Lagdelt agarmontering: Forbereder levende sebrafiskembryoer for langtidsavbildning med et invertert mikroskop

Overview

Denne artikkelen beskriver en metode for å montere levende sebrafiskembryoer for langsiktig avbildning. Denne metoden er kostnadseffektiv og enkel å utføre ved hjelp av vanlige mikroskopiretter med glassbunn for avbildning på invertert mikroskop. Monteringen utføres i lag av agarose ved forskjellige konsentrasjoner.

Protocol

1. Fremstilling av embryoer

1. Etter parring, høst embryoer i E3 i en Petri-tallerken og inkuber dem ved 26,5 °C i ca. 28 timer før montering.
   MERK: Dette bremser utviklingen av embryoene slik at embryoene er omtrent på 30 somittstadium i begynnelsen av avbildningen.
2. Bedøv embryoer i 0,016-0,020% trikain i E3. For å hemme pigmentering, legg PTU til en konsentrasjon på 200 μM.
3. Dechorionate embryoene ved hjelp av tang under et dissekerende mikroskop. Bruk to tang, grip og trekk forsiktig koret fra hverandre for å frigjøre embryoet.

2. Montering i agarose

MERK: Den utviklede monteringsmetoden krever to forskjellige konsentrasjoner av lavsmeltende agarose i E3 med 0,02% trikain og PTU etter behov. Den første agaroseløsningen inneholder en optimal konsentrasjon av agarose der forvrengningen og motiliteten er på et minimum. Optimaliseringen er beskrevet i trinn 5 nedenfor.

1. Varm opp agaroseløsningene for de to lagene (konsentrasjon definert i trinn 5 nedenfor og 1%) til 65 °C. La agarose avkjøles ned til ca. 30 °C like før montering, slik at embryoet ikke blir skadet av varmen. For montering, bruk 35 mm glassbunnsretter med en no. 0 dekkglassbunn. Dekkglasset festet til bunnen av parabolen skaper en 10 mm grunn (ca. 1,2 mm dyp) brønn, der embryoet skal plasseres.
   MERK: I dette tilfellet var konsentrasjonen med minst bevegelighet og forvrengninger mellom 0,025 og 0,040% agarose.
2. Plasser forsiktig et dechorionated embryo med en av sidesidene mot bunnen av parabolen ved hjelp av en glasspipette eller mikropipette. Hvis du bruker en mikropipette, klipp den ytre delen av spissen for å øke størrelsen på åpningen slik at den passer til embryoet (Figur 1A). Fjern forsiktig eventuell gjenværende E3 med en mikropipette.
3. Tilsett den første agaroseløsningen til den lille brønnen som er opprettet av dekkglasset festet til bunnen av parabolen for å dekke embryoet (lag 1) (figur 1B). Forsikre deg om at agarose dekker den lille brønnen, men ikke vil overløpe den.
4. Dekk den lille brønnen med et dekselglass (22 mm x 22 mm) (Figur 1C) for å skape et smalt agarosefylt rom med embryoet mellom de to dekkglassene.
5. Legg et lag med 1 % agaroseoppløsning på toppen av dekkglasset over hele bunnen av parabolen (lag 2) (figur 1D). Når dette laget størkner, holder det dekselglasset på plass.
6. Fyll den resterende delen av retten med E3 som inneholder 0,02 % trikain for å holde systemet hydrert (lag 3) (figur 1E).
   MERK: I dette oppsettet beskytter dekselglasset og 1% agarose bunnlaget fra å bli fortynnet.

3. Optimalisering av agaroseløsning for lag 1

1. Hvis du vil identifisere den optimale konsentrasjonen av agarose for Lag 1, bruker du en søkemetode for rutenett med flere skalaer. Monter embryoer i økende konsentrasjoner av agarose fra 0,01% til 1% etterfulgt av tidsforløpavbildning av embryovekstbegrensning og bevegelighet innen synsfeltet. Identifiser konsentrasjonene der både forvrengningen og motiliteten er på et minimum.
2. For å optimalisere konsentrasjonen av agarose videre, monter embryoene ved hjelp av et finere utvalg av konsentrasjoner av agarose (f.eks. mellom 0,025 og 0,040% agarose) avhengig av konsentrasjonen som viser seg å være best i trinn 3.1 (f.eks. 0,025%, 0,028%, 0,031%, etc.).
   MERK: I vårt laboratorium var den optimale agarosekonsentrasjonen rundt 0,03%.

Representative Results

Figur 1 : Beskrivelse av monteringsmetode. (A) Tilsett sebrafiskembryoet i den lille brønnen som er laget av glassbunnen i 35 mm parabolen. (B) Tilsett agaroselag 1 i den lille brønnen for å dekke embryoet. (C) Legg forsiktig et dekselglass over den lille brønnen. (D) Tilsett agaroselag 2 på hele bunnen av 35 mm parabolen. (E) Tilsett E3 i retten. (F) Skjematisk tegning av et tverrsnitt av monteringsoppsettet. (G) Mikroskopbilde (5x objektiv) av sebrafiskembryoet i den endelige montasjen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Micro cover glass 22x22 mm	VWR	48366 067