Lagdelt Agar-montering: Forberedelse af levende zebrafiskembryoner til langtidsbilleddannelse med et omvendt mikroskop

Overview

Denne artikel beskriver en metode til at montere levende zebrafisk embryoner til langsigtet billeddannelse. Denne metode er omkostningseffektiv og nem at udføre ved hjælp af regelmæssige glasbundede mikroskopiske retter til billeddannelse på omvendt mikroskop. Monteringen udføres i lag af agarose i forskellige koncentrationer.

Protocol

1. Tilberedning af embryoner

1. Efter parring høstes embryoner i E3 i petriskål og inkuberes ved 26,5 °C i ca. 28 timer før montering.
   BEMÆRK: Dette forsinker udviklingen af embryonerne, så embryonerne er ca. 30 somite fase i begyndelsen af billeddannelse.
2. Bedøve embryoner i 0,016-0,020% Tricaine i E3. For at hæmme pigmentering tilsættes PTU til en koncentration på 200 μM.
3. Dechorionate embryonerne ved hjælp af pincet under et dissekerende mikroskop. Brug to pincet, greb og forsigtigt trække chorion fra hinanden for at frigive embryoet.

2. Montering i agarose

BEMÆRK: Den udviklede monteringsmetode kræver to forskellige koncentrationer af lavsmeltnings agarose i E3 med 0,02% Tricaine og PTU efter behov. Den første agaroseopløsning indeholder en optimal koncentration af agarose, hvor forvrængningen og motiliteten er på et minimum. Optimeringen er beskrevet i trin 5 nedenfor.

1. Agaroseopløsningerne opvarmes for de to lag (koncentration defineret i trin 5 nedenfor og 1%) til 65 °C. Lad agarose køle ned til ca. 30 °C lige før montering, så embryoet ikke skades af varmen. Til montering anvendes 35 mm glasbundsretter med en dækglasbund nr. 0. Dækglasset fastgjort til bunden af skålen skaber en 10 mm lavvandet (ca. 1,2 mm dyb) brønd, hvor embryoet skal placeres.
   BEMÆRK: I dette tilfælde var koncentrationen med mindst eltilitet og fordrejninger mellem 0,025 og 0,040% agarose.
2. Placer forsigtigt et dechorioneret embryo med en af dets laterale sider mod bunden af skålen ved hjælp af en glaspipette eller mikropipette. Hvis du bruger en mikropipette, skæres den ydre del af spidsen for at øge størrelsen af åbningen, så den passer til embryoet (Figur 1A). Fjern forsigtigt eventuelle resterende E3 med en mikropipette.
3. Tilsæt den første agaroseopløsning til den lille brønd, der er skabt af dækglasset fastgjort til bunden af skålen for at dække embryoet (Lag 1) (Figur 1B). Sørg for, at agarose dækker den lille brønd, men vil ikke overløbe det.
4. Dæk den lille brønd med et dækglas (22 mm x 22 mm)(figur 1C)for at skabe et smalt agarosefyldt rum med embryoet mellem de to dækglas.
5. Placer et lag på 1% agaroseopløsning oven på dækglasset over hele bunden af skålen (Lag 2)(Figur 1D). Da dette lag størkner, holder det dækglasset på plads.
6. Fyld den resterende del af skålen med E3 indeholdende 0,02% Tricaine for at holde systemet hydreret (Lag 3) (Figur 1E).
   BEMÆRK: I denne opsætning beskytter dækglasset og 1% agarose det nederste lag mod at blive fortyndet.

3. Optimering af agaroseopløsning til lag 1

1. For at identificere den optimale koncentration af agarose for Lag 1, skal du bruge en multiskala gitter søgning tilgang. Monter embryoner i stigende koncentrationer af agarose fra 0,01% til 1% efterfulgt af time-lapse billeddannelse af embryo vækst begrænsning og motilitet på synsfeltet. Identificer de koncentrationer, hvor både forvrængning og motilitet er på et minimum.
2. For at optimere koncentrationen af agarose yderligere, montere embryoner ved hjælp af en finere vifte af koncentrationer af agarose (f.eks mellem 0,025 og 0,040% agarose) afhængigt af koncentrationen viser sig at være bedst i trin 3,1 (f.eks 0,025%, 0,028%, 0,031%, osv.).
   BEMÆRK: I vores laboratorium var den optimale agarosekoncentration omkring 0,03%.

Representative Results

Figur 1 : Beskrivelse af monteringsmetoden. (A) Tilsæt zebrafiskembryoet til den lille brønd, der er skabt af glasbunden, i skålen på 35 mm. (B) Tilsæt agaroselag 1 til den lille brønd for at dække embryoet. (C) Placer forsigtigt et dækglas over den lille brønd. D) Der tilsættes agaroselag 2 i hele bunden af 35 mm skålen. (E) Tilsæt E3 til fadet. (F) Skematisk tegning af et tværsnit af monteringsopsætningen. (G) Mikroskopbillede (5x mål) af zebrafiskembryoet i den endelige montage.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Micro cover glass 22x22 mm	VWR	48366 067