Summary
Este vídeo mostra o processo de whole-cell recording voltagem clamp na fatia da retina do tigre aquáticos salamandra. Nós demonstramos a preparação da fatia, bem como a forma de realizar gravações patch clamp durante a estimulação visual da retina.
Abstract
Usamos a técnica de célula inteira patch clamp para estudar os circuitos sinápticos que está por trás de processamento de informações visuais na retina. Neste vídeo, que irá guiá-lo através do processo de realização de célula inteira gravações de luz correntes evocados de células individuais na preparação fatia da retina. Usamos o tigre aquáticos salamandra como modelo animal. Começamos por descrever a dissecação do olho e mostrar como as fatias são montados para as gravações eletrofisiológicas. Uma vez que a fatia é colocada na câmara de gravação, que demonstram como executar de célula inteira gravações braçadeira de tensão. Em seguida, projeto de estímulos visuais sobre os fotorreceptores na fatia de obter luz evocou respostas atual. Durante a gravação que perfundir a fatia com agentes farmacológicos, no qual um sistema de perfusão de 8 canais nos permite alternar rapidamente entre diferentes agentes. A preparação fatia da retina é amplamente usado para gravações de patch clamp na retina, em particular para estudar ou células amácrinas bipolar, que não são acessíveis em uma preparação de todo o monte.
Protocol
Soluções
- Solução intracelular de células ganglionares (em mM): 100 K gluconato, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mM Sulforhodamine B (para coloração), ajustada para pH = 7,4 com KOH
- Solução intracelular de células bipolares (em mM): 90 K gluconato, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mM Sulforhodamine B (para coloração), ajustada para pH = 7,4 com KOH
- Solução de Ringer extracelular (em mM): 112 NaCl, Glicose 5, 5 HEPES, 2 KCl, CaCl 2 2, 1 MgCl 2, ajustada para pH = 7,75 com NaOH. Oxigenação da solução, não é necessário.
Prepare câmaras de gravação
Nossa câmara de gravação consiste de uma lâmina de microscópio com um adesivo bem em que blocos de silicone pequena cortada de um outro adesivo bem são colocados para dar estabilidade para as fatias de tecido.
Preparação de fatias da retina
Para evitar o branqueamento dos fotorreceptores, a dissecção é realizada à luz luz IR ou dim vermelho. Se alguém estiver interessado em gravar respostas da via vara, apenas a luz IR deve ser usada (IR microscópio de dissecação e nenhuma luz do quarto. Óculos de proteção adicional IR deve ser usada para procedimentos não realizados sob o microscópio). Se alguém está interessado principalmente na gravação de respostas cone de luz, a luz da sala escura vermelho ou um flash de luz vermelha podem ser usados. O microscópio, no entanto, ainda deve ter oculares IR.
Se a entrada de fotorreceptores é irrelevante para o experimento, os procedimentos podem ser realizados em ambiente normal de luz usando um microscópio regular.
- Preparar duas lâminas de microscópio com um adesivo de silicone bem: criar duas faixas paralelas de graxa de silicone (cerca de 0,5 centímetros de distância) em cada slide e coloque um pedaço retangular de papel de filtro de um lado do slide, cruzando as duas bandas de graxa (push o filtro papel com parte de uma lâmina de barbear para que ele seja bem ligado ao slide)
- Sacrifício uma salamandra de acordo com protocolos estabelecidos: o animal é colocado em um banho de gelo por 30 minutos, em seguida, decapitado e dê um duplo pithed.
- Remover olhos da cabeça salamandra e colocá-la sob o microscópio de dissecação em um pedaço de lenço de papel umedecido com solução gelada de Ringer
- Remover o tecido conjuntivo do olho
- Use lâmina de barbear para fazer um pequeno corte na córnea
- Segure corte da córnea com uma pinça, removendo-a com uma tesoura ao longo de sua ligação com o olho
- Remova a lente com uma pinça
- Segure a íris com uma pinça e corte ao longo da ora serrata para remover a íris
- Cortar a ocular em dois pedaços retangulares
- Pegue um dos pedaços e colocá-lo lado esclera em cima do papel de filtro (certifique-se de achatar a peça ao abaixá-la com muito cuidado)
- Levante cuidadosamente a esclera fora da retina, que agora deve ser anexado ao papel filer
- Adicionar rapidamente solução gelada de Ringer para o bem
- Repita o mesmo para a segunda parte
- Use uma lâmina de barbear colocado em um slicer feitos para cortar 200-300μm fatias de largura.
- Use uma pinça para pegar as fatias ao lado do filtro de papel, entregá-los para as camadas da retina tornam-se visíveis, e colocá-los sobre as faixas de graxa de vácuo
- Escolha uma fatia que se parece em bom estado e mostra faixas horizontais indicando as camadas da retina (as camadas são por vezes difíceis de ver sob o microscópio de dissecação como a ampliação não é alta o suficiente, porém, se pode reconhecer algumas camadas a fatia é geralmente suficiente. A decisão final sobre a possibilidade de usar o slice, no entanto, é feita uma vez que é visto sob o microscópio na posição vertical). Movê-lo para o slide câmara de gravação através da construção de uma ponte Ringer entre os dois slides
- Verifique se o filtro de papel é empurrado contra os blocos de borracha na câmara de gravação para que a fatia não é inclinado (células ganglionares e fotorreceptores deve estar em foco ao mesmo tempo)
Colocar o tecido na plataforma de gravação
- O slide de gravação é colocado sob o microscópio e perfundidos com soluções de Ringer através de uma perfusão syste gravidade
- A preparação é visualizado com um microscópio na posição vertical com a objetiva de 10x e 40x de imersão em água.
- Mais uma vez, só usamos luz IR para prevenir branqueamento dos fotorreceptores. Uma câmera de infravermelho é conectado à porta do lado do microscópio, que é conectado a uma tela de TV.
Estimulação Visual
Estímulos visuais são programados em Matlab usando o Psychtoolbox e são projetadas na retina, através da porta superior do microscópio utilizando um microscópio de imagem injector (MBF biociência). A Bits + + processador de vídeo digital (Cambridge Research Systems) é usado para obter uma escala de luminância 14bit e sincr.onize apresentação do estímulo com a aquisição de dados. Os estímulos visuais utilizados neste vídeo são bares claros ou escuros (width = 460μm) de contraste de 100%, que foram apresentados por dois segundos em um fundo uniforme constante (luminância = 8 * 10 4 fótons / M / s, tamanho: 1,84 x 1,38 milímetros).
Eletrofisiologia
- Eletrodos patch são extraídos de vidro de borosilicato (OD:.. ID, 1,5 milímetros 84 milímetros) com um puxador de micropipeta. Para as células ganglionares, as resistências estão entre 2 e 4 Mohms. Para as células bipolares, resistências maiores entre 4 e 8 Mohms são usados.
- Braçadeira de tensão gravações são realizadas usando um 700A Multiclamp (dispositivos Molecular), amplificador e laboratório de software interno programado em Labview.
- Drogas são perfundidos por meio de um sistema de perfusão de 8 canais. O eletrodo é colocado próximo microperfusão à fatia (o tecido deve visivelmente se movem quando você liga a perfusão e desligar, mas é preciso ter cuidado para que a pressão não é forte demais para que a fatia pode-se destacar do papel de filtro). Durante os experimentos a microperfusão deve ser constantemente ligado (solução de controle de perfusão, se nenhuma droga são necessários) para que a gravação não fica perturbado com a mudança da perfusão ligado e desligado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Benefícios:
- Todos os tipos de células são acessíveis
- A fácil identificação de tipos de células, em particular se um corante fluorescente é adicionado à solução do eletrodo
- Agentes farmacológicos pode chegar facilmente a células-alvo
- A técnica de patch clamp permite investigar o papel dos canais iônicos em cálculos diferentes da retina. A mesma informação não pode ser obtida através de gravações extracelluar espiga ou gravações com eletrodos afiada.
- Esta técnica pode ser aplicada a outros modelos animais
Desvantagens:
- Processos pode ter cortado no processo de corte. Portanto, estudos que se concentram no campo espacial receptivo pode ser difícil.
- Como na maioria da retina em preparações in vitro utilizados para eletrofisiologia, o epitélio pigmentar é removido, o que pode levar ao branqueamento dos fotorreceptores. Trabalhos que necessitam de estimulação com intensidades de luz alta ou necessidade de estudar a retina em muitos estados de adaptação pode encontrar dificuldades com esta técnica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Multiclamp 700A | Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| SZX9 | Dissection Micropscope | Olympus Corporation | ||
| BX50WI | Upright Microscope | Olympus Corporation | Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Lucivid | Microscope image injector | MBF Bioscience | ||
| 8-channel perfusion system | Microperfusion | Parker Hannifin Corporation | ||
| Bits++ | Digital Video Processor | Cambridge Research Systems | ||
| Infrared Oculars | Other | ITT Visual Information Solutions | ||
| Adhesive silicone wells | Other | Molecular Probes, Life Technologies | 20mm diameter, 1.0mm deep | |
| Membrane Filters | Filter | EMD Millipore | HAWPO1300 | .45μm HA |
| Borosilicate Glass Capillaries | Electrode glass | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Syringe Filters | Filter | Whatman, GE Healthcare | 6789-0402 | 4mm filters, .2um Nylon Membrane, Polypropylene housing |
| IR camera | Micropscope mounted camera | Sony Corporation | SPT-M324 | Extrawave HAD, B7W video camera |
| Picrotoxin | Reagent | Sigma-Aldrich | P1675 | |
| Strychnine | Reagent | Sigma-Aldrich | S0532 | |
| Imidazole-4-acetic acid sodium salt | Reagent | Sigma-Aldrich | I7013 | |
| Larval tiger salamanders | Animal | Charles E. Sullivan |
References
- Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina. Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).
- Heflin, S. J., Cook, P. B. Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation. Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).
- Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells. J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).
