Overview
この記事では、長期イメージングのために生きているゼブラフィッシュ胚を取り付ける方法について説明します。この方法は、逆顕微鏡でのイメージング用の通常のガラス底顕微鏡を使用して、費用対効果が高く、容易に実行できます。この取り付けは、異なる濃度のアガロースの層で行われる。
Protocol
1. 胚の調製
- 交配後、ペトリ皿でE3で胚を収穫し、取り付ける前に約28時間26.5°Cでインキュベートします。
注: これは、胚の発達を遅くし、胚がイメージングの開始時に約30の中マイト段階にあるようにする。 - E3で0.016-0.020%トリカインで胚を麻酔する。色素沈着を抑制するには、PTUを200μMの濃度に加えます。
- 解剖顕微鏡下で鉗子を使って胚をデコリオネートする。2つの鉗子を使用して握り、穏やかに胚を解放するためにコリオンを引き離します。
2. アガロースでの取り付け
注: 開発された取り付け方法では、必要に応じて0.02%トリケーヌとPTUを有するE3の低融解アガロースの2つの異なる濃度が必要です。第1のアガロース溶液は、歪みおよび運動性が最小であるアガロースの最適濃度を含む。最適化は、以下のステップ 5 で説明します。
- 2つの層(以下のステップ5で定義された濃度と1%)のアガロース溶液を加熱する65°Cまで。 胚が熱によって害を受けないように、アガロースを取り付ける直前に約30°Cまで冷却します。取り付けには、35mmガラス底皿に0号カバーガラス底を使用してください。皿の底に取り付けられたカバーガラスは胚が置かれる10mmの浅い(およそ1.2mmの深さ)よく作り出す。
注: この場合、運動性と歪みが最も少ない濃度は、0.025〜0.040%アガロースの間であった。 - ガラスピペットまたはマイクロピペットを使用して、皿の底に向かって側面の1つを持つデコリオネート胚をそっと置きます。マイクロピペットを使用する場合は、先端の外側の部分を切って、胚に合わせて開口部のサイズを大きくする(図1A)。マイクロピペットで残りのE3を慎重に取り除きます。
- 第1のアガロース溶液を、胚を覆う皿の底部に取り付けられたカバーガラスによって作成された小さなウェルに加えて(図1B)。アガロースが小さな井戸を覆っているが、それをオーバーフローしないことを確認してください。
- カバーガラス(22mm x 22 mm)で小さい井戸を覆い(図1C)、2つのカバーグラスの間に胚を持つ狭いアガロース充填空間を作ります。
- カバーガラスの上に1%アガロース溶液の層を置く(レイヤー2) (図1D)。この層が固化するにつれて、カバーガラスを所定の位置に保持します。
- 皿の残りの部分を0.02%トリケーヌを含むE3で満たして、システムを水分補給(レイヤー3)に保つ(図1E)。
注: このセットアップでは、カバーガラスと1%アガロースは、希釈から底層を保護します。
3. 層1のアガロース溶液の最適化
- レイヤ 1 のアガロースの最適な濃度を特定するには、マルチスケール グリッド検索アプローチを使用します。0.01%から1%までのアガロース濃度の増加における胚のマウント、続いて胚の成長制限と視野における運動性のタイムラプスイメージングが行われた。歪みと運動性の両方が最小である濃度を特定します。
- アガロースの濃度をさらに最適化するために、ステップ3.1で最も良い濃度(例えば、0.025%、0.040%アガロース)に応じて、より細かい範囲のアガロース(例えば、0.025〜0.040%のアガロース)を使用して胚を取り付ける(例えば、0.025%、0.028%、0.031%など)。
注: 当研究室では、最適なアガロース濃度は0.03%程度でした。
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Representative Results
図1 : 取り付け方法の説明 (A)ゼブラフィッシュ胚を、35mm皿のガラス底で作られた小さな井戸に加えます。(B)胚を覆う小さな井戸にアガロース層1を加える。(C)慎重に小さな井戸の上にカバーガラスを置きます。(D) 35mm皿の底全体にアガロース層2を加えます。(E) 料理にE3を加えます。(F)取付け設定の断面の模式図。(G)最終モンタージュにおけるゼブラフィッシュ胚の顕微鏡像(5倍の目的)。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Micro cover glass 22x22 mm | VWR | 48366 067 |
