ПБС.
    3. Проложите 100 мкл разведения 1 x 10-2 и 1 x 10-3 на красные планшеты TSB + Congo и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесение 100 мкл из разведений 1 x 10-2 и 1 x 10-3 соответствует конечному коэффициенту разбавления 1 x 10-3 и 1 x 10-4 соответственно.

6. Анализ внутриклеточной репликации

ПРИМЕЧАНИЕ: Все объемы соответствуют анализу с использованием двух 6-луночных планшетов.

  1. Субкультурные культуры с однодневным разведением шигелл в соотношении 1:50 в свежих средах.
    1. Встряхните, затем добавьте 100 мкл каждой ночной культуры к 5 мл свежего БСЭ или БСЭ + БС в пробирку для культивирования подходящего размера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничьте объем культуры до <20% от объема колбы или пробирки для культуры, чтобы обеспечить надлежащую аэрацию.
    2. Инкубируют при 37 °C при встряхивании при 250 об/мин до тех пор, пока клетки не достигнут наружного диаметра600 0,7 (средняя логарифмическая фаза роста шигеллы ); около 2-2,5 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время субкультивирования прибавьте 50 мл DMEM + 50 мг/мл гентамицина и достаточный объем PBS для всех этапов промывки и поместите на водяную баню с температурой 37 °C. Перед использованием дайте среде нагреться до 37 °C.
  2. Переложите 2 x 108 КОЕ субкультивированных шигелл в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 2 x 108 КОЕ соответствует примерно 1 мл бактериальных клеток при наружном диаметре600 0,7. Используйте показания OD600 для аппроксимации КОЕ/мл в соответствии с калибровкой каждого отдельного спектрофотометра.
  3. Промыть образцы шигелл 1 раз с помощью PBS.
    1. Грануляторы центрифугируют при 17 000 x g в течение 2 мин при комнатной температуре. Отсасывайте надосадочную жидкость, затем добавьте 1 мл теплого PBS и хорошо ресуспендируйте гранулы, осторожно пипетируя образец вверх и вниз до тех пор, пока смесь не станет полностью однородной (8-10x).
    2. Повторите шаг 6.3.1. 1x дополнительное время.
    3. Гранулированные клетки центрифугируют при 17 000 x g в течение 2 мин при комнатной температуре, аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулы в 2 мл теплого DMEM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация ресуспендированных бактерий составляет 1 x 108 КОЕ/мл.
  4. Затем добавьте 1 мл (1 x 10,8 КОЕ) ресуспендированной шигеллы плюс 1 мл DMEM в каждую лунку подготовленных монослоев эпителия толстой кишки HT-29 в 6-луночных планшетах (начиная с шага 3.2.10.2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инфекции обычно проводятся при кратности инфекции (MOI; соотношение бактериальных и эпителиальных клеток) равной 100. Чтобы протестировать различные MOI, разбавьте ресуспендированную шигеллу в DMEM до желаемой концентрации, затем добавьте 1 мл разбавленных бактерий к монослоям HT-29. Например, чтобы протестировать MOI 10, разбавьте бактерии в соотношении 1:10, добавив 150 мкл бактерий 1 x 108 КОЕ/мл к 1,35 мл DMEM, затем нанесите 1 мл (1 x 107 КОЕ) на клетки HT-29.
  5. Чтобы способствовать контакту бактерий с клетками HT-29, центрифугируйте 6-луночные планшеты при 2 000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре или 37 °C, если настройка температуры может быть отрегулирована.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование способствует контакту бактерий с клетками HT-29, что позволяет избежать необходимости в факторах адгезии и позволяет бактериям быстро проникать в клетки.
  6. Инкубируют 6-луночные планшеты при 37 °C с 5%CO2 в течение 45 мин.
  7. Во время инкубации определяют титр бактериальной инфекции.
    1. Приготовьте 10-кратные серийные разведения ресуспендированных клеток шигелл (из шага 6.3.3) в PBS.
    2. Распределите 100 мкл разведения 1 x 10-5 и 1 x 10-6 на красные планшеты TSB + Congo и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесение 100 мкл из разведений 1 x 10-5 и 1 x 10-6 соответствует конечному коэффициенту разбавления 1 x 10-6 и 1 x 10-7 соответственно.
  8. Тщательно промыть инфицированные клетки HT-29 3 раза 1 мл PBS.
    1. Отсасывайте среду из каждой лунки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При аспирации среды из 6-луночных планшетов направляйте наконечник аспиратора вдоль нижней стороны лунок, стараясь избегать контакта с ячейками HT-29.
    2. Добавьте 1 мл теплого PBS в каждую лунку и аккуратно промойте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы аккуратно промыть 6-луночные монослои с помощью PBS, перемещайте пластину вверх-вниз и из стороны в сторону на столешнице. Мытье пластин круговыми движениями и/или снятие пластины с поверхности стола может привести к механическому удалению ячеек из пластика.
    3. Повторите шаги 6.8.1 и 6.8.2 еще 2 раза.
  9. Удалите PBS путем аспирации, затем добавьте 2 мл теплого DMEM с добавлением 50 мкг/мл гентамицина в каждую лунку и инкубируйте в течение 30 мин при 37 °C с 5%CO2.
  10. Тщательно промыть инфицированные клетки HT-29 3 раза 1 мл PBS.
    1. Повторите шаг стирки 6.8.
  11. Удаляют PBS путем аспирации, затем добавляют 2 мл теплого ДМЭМ с 50 мкг/мл гентамицина в каждую лунку 6-луночных планшетов и инкубируют при 37 °C с 5%CO2 в течение желаемого периода времени, чтобы обеспечить внутриклеточную репликацию (до 24 ч).
  12. Тщательно промойте клетки 2 раза 1 мл PBS.
    1. Повторите шаг стирки 6.8.
  13. Удалить PBS путем аспирации и лизировать клетки HT-29, добавив 1 мл PBS + 1% Triton X-100 в каждую лунку.
  14. Инкубируйте 6-луночные планшеты при температуре 37 °C в течение 5 минут.
  15. Используйте скребок для клеток или изогнутый наконечник пипетки, чтобы соскоблить лизированные клетки со дна лунки и переложить полный 1 мл в свежую пробирку микроцентрифуги объемом 1,7 мл.
  16. Определяют количество внутриклеточных бактерий.
    1. Встряхивайте каждую пробирку (начиная с шага 6.15) в течение не менее 30 с для дальнейшего вытеснения шигелл из лизированных эукариотических клеток.
    2. Готовят 10-кратные последовательные разведения лизатов в ПБС.
    3. Протаплируйте 100 мкл разведений 1 x 10-2, 1 x 10-3 и 1 x 10-4 на тарелки TSB + Congo Red и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесение 100 мкл из разведения 1 x 10-2, 1 x 10-3 и 1 x 10-4 соответствует конечному коэффициенту разбавления 1 x 10-3, 1 x 10-4 и 1 x 10-5 соответственно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Анализы приверженности, инвазии и внутриклеточной репликации были проведены, сравнивая S. flexneri 2457T дикого типа (WT) с S. flexneri ΔVF (ΔVF), мутантом, который, как предполагается, отрицательно регулирует вирулентность шигелл. Поскольку шигеллы используют желчные соли в качестве сигнала для регуляции вирулентности 17,18,47, эксперименты проводили после бактериальной субкультуры в средах БСЭ, а также БСЭ с добавлением 0,4% (по массе) желчных солей18. Воздействие желчных солей на этапе субкультуры действует как предварительная обработка для воспроизведения транзита в тонком кишечнике до инфекции толстой кишки 17,18,47. На рисунке 1 проанализировано влияние мутации ΔVF на способность S. flexneri прикрепляться к эпителиальным клеткам толстой кишки HT-29. Процент адгезии отображается на оси Y и представляет собой отношение выздоровевших бактерий после стандартизированного лизиса HT-29 к количеству входных бактерий. Как и ожидалось, у штаммов S. flexneri WT и ΔVF наблюдалось значительное повышение приверженности при субкультивировании с добавкой желчных солей по сравнению с БСЭ без добавок желчных солей18. Тем не менее, не было выявлено различий в приверженности к клеткам HT-29 между мутантными штаммами WT и ΔVF в каждом субкультурном состоянии. Эти данные указывают на то, что мутация ΔVF не влияет на способность S. flexneri прикрепляться к эпителиальным клеткам HT-29 с предварительной обработкой желчными солями или без нее.

На рисунке 2 было проанализировано влияние мутации ΔVF на способность S. flexneri проникать (рис. 2A) и реплицироваться (рис. 2B) внутрь эпителиальных клеток толстой кишки HT-29 с предварительной обработкой желчными солями или без нее. Процент восстановления построен на оси Y и представляет собой отношение восстановленных бактериальных клеток после лизиса клеток HT-29, стандартизированное к количеству входных бактерий. На рисунке 2A было отмечено ожидаемое значительное увеличение способности WT S. flexneri 2457T проникать в клетки HT-29 после предварительного воздействия желчных солей48, в то время как мутант S. flexneri ΔVF продемонстрировал меньшее увеличение инвазии после предварительного воздействия желчных солей по сравнению со штаммом WT. Мутант ΔVF имел повышенную частоту инвазии клеток HT-29 по сравнению с WT, субкультивируемым в TSB, но имел такие же частоты инвазии, как и WT, при субкультивировании в TSB с добавлением желчных солей (рис. 2A). Эти результаты свидетельствуют о том, что мутация ΔVF усиливает способность S. flexneri проникать в клетки HT-29, что уменьшает эффект предварительного воздействия желчных солей, даже несмотря на то, что инвазионная способность мутанта ΔVF еще больше увеличилась после субкультуры желчных солей.

В целом, после ночной инкубации было обнаружено в 10 раз больше бактерий (рис. 2B) по сравнению с 90-минутной инкубацией (рис. 2A), что демонстрирует различия в мониторинге внутриклеточного роста и инвазии соответственно. Когда инфицированные клетки HT-29 инкубировали в течение 18 ч, чтобы обеспечить внутриклеточную репликацию бактерий (рис. 2B), влияние предварительной обработки желчными солями уменьшалось как для штаммов WT, так и для штаммов ΔVF . Однако снижение эффекта предварительной обработки желчными солями во время внутриклеточной репликации было более драматичным для мутанта ΔVF . Поскольку увеличение внутриклеточной репликации обоих штаммов при предварительном воздействии желчных солей было меньше, чем увеличение частоты инвазии в тех же условиях, мы предполагаем, что желчные соли оказывают большее влияние на ранние стадии патогенеза S. flexneri . Мутант ΔVF продемонстрировал увеличение процента восстановления после ночной репликации внутри клеток HT-29 по сравнению с WT (рис. 2B) после обоих условий субкультуры. Тем не менее, процент выздоровления мутанта ΔVF был одинаковым независимо от предварительного воздействия желчных солей. Эти тенденции данных свидетельствуют о том, что мутант ΔVF более эффективно реплицируется внутри клеток HT-29 по сравнению с WT, и что предварительное воздействие желчных солей не влияет на способность мутанта ΔVF реплицироваться внутриклеточно, как это наблюдается для WT (рис. 2B). Поскольку при 90-минутном анализе инвазии не наблюдалось различий между мутантными и WT-штаммами в условиях доэкспозиционной инвазии желчных солей, мы предполагаем, что продукт, кодируемый удаленным геном VF , может также регулировать репликацию S. flexneri внутри клеток HT-29. В совокупности оба анализа показывают, что мутант ΔVF более вирулентен по отношению к WT, что позволяет предположить, что продукт гена VF является отрицательным регулятором вирулентности S. flexneri .

Figure 1
Рисунок 1: Доэкспозиционная адгезия S. flexneri к клеткам HT-29 индуцирована желчными солями. Мутантные клетки S. flexneri 2457T WT и ΔVF субкультивировали либо в БСЭ, либо в БСЭ с добавлением 0,4% (по массе) желчных солей (TSB+BS). Затем бактерии наносили на клетки HT-29 при кратности инфекции (MOI) 100 и инкубировали в течение 3 ч для изучения адгезии. После инкубации инфицированные клетки HT-29 промывали и лизировали, а серийные разведения выздоровевших бактерий покрывали для подсчета колониеобразующих единиц на мл (КОЕ/мл). Количество адгезивных бактерий строится относительно титров входных бактерий для установления процента адгезии. Данные репрезентативны для одного биологического репликанта с тремя техническими репликатами (отдельными точками). Столбцы погрешности показывают стандартную ошибку среднего значения (SEM). Статистическую значимость определяли по t-критерию Стьюдента (*p < 0,05; ***p < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Предварительное воздействие желчных солей увеличивало инвазию WT S. flexneri и внутриклеточную репликацию. Мутантные клетки S. flexneri 2457T WT и ΔVF субкультивировали в БСЭ или БСЭ с добавлением сред желчных солей (TSB+BS). Затем бактерии наносили на клетки HT-29 при MOI 100, центрифугировали на клетках и инкубировали при 37 °C с 5%CO2 в течение 45 мин. Клетки промывали PBS, а внеклеточные бактерии лизировали путем добавления гентамицина в DMEM для исключительного восстановления внутриклеточных бактерий. После 90-минутной (А, бактериальная инвазия) или 18-часовой (В, внутриклеточная репликация) инкубации инфицированные клетки HT-29 промывали и лизировали, а также проводили последовательные разведения восстановленных бактерий для подсчета колониеобразующих единиц на мл (КОЕ/мл). Количество внутриклеточных бактерий строится относительно входных титров бактерий для установления процента восстановления. Данные репрезентативны для одного биологического репликата, каждый из которых имеет три технических репликата (отдельные точки). Полосы погрешности указывают на SEM. Статистическая значимость определялась с помощью t-критерия Стьюдента (*p < 0,05). Обратите внимание на различия в масштабах оси Y между панелями (A) и (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описывает набор из трех стандартизированных анализов для изучения адгезии шигелл, инвазии и внутриклеточной репликации эпителиальных клеток кишечника. Несмотря на то, что эти методы являются всего лишь модифицированными версиями классических гентамициновых анализов, используемых для изучения инвазии и внутриклеточной репликации различных бактериальных патогенов в клетках хозяина 49,50,51, при изучении шигелл необходимо учитывать особые соображения.

Шигеллы являются факультативными анаэробами, которые оптимально растут при 37 °C в богатой среде с аэрацией43. При проведении этих тестов для изучения влияния различных сигналов окружающей среды или метаболитов на инфекции шигелл, рекомендуется выращивать шигеллы в богатых средах в течение ночи, а затем субкультивировать в определенные или дополненные среды до середины логарифмической фазы до инфекции. Максимальная экспрессия гена вирулентности происходит во время логарифмической фазы роста 52,53. Таким образом, субкультивирование ночных культур шигелл и доведение бактериального роста до экспоненциальной фазы (OD600 ~ 0,7) являются необходимыми шагами для правильной оценки вирулентности шигелл. Кроме того, экспрессия гена вирулентности зависит от температуры. Для обеспечения специфичности экспрессии только во время инфекции хозяина гены вирулентности индуцируются при физиологических температурах хозяина (37 °C) и строго подавляются при более низких температурах (например, 30 °C)54. Чтобы обеспечить экспрессию генов вирулентности, бактериальное субкультивирование и инфекции должны проводиться при 37 °C, с надлежащей осторожностью, чтобы температура не опускалась ниже 37 °C. Крупная вирулентная плазмида с 220 килооснованиями, которая кодирует молекулярный механизм, необходимый для инвазии и инфекции эпителиальных клеток, является важным детерминантом вирулентности для всех Shigella spp 5. Повторное пассажирование и длительный рост при 37 °C способствуют нестабильности плазмиды вирулентности, что приводит к потере плазмиды и превращению клеток шигелл в авирулентный55. Чтобы обеспечить поддержание вирулентности плазмиды и экспрессию важнейших генов вирулентности, рекомендуется каждые две недели выводить бактерии непосредственно из морозильных камер на свежие красные индикаторные пластины TSB + Congo. Конголезский красный агар может быть использован для дифференциации вирулентных колоний дикого типа (красный, CR+) и авирулентных (белый, CR-) колоний, утративших плазмиду вирулентности45. Если нестабильность вирулентной плазмиды наблюдается неоднократно, ночные культуры шигелл можно инкубировать при 30 °C для предотвращения потери вирулентной плазмиды с последующим субкультивированием при 37 °C для стимулирования экспрессии гена вирулентности43. Наконец, если проводятся анализы с мутантами и/или комплементарными штаммами, в которых маркеры антибиотиков присутствуют в этих бактериальных штаммах, рекомендуется использовать соответствующий выбор антибиотиков на этапах бактериальной ночи и субкультивирования.

Использование эпителиальных монослоев HT-29 имеет много преимуществ для изучения молекулярных механизмов патогенеза шигелл in vitro. Поскольку шигеллы являются патогеном, адаптированным к человеку, модели мелких животных не совсем точно отражают характерный патогенез шигеллеза, наблюдаемый у человека36. Таким образом, использование стандартизированных протоколов инфицирования клеточных линий человеческого происхождения позволяет количественно исследовать отдельные этапы бактериального патогенеза для характеристики молекулярного взаимодействия между этим патогеном и его нативным хозяином. Исторически сложилось так, что клетки HeLa преимущественно использовались для изучения взаимодействий хозяина и патогена in vitro 25,56,57. Тем не менее, клетки HeLa представляют собой иммортализированную клеточную линию рака шейки матки, которая является ненативными клетками-хозяевами для патогенов кишечных бактерий. Таким образом, исследования in vitro кишечного патогенеза сместились в сторону использования клеточных линий аденокарциномы толстой кишки (например, HT-29, Caco-2 и T84), которые более точно повторяют морфологию кишечного эпителия и могут быть выращены на трансвеллах в виде эпителиальных монослоев с дифференцированными апикальными и базолатеральными поверхностями 58,59,60 . Несмотря на то, что каждая клеточная линия имеет свои сильные и слабые стороны, клетки HT-29 используются в описанных здесь анализах из-за фенотипического сходства с кишечными энтероцитами и сильной экспрессии рецепторов клеточной поверхности и провоспалительных цитокинов 58,59,61. Тем не менее, каждая из этих обсуждаемых моделей представляет собой клеточные линии ракового происхождения с аберрантными метаболическими и ростовыми фенотипами, которые неточно отражают естественное физиологическое состояние эпителия толстой кишки in vivo58. Недавние достижения в области методов культивирования тканей человека позволили культивировать стволовые клетки кишечника человека, полученные в результате биопсии тканей, в органоиды или отдельные двумерные клеточные монослои, которые повторяют различные типы клеток, присутствующих в желудочно-кишечном тракте человека 62,63,64. Кишечные органоиды могут быть дифференцированы, включая энтероциты, бокаловидные клетки, продуцирующие слизь, М-клетки и другие тканеспецифичные типы клеток. Недавние исследования подтвердили использование этих органоидных моделей для изучения кишечных патогенов, включая различные Shigella spp., Salmonella enterica и Escherichia coli pathovars 62,63,64. Несмотря на то, что органоиды являются более точными моделями эпителия желудочно-кишечного тракта человека и могут даже культивироваться в различных питательных условиях, чтобы представлять глобальную популяцию65, их относительная сложность требует значительной подготовки и технических знаний, что приводит к более высоким затратам и более длительному времени культивирования по сравнению с традиционными линиями раковых клеток58.

Этот протокол описывает методы средней пропускной способности, при которых используются две 6-луночные планшеты для получения в общей сложности 12 монослоев, доступных для тестирования. Тем не менее, эксперименты могут быть легко масштабированы, чтобы увеличить количество монослоев, засеянных для размещения дополнительных технических репликаций или тестирования дополнительных мутантов шигелл и сигналов окружающей среды. Планшеты для культивирования тканей с большим количеством лунок (например, 12-луночные или 24-луночные планшеты) также могут использоваться с соответствующей регулировкой для учета лунок с меньшим диаметром. В условиях выращивания HT-29, описанных в шаге 3.2, титров HT-29 достаточно для посева около шести 6-луночных планшетов после культивирования из одной колбы T75 с достаточным количеством оставшихся клеток для поддержания культуры клеток HT-29. Кроме того, посев монослоев HT-29 и подготовка инокуляционных бактерий идентичны для анализов на адгезию, инвазию и внутриклеточную репликацию. Таким образом, анализы, тестирующие одни и те же штаммы шигелл или условия субкультивирования, могут быть легко выполнены параллельно, чтобы одновременно изучить роль каждого экспериментального состояния в различных стадиях инфекции шигелл .

Титры восстановления адгезивных (шаг 4), инвазированных (шаг 5) и внутриклеточных бактерий (шаг 6) определяют путем нанесения покрытий на последовательные разведения инфицированных клеток HT-29 после лизиса, что позволяет количественно оценить эффективность каждой стадии заражения шигеллами. Этапы центрифугирования в анализах инвазии и внутриклеточной репликации, основанные на классических анализах 49,50,51, способствуют бактериальному контакту с клетками-хозяевами для немедленной инвазии и повышения скорости инвазии. Таким образом, центрифугирование «пропускает» стадию адгезии, которая, как выяснилось позже, является важным аспектом инфекции шигелл 17,18,19,66. Важно отметить, что стадия центрифуги не может быть выполнена с поляризованными эпителиальными клетками, засеянными в трансвеллы. Однако при анализе на адгезию прилипание не принудительно центрифугируется, и гентамицин не добавляется к инфицированным клеткам HT-29 перед лизисом, что позволяет перечислить адгезивные бактериальные клетки. Объем питательной среды для тканевых культур уменьшается до 1 мл (в отличие от 2 мл для инвазий и внутриклеточной репликации), чтобы обеспечить более эффективный контакт бактерий с клетками HT-29. Кроме того, в зависимости от скорости адгезии, в течение 3 ч инкубации может произойти некоторая инвазия и внутриклеточная репликация, но их количество, как правило, незначительно (например, только 0,05% выздоровевшей бактериальной популяции после лизиса клеток хозяина). Тем не менее, для правильного учета адгезивных и внутриклеточных бактерий во время 3-часовой инкубации рекомендуется проводить параллельные анализы, где, в дополнение к указанному протоколу, вторую планшет инкубируют с 50 мкг/мл гентамицина в 2 мл ДМЭМ на лунку в общей сложности в течение 45 мин (15 мин инкубация, промывка, свежий ДМЭМ + гентамицин в течение 30 мин) для тщательного лизиса внеклеточных бактерий. После лизиса клеток HT-29, как указано в протоколе, внутриклеточные бактерии могут быть перечислены, как указано выше, и будут представлять собой количество бактерий, которые вторглись. Затем это значение может быть вычтено из бактерий, перечисленных на планшете, без обработки гентамицином, чтобы правильно определить адгезивные и инвазивные бактерии. Параллельный анализ также может быть выполнен для получения более полного представления о внутриклеточной репликации шигелл внутри клеток HT-29 после инвазии, например, используя несколько временных точек для выполнения кривых внутриклеточного роста. Наконец, наряду с подсчетом внутриклеточных бактерий после 18-часовой инкубации гентамицина, надосадочные жидкости культуры могут быть собраны и проанализированы на секрецию цитокинов инфицированных клеток HT-29. Например, IL-8 представляет собой хемокин, секретируемый эпителиальными клетками, который в значительной степени функционирует для рекрутирования PMN к месту инфекции. Количество IL-8, секретируемого в питательной среде инфицированных клеток HT-29, может быть проанализировано с помощью IL-8 ELISAанализа 67.

Желчные соли оказались важным сигналом вирулентности для шигелл во время транзита через желудочно-кишечный тракт человека и могут быть использованы в качестве дополнения питательных сред бактерий в этих протоколах для воспроизведения типичных состояний желудочно-кишечного тракта. Естественно, желчные соли вводятся в двенадцатиперстную кишку или верхнюю часть тонкой кишки, чтобы помочь пищеварению; А в терминальном отделе подвздошной кишки или конце тонкой кишки 95% желчных солей удаляются и возвращаются в кровоток для окончательного отложения в желчном пузыре68. Желчные соли обычно имеют концентрацию в тонком кишечнике от 0,2% до 2,0% и обладают естественным бактерицидным действием. Тем не менее, шигеллы, наряду с большинством кишечных бактерий, устойчивы к желчным солям и используют сигналы дляусиления инфекции. Несколько исследований документально подтвердили, что воздействие желчных солей, иногда в сочетании с другими сигналами тонкого кишечника, такими как глюкоза, влияет на выживаемость шигелл и регуляцию вирулентности до заражения. Было показано, что шигеллы устойчивы к желчным солям, изменяют экспрессию генов, а также образуют и рассеивают биопленку в условиях, которые воспроизводят транзит в тонком кишечнике17,69. Исследования показали, что эти изменения приводят к гипервирулентному фенотипу, при котором адгезия и инвазия индуцируются при последующей инфекции толстой кишки шигеллами 17,18,19,48,66. Таким образом, условия, описанные выше, документируют, как субкультивировать шигеллы в желчных солях для имитации транзита в тонком кишечнике перед выполнением анализов на адгезию, инвазию или внутриклеточную репликацию. Указанная форма БСЭ содержит добавленную глюкозу по сравнению с типичным бульоном Лурия (LB)17. Таким образом, если используется ЛБ, важно также дополнить среду глюкозой (0,5%-2,0% [по массе]), чтобы надлежащим образом учитывать сигналы глюкозы в тонкой кишке17. Кроме того, как упоминалось выше, все субкультуры шигелл промывают для удаления желчных солей и имитации перехода в толстую кишку для анализа инфекции.

Традиционно, как показано в приведенных выше результатах (Рисунок 1 и Рисунок 2), анализы на инфекции полезны для определения роли конкретного гена в инфекции шигелл . Фенотип различных мутантов, однако, не может быть по-настоящему оценен без надлежащего добавления бактериальных питательных сред. Как показали предыдущие исследования, желчные соли значительно изменяют экспрессию генов S. flexneri , включая гены центрального метаболизма, транскрипционных факторов, транспортеров сахара, лекарственной устойчивости и генов вирулентности, кодируемых либо в хромосоме, либо в вирулентной плазмиде17. Эти гены дают представление о том, как шигеллы используют желчные соли в качестве сигнала для изменения экспрессии генов и подготовки к возможной инфекции толстой кишки, и, таким образом, последующие мутационные анализы должны быть выполнены в соответствующей дополненной питательной среде для бактериального роста, прежде чем изучать влияние на вирулентность в анализах адгезии, инвазии и внутриклеточной репликации. Как видно выше на рисунке 1 и рисунке 2, мутация ΔVF не влияла на адгезию, но влияла на инвазию и внутриклеточную репликацию. Поскольку мутация усилила инвазию и внутриклеточную репликацию, в настоящее время проводятся эксперименты, чтобы определить, как генный продукт регулирует инфекцию. Мутантные анализы служат примером того, как можно изучать новые представления о патогенезе шигелл , особенно в условиях, которые лучше воспроизводят желудочно-кишечный тракт человека. Для валидации фенотипов различных мутантов рекомендуется проводить надлежащие анализы комплементации.

В сочетании эти процедуры описывают количественные эксперименты, которые позволят получить важное представление о молекулярных механизмах прилипания, инвазии и репликации шигелл внутри эпителиальных клеток толстой кишки путем наилучшей имитации естественной среды желудочно-кишечного тракта человека во время инфекции. Будущие исследования могут расширить изучение мутантов и экспериментальных условий, чтобы лучше понять, как шигеллы подготавливают и эффективно заражают людей-хозяев. Несмотря на десятилетия исследований, еще многое предстоит узнать об инфекции шигелл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Поддержку авторам оказывают Отделение педиатрии Массачусетской больницы общего профиля, грант Исполнительного комитета по временному финансированию исследований (ISF) 2022A009041, грант Национального института аллергии и инфекционных заболеваний R21AI146405 и грант Национального института диабета и заболеваний пищеварительной системы и почек Исследовательский центр питания и ожирения в Гарварде (NORCH) 2P30DK040561-26. Спонсоры не играли никакой роли в планировании исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm PES filter Millipore-Sigma SCGP00525 Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media
14 mL culture tubes Corning 352059 17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap
50 mL conical tubes Corning 430829 50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap
6-well tissue culture plates Corning 3516 Plates are treated for optimal cell attachment
Bile salts Sigma-Aldrich B8756 1:1 ratio of cholate to deoxycholate
Congo red dye Sigma-Aldrich C6277 A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity
Countess cell counting chamber slide Invitrogen C10283 To be used with the Countess Automated Cell Counter
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 A a highly polar organic reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 10569-010 DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F4135 Heat-inactivated, sterile
Gentamicin Sigma-Aldrich G3632 Stock concentration is 50 mg/mL
HT-29 cell line ATCC HTB-38 Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin
Paraffin film Bemis PM999 Laboratory sealing film
Petri dishes Thermo Fisher Scientific FB0875713 100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049 1x concentration; pH 7.4
Select agar Invitrogen 30391023 A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media
T75 flasks Corning 430641U Tissue culture flasks
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 A common non-ionic surfactant and emulsifier 
Trypan blue stain Invitrogen T10282 A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye
Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging
Tryptic Soy Broth (TSB) Sigma-Aldrich T8907 Bacterial growth media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karambizi, N. U., McMahan, C. S., Blue, C. N., Temesvari, L. A. Global estimated Disability-Adjusted Life-Years (DALYs) of diarrheal diseases: A systematic analysis of data from 28 years of the global burden of disease study. PloS one. 16 (10), e0259077 (2021).
  2. WHO. WHO methods and data sources for country-level causes of death 2000-2016. World Health Organization. , Geneva. (2018).
  3. Kotloff, K. L. Shigella infection in children and adults: a formidable foe. Lancet Glob Health. 5 (12), e1166-e1167 (2017).
  4. Kotloff, K. L., et al. Burden and aetiology of diarrhoeal disease in infants and young children in developing countries (the Global Enteric Multicenter Study, GEMS): A prospective, case-control study. Lancet. 382 (9888), 209-222 (2013).
  5. Schroeder, G. N., Hilbi, H. Molecular pathogenesis of Shigella spp.: Controlling host cell signaling, invasion, and death by type III secretion. Clin Microbiol Rev. 21 (1), 134-156 (2008).
  6. Arvelo, W., et al. Transmission risk factors and treatment of pediatric shigellosis during a large daycare center-associated outbreak of multidrug resistant shigella sonnei: Implications for the management of shigellosis outbreaks among children. Pediatr Infect Dis J. 28 (11), 976-980 (2009).
  7. Kozyreva, V. K., et al. Recent outbreaks of Shigellosis in California caused by two distinct populations of Shigella sonnei with either increased virulence or fluoroquinolone resistance. mSphere. 1 (6), 1-18 (2016).
  8. Bowen, A., et al. Importation and domestic transmission of Shigella sonnei resistant to ciprofloxacin - United States, May 2014-February 2015. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 64 (12), 318-320 (2015).
  9. Tansarli, G. S., et al. Genomic reconstruction and directed interventions in a multidrug-resistant Shigellosis outbreak in Seattle, WA, USA: a genomic surveillance study. Lancet. 3099 (22), 1-11 (2023).
  10. Barry, E. M., et al. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
  11. Increase in Extensively Drug-Resistant Shigellosis in the United States. CDC Health Alert Network. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://emergency.cdc.gov/han/2023/han00486.asp?ACSTrackingID=USCDC_511-DM100260&ACSTrackingLabel=HAN%20486%20-%20General%20Public&deliveryName=USCDC_511-DM100260 (2023).
  12. Shiferaw, B., et al. Antimicrobial susceptibility patterns of Shigella isolates in Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet) sites, 2000-2010. Clin Infect Dis. 54, S458-S463 (2012).
  13. Centers for Disease Control and Prevention. COVID-19: U.S. Impact on Antimicrobial Resistance, Special Report 2022. Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services. CDC. , (2022).
  14. Centers for Disease Control and Prevention. Antibiotic resistance threats in the United States, 2019. CDC. 10 (1), Atlanta, Georgia. (2019).
  15. WHO. Prioritization of pathogens to guide discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. WHO. , Geneva. (2017).
  16. DuPont, H. L., Levine, M. M., Hornick, R. B., Formal, S. B. Inoculum size in shigellosis and implications for expected mode of transmission. J Infect Dis. 159 (6), 1126-1128 (1989).
  17. Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), 1-18 (2017).
  18. Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
  19. Chanin, R. B., et al. Shigella flexneri adherence factor expression in in vivo-like conditions. mSphere. 4 (6), e00751 (2019).
  20. Baranov, V., Hammarström, S. Carcinoembryonic antigen (CEA) and CEA-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1), apically expressed on human colonic M cells, are potential receptors for microbial adhesion. Histochem Cell Biol. 121 (2), 83-89 (2004).
  21. Wassef, J. S., Keren, D. F., Mailloux, J. L. Role of M cells in initial antigen uptake and in ulcer formation in the rabbit intestinal loop model of shigellosis. Infect Immun. 57 (3), 858-863 (1989).
  22. Sansonetti, P. J., Arondel, J., Cantey, J. R., Prévost, M. C., Huerre, M. Infection of rabbit Peyer's patches by Shigella flexneri: Effect of adhesive or invasive bacterial phenotypes on follicle-associated epithelium. Infect Immun. 64 (7), 2752-2764 (1996).
  23. Sansonetti, P. J., et al. Caspase-1 activation of IL-1beta and IL-18 are essential for Shigella flexneri-induced inflammation. Immunity. 12 (5), 581-590 (2000).
  24. Zychlinsky, A., Fitting, C., Cavaillon, J. M., Sansonetti, P. J. Interleukin 1 is released by murine macrophages during apoptosis induced by Shigella flexneri. J Clin Invest. 94 (3), 1328-1332 (1994).
  25. Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. T., Mounier, J. Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis. Infect Immun. 51 (2), 461-469 (1986).
  26. Maldonado-Contreras, A., et al. Shigella depends on SepA to destabilize the intestinal epithelial integrity via cofilin activation. Gut Microbes. 8 (6), 544-560 (2017).
  27. Collard, J. -M., et al. High prevalence of small intestine bacteria overgrowth and asymptomatic carriage of enteric pathogens in stunted children in Antananarivo, Madagascar. PLoS Negl Trop Dis. 16 (5), e0009849 (2022).
  28. Mattock, E., Blocker, A. J. How do the virulence factors of shigella work together to cause disease. Front Cell Infect Microbiol. 7, 1-24 (2017).
  29. Mostowy, S., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS Pathog. 9 (9), e1003588 (2013).
  30. Martinez-Becerra, F. J., et al. Parenteral immunization with IpaB/IpaD protects mice against lethal pulmonary infection by Shigella. Vaccine. 31 (24), 2667-2672 (2013).
  31. Shim, D. -H., et al. New animal model of shigellosis in the Guinea pig: its usefulness for protective efficacy studies. J Immunol. 178 (4), Baltimore, Md. 2476-2482 (2007).
  32. Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465 (7296), 355-358 (2010).
  33. West, N. P., et al. Optimization of virulence functions through glucosylation of Shigella LPS. Science. 307 (5713), 1313-1317 (2005).
  34. Maurelli, A. T., et al. Shigella infection as observed in the experimentally inoculated domestic pig, Sus scrofa domestica. Microbial Pathog. 25 (4), 189-196 (1998).
  35. Jeong, K. -I., Zhang, Q., Nunnari, J., Tzipori, S. A piglet model of acute gastroenteritis induced by Shigella dysenteriae Type 1. J Infect Dis. 201 (6), 903-911 (2010).
  36. Kim, Y. -J., Yeo, S. -G., Park, J. -H., Ko, H. -J. Shigella vaccine development: prospective animal models and current status. Curr Pharm Biotechnol. 14 (10), 903-912 (2013).
  37. Kent, T. H., Formal, S. B., LaBrec, E. H., Sprinz, H., Maenza, R. M. Gastric shigellosis in rhesus monkeys. Am J Pathol. 51 (2), 259-267 (1967).
  38. Shipley, S. T., et al. A challenge model for Shigella dysenteriae 1 in cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis). Comp Med. 60 (1), 54-61 (2010).
  39. Higgins, R., Sauvageau, R., Bonin, P. Shigella flexneri Type 2 Infection in captive nonhuman primates. Can Vet J. 26 (12), 402-403 (1985).
  40. Oaks, E. V., Hale, T. L., Formal, S. B. Serum immune response to Shigella protein antigens in rhesus monkeys and humans infected with Shigella spp. Infect Immun. 53 (1), 57-63 (1986).
  41. Formal, S. B., et al. Protection of monkeys against experimental shigellosis with a living attenuated oral polyvalent dysentery vaccine. J Bacteriol. 92 (1), 17-22 (1966).
  42. Levine, M. M., Kotloff, K. L., Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road. Nat Rev Microbiol. 5 (7), 540-553 (2007).
  43. Payne, S. M. Laboratory cultivation and storage of Shigella. Curr Protoc Microbiol. 55 (1), 93 (2019).
  44. NIH Guidelines. NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. NIH Guidelines. 2, 142 (2019).
  45. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
  46. HT-29 cell line product sheet. ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/products/htb-38 1-6 (2023).
  47. Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), 819-836 (2016).
  48. Stensrud, K. F., et al. Deoxycholate interacts with IpaD of Shigella flexneri in inducing the recruitment of IpaB to the type III secretion apparatus needle tip. J Biol Chem. 283 (27), 18646-18654 (2008).
  49. Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J Clin Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
  50. Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymo. 236 (1979), 405-420 (1994).
  51. Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62 (8), 3463-3471 (1994).
  52. Dorman, C. J., McKenna, S., Beloin, C. Regulation of virulence gene expression in Shigella flexneri, a facultative intracellular pathogen. Int J Med Microbiol. 291 (2), 89-96 (2001).
  53. Porter, M. E., Dorman, C. J. Positive regulation of Shigella flexneri virulence genes by integration host factor. J Bacteriol. 179 (21), 6537-6550 (1997).
  54. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Temperature-dependent expression of virulence genes in Shigella species. Infect Immun. 43 (1), 195-201 (1984).
  55. Schuch, R., Maurelli, A. T. Virulence plasmid instability in Shigella flexneri 2a is induced by virulence gene expression. Infect Immun. 65 (9), 3686-3692 (1997).
  56. Formal, S. B., Hale, T. L., Sansonetti, P. J. Invasive enteric pathogens. Rev Infect Dis. 5, S702-S707 (1983).
  57. Pál, T., Hale, T. L. Plasmid-associated adherence of Shigella flexneri in a HeLa cell model. Infect Immun. 57 (8), 2580-2582 (1989).
  58. Noben, M., et al. Human intestinal epithelium in a dish: Current models for research into gastrointestinal pathophysiology. United European Gastroenterol J. 5 (8), 1073-1081 (2017).
  59. Liévin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiol Mol Biol Rev R. 77 (3), 380-439 (2013).
  60. Mitchell, D. M., Ball, J. M. Characterization of a spontaneously polarizing HT-29 cell line, HT-29/cl.f8. In Vitro Cell Dev Biol - Anim. 40 (10), 297-302 (2004).
  61. Gagnon, M., Zihler Berner, A., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. J Microbiol Methods. 94 (3), 274-279 (2013).
  62. Koestler, B. J., et al. Human intestinal enteroids as a model system of Shigella pathogenesis. Infect Immun. 87 (4), 00733 (2019).
  63. Ranganathan, S., et al. Evaluating Shigella flexneri pathogenesis in the human enteroid model. Infect Immun. 87 (4), (2019).
  64. Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiol Spectr. 9 (1), 1-17 (2021).
  65. Perlman, M., Senger, S., Verma, S., Carey, J., Faherty, C. S. A foundational approach to culture and analyze malnourished organoids. Gut Microbes. 15 (2), 2248713 (2023).
  66. Pope, L. M., Reed, K. E., Payne, S. M. Increased protein secretion and adherence to HeLa cells by Shigella spp. following growth in the presence of bile salts. Infect Immun. 63 (9), 3642-3648 (1995).
  67. Faherty, C. S., et al. The synthesis of OspD3 (ShET2) in Shigella flexneri is independent of OspC1. Gut Microbes. 7 (6), 486-502 (2016).
  68. Ridlon, J. M., Kang, D. -J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
  69. Köseoğlu, V. K., Hall, C. P., Rodríguez-López, E. M., Agaisse, H. The Autotransporter IcsA promotes Shigella flexneri biofilm formation in the presence of bile salts. Infect Immun. 87 (7), 1-14 (2019).

Tags

Иммунология и инфекция выпуск 204 шигеллы адгезия инвазия внутриклеточная репликация патогенез факторы вирулентности эпителиальные клетки желчные соли
Анализ инфекции эпителиальных клеток с <em>помощью шигелл</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poore, K., Lenneman, B. R., Faherty, … More

Poore, K., Lenneman, B. R., Faherty, C. S. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (204), e66426, doi:10.3791/66426 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter