Overview
本文描述了一种安装活斑马鱼胚胎进行长期成像的方法。这种方法经济高效，使用普通的玻璃底显微镜盘在倒显微镜上成像时易于执行。安装在不同浓度的蔗糖层中执行。
Protocol
1. 胚胎的准备
- 交配后，在培养皿中收获 E3 中的胚胎，并在 26.5 °C 下孵育胚胎约 28 小时，然后安装。
注： 这减缓了胚胎的发育，使胚胎在成像开始时大约处于30个褐虫阶段。 - 在E3中麻醉胚胎0.016-0.020%。为了抑制色素化，将 PTU 添加到 200 μM 的浓度中。
- 在解剖显微镜下使用钳子去除胚胎。使用两个钳子，抓住并轻轻地将胆汁拉开以释放胚胎。
2. 安装在阿加罗斯
注： 开发的安装方法需要在 E3 中使用两种不同浓度的低熔性蔗糖，根据需要提供 0.02% 的三叶草和 PTU。第一个蔗糖溶液包含最佳浓度的蔗糖，其中失真和多功能性是最低限度的。优化在下面的第 5 步中描述。
- 加热两层的 agarose 解决方案（下面第 5 步定义的浓度和 1%）至65°C。 让糖在安装前冷却到大约30°C，这样胚胎就不会受到热量的伤害。对于安装，使用35毫米玻璃底盘与0号盖玻璃底部。连接到盘底的盖玻璃形成一个10毫米浅（约1.2毫米深）的井，其中胚胎将被放置。
注： 在这种情况下，湿度和失真度最低的浓度在 0.025 到 0.040% 之间。 - 使用玻璃移液器或微皮带将一个去矮化的胚胎侧向菜底。如果使用微皮，切开尖端的外侧，以增加开口的大小，以适应胚胎（图1A）。小心地删除任何剩余的E3与微皮。
- 将第一个阿加罗斯溶液添加到连接在盘底的盖玻璃所创造的小井中，以覆盖胚胎（第 1 层）（图 1B）。确保油井覆盖小井，但不会溢出。
- 用盖玻璃盖住小井（22毫米 x 22 毫米）（图 1C），在两个盖玻璃杯之间用胚胎营造一个狭窄的冰盖填充空间。
- 在盘子底部的盖玻璃上放置一层1%的糖溶液（图1D）。当这一层凝固时，它保持盖玻璃到位。
- 用含有 0.02% Tricaine 的 E3 填充菜的剩余部分，以保持系统水分（第 3 层）（图 1E）。
注： 在此设置中，盖玻璃和 1% 的 agarose 可保护底层不被稀释。
3. 优化第 1 层的蔗糖溶液
- 要识别第 1 层的蔗糖的最佳浓度，请使用多尺度网格搜索方法。增加糖体浓度的山胚胎从0.01%到1%不等，然后是胚胎生长限制和视野中动力的延时成像。识别失真和多功能性的浓度。
- 为了进一步优化蔗糖的浓度，根据发现第3.1步（例如，0.025%、0.028%、0.031%等）的最佳浓度，使用更细的糖体浓度范围（例如，在0.025%至0.040%之间）安装胚胎。
注： 在我们的实验室中，最佳蔗糖浓度约为0.03%。
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Representative Results
图1：安装方法的描述。 （A） 将斑马鱼胚胎添加到 35 mm 盘中玻璃底部创建的小井中。（B） 在小井中加入第1层，以覆盖胚胎。（C） 小心地在小井上放置盖玻璃。（D） 在 35 mm 菜的整个底部添加 agarose 第 2 层。（E） 将 E3 添加到菜中。（F） 安装设置的横截面的示意图绘制。（G） 显微镜图像（5倍目标）斑马鱼胚胎在最后蒙太奇。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Micro cover glass 22x22 mm | VWR | 48366 067 |
