Montaggio agar stratificato: preparazione di embrioni zebrafish vivi per l'imaging a lungo termine con un microscopio invertito

Overview

Questo articolo descrive un metodo per montare embrioni di zebrafish vivi per l'imaging a lungo termine. Questo metodo è conveniente e facile da eseguire utilizzando normali stoviglie di microscopia con fondo di vetro per l'imaging su microscopio invertito. Il montaggio viene eseguito in strati di agarosio a diverse concentrazioni.

Protocol

1. Preparazione degli embrioni

1. Dopo l'accoppiamento, raccogliere embrioni in E3 in una piastra di Petri e incubarli a 26,5 °C per circa 28 ore prima del montaggio.
   NOTA: Ciò rallenta lo sviluppo degli embrioni in modo che gli embrioni siano approssimativamente a 30 gradi all'inizio dell'imaging.
2. Anestetizzare gli embrioni in 0,016-0,020% tricaina in E3. Per inibire la pigmentazione, aggiungere PTU a una concentrazione di 200 μM.
3. Dechorionare gli embrioni usando le forcep al microscopio sezionato. Usando due pinze, afferrare e allontanare delicatamente il corione per rilasciare l'embrione.

2. Montaggio in agarosio

NOTA: Il metodo di montaggio sviluppato richiede due diverse concentrazioni di agarosio a bassa fusione in E3 con 0,02% di Tricaine e PTU in base alle esigenze. La prima soluzione di agarosio contiene una concentrazione ottimale di agarosio alla quale la distorsione e la motilità sono al minimo. L'ottimizzazione è descritta nel passaggio 5 qui sotto.

1. Riscaldare le soluzioni di agarosio per i due strati (concentrazione definita nel passaggio 5 inferiore e 1%) a 65 °C. Lasciare raffreddare l'agarosio a circa 30 °C poco prima del montaggio in modo che l'embrione non sia danneggiato dal calore. Per il montaggio, utilizzare stoviglie inferiori in vetro da 35 mm con fondo in vetro di copertura n. 0. Il vetro di copertura attaccato al fondo del piatto crea un pozzo poco profondo 10 mm (profondo circa 1,2 mm), in cui deve essere posizionato l'embrione.
   NOTA: In questo caso, la concentrazione con la minor motilità e distorsioni era compresa tra lo 0,025 e lo 0,040% di agarosio.
2. Posizionare delicatamente un embrione dechorionato con uno dei suoi lati laterali verso il fondo del piatto utilizzando una pipetta di vetro o una micropipetta. Se si utilizza una micropipetta, tagliare la parte esterna della punta per aumentare le dimensioni dell'apertura per adattarsi all'embrione (Figura 1A). Rimuovere con cura l'E3 rimanente con una micropipetta.
3. Aggiungere la prima soluzione di agarosio al piccolo pozzo creato dal vetro di copertura attaccato al fondo del piatto per coprire l'embrione (Strato 1) (Figura 1B). Assicurarsi che l'agarosio copra il piccolo pozzo ma non lo trabocca.
4. Coprire il piccolo pozzo con un vetro di copertura (22 mm x 22 mm) (Figura 1C) per creare uno spazio stretto riempito di agarosio con l'embrione tra i due occhiali di copertura.
5. Posizionare uno strato di soluzione di agarosio all'1% sopra il vetro di copertura su tutto il fondo del piatto (Strato 2) (Figura 1D). Man mano che questo strato si solidifica, mantiene il vetro di copertura in posizione.
6. Riempire la porzione rimanente del piatto con E3 contenente 0,02% di Tricaina per mantenere il sistema idratato (Strato 3)(Figura 1E).
   NOTA: In questa configurazione, il vetro di copertura e l'1% di agarosio proteggono lo strato inferiore dall'essere diluito.

3. Ottimizzazione della soluzione di agarosio per lo strato 1

1. Per identificare la concentrazione ottimale di agarosio per il livello 1, utilizzare un approccio di ricerca della griglia su più scale. Montare embrioni in concentrazioni crescenti di agarosio che vanno dallo 0,01% all'1%, seguiti dall'imaging time-lapse di restrizione della crescita embrionale e motilità nel campo visivo. Identificare le concentrazioni in cui sia la distorsione che la motilità sono al minimo.
2. Per ottimizzare ulteriormente la concentrazione di agarosio, montare gli embrioni utilizzando una gamma più fine di concentrazioni di agarosio (ad esempio, tra lo 0,025 e lo 0,040% di agarosio) a seconda della concentrazione trovata migliore nel passaggio 3.1 (ad esempio, 0,025%, 0,028%, 0,031%, ecc.).
   NOTA: Nel nostro laboratorio, la concentrazione ottimale di agarosio era di circa lo 0,03%.

Representative Results

Figura 1 : Descrizione del metodo di montaggio. (A) Aggiungere l'embrione zebrafish al piccolo pozzo creato dal fondo di vetro nel piatto da 35 mm. (B) Aggiungere lo strato di agarosio 1 al piccolo pozzo per coprire l'embrione. (C) Posizionare con cura un vetro di copertura sul piccolo pozzo. (D) Aggiungere lo strato di agarosio 2 su tutto il fondo del piatto da 35 mm. (E) Aggiungere E3 al piatto. (F) Disegno schematico di una sezione trasversale dell'insieme di montaggio. (G) Immagine al microscopio (obiettivo 5x) dell'embrione zebrafish nel montaggio finale.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Micro cover glass 22x22 mm	VWR	48366 067