Gelaagde agarmontage: levende zebravisembryo's voorbereiden op langetermijnbeeldvorming met een omgekeerde microscoop

Overview

Dit artikel beschrijft een methode om levende zebravisembryo's te monteren voor langetermijnbeeldvorming. Deze methode is kosteneffectief en gemakkelijk uit te voeren met behulp van gewone microscopieschalen met glazen bodem voor beeldvorming op inverted microscope. De montage wordt uitgevoerd in lagen agarose in verschillende concentraties.

Protocol

1. Bereiding van embryo's

1. Oogst na de paring embryo's in E3 in een petrischaal en incubeer ze ongeveer 28 uur bij 26,5 °C voordat je ze monteert.
   OPMERKING: Dit vertraagt de ontwikkeling van de embryo's, zodat de embryo's zich ongeveer in het 30 somietstadium bevinden aan het begin van de beeldvorming.
2. Verdoof embryo's in 0,016-0,020% Tricaine in E3. Om pigmentatie te remmen, voegt u PTU toe aan een concentratie van 200 μM.
3. Dechorioneer de embryo's met behulp van een tang onder een ontledende microscoop. Pak met twee tangen het koraal vast en trek het voorzichtig uit elkaar om het embryo los te laten.

2. Montage in agarose

OPMERKING: De ontwikkelde montagemethode vereist twee verschillende concentraties laagsmeltagarose in E3 met 0,02% Tricaine en PTU indien nodig. De eerste agarose-oplossing bevat een optimale concentratie agarose waarbij de vervorming en beweeglijkheid tot een minimum worden beperkt. De optimalisatie wordt beschreven in stap 5 hieronder.

1. Verwarm de agarose-oplossingen voor de twee lagen (concentratie gedefinieerd in stap 5 hieronder en 1%) tot 65 °C. Laat de agarose vlak voor montage afkoelen tot ongeveer 30 °C, zodat het embryo niet wordt geschaad door de hitte. Gebruik voor montage glazen bodemschalen van 35 mm met een glasbodem nr. 0. Het afdekglas dat aan de bodem van de schaal is bevestigd, creëert een 10 mm ondiepe (ca. 1,2 mm diepe) put, waarin het embryo moet worden geplaatst.
   OPMERKING: In dit geval lag de concentratie met de minste beweeglijkheid en vervormingen tussen 0,025 en 0,040% agarose.
2. Plaats voorzichtig een gedechorioneerd embryo met een van de zijkanten naar de onderkant van de schaal met behulp van een glazen pipet of micropipet. Als u een micropipet gebruikt, snijdt u het buitenste deel van de punt om de opening groter te maken voor het embryo (figuur 1A). Verwijder de resterende E3 voorzichtig met een micropipet.
3. Voeg de eerste agarose-oplossing toe aan de kleine put die is gemaakt door het afdekglas dat aan de bodem van de schaal is bevestigd om het embryo te bedekken (laag 1) (figuur 1B). Zorg ervoor dat de agarose de kleine put bedekt, maar deze niet overloopt.
4. Bedek de kleine put met een afdekglas (22 mm x 22 mm) (figuur 1C) om een smalle met agarose gevulde ruimte met het embryo tussen de twee afdekglazen te creëren.
5. Leg een laag van 1% agaroseoplossing op de bovenkant van het afdekglas over de hele bodem van de schaal (laag 2) (afbeelding 1D). Terwijl deze laag stolt, houdt het het afdekglas op zijn plaats.
6. Vul het resterende deel van de schaal met E3 met 0,02% Tricaine om het systeem gehydrateerd te houden (laag 3) (figuur 1E).
   OPMERKING: In deze opstelling beschermen het afdekglas en 1% agarose de onderste laag tegen verdund raken.

3. Optimalisatie van agarose oplossing voor laag 1

1. Om de optimale concentratie van agarose voor laag 1 te identificeren, gebruikt u een multiscale rasterzoekbenadering. Monteer embryo's in toenemende concentraties van agarose variërend van 0,01% tot 1% gevolgd door time-lapse beeldvorming van embryogroeibeperking en beweeglijkheid in het gezichtsveld. Identificeer de concentraties waarbij zowel de vervorming als de beweeglijkheid minimaal zijn.
2. Om de concentratie van agarose verder te optimaliseren, monteert u de embryo's met behulp van een fijner bereik van concentraties agarose (bijv. tussen 0,025 en 0,040% agarose) afhankelijk van de concentratie die het beste is bevonden in stap 3.1 (bijv. 0,025%, 0,028%, 0,031%, enz.).
   OPMERKING: In ons laboratorium lag de optimale agaroseconcentratie rond de 0,03%.

Representative Results

Figuur 1 : Beschrijving van de montagemethode. (A) Voeg het zebravisembryo toe aan de kleine put die door de glazen bodem in de schaal van 35 mm is gemaakt. (B) Voeg agaroselaag 1 toe aan de kleine put om het embryo te bedekken. (C) Plaats voorzichtig een afdekglas over de kleine put. (D) Voeg agaroselaag 2 toe aan de gehele bodem van de 35 mm schaal. (E) Voeg E3 toe aan de schaal. (F) Schematische tekening van een doorsnede van de montageopstelling. (G) Microscoopbeeld (5x objectief) van het zebravisembryo in de uiteindelijke montage.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Micro cover glass 22x22 mm	VWR	48366 067