Слой Агар Монтаж: Подготовка живых эмбрионов зебры для долгосрочной визуализации с перевернутым микроскопом

Overview

В этой статье описывается метод установки живых эмбрионов зебры для долгосрочной визуализации. Этот метод является экономически эффективным и простым в использовании регулярных стеклянно-нижней микроскопии посуды для визуализации на перевернутый микроскоп. Монтаж выполняется слоями агарозы в различных концентрациях.

Protocol

1. Подготовка эмбрионов

1. После спаривания, урожай эмбрионов в E3 в чашке Петри и инкубировать их при 26,5 градусов по Цельсию около 28 ч до монтажа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это замедляет развитие эмбрионов, так что эмбрионы находятся примерно на 30 стадиях сомита в начале изображения.
2. Анестезия эмбрионов в 0.016-0.020% Tricaine в E3. Чтобы ингибировать пигментацию, добавьте ПТУ к концентрации 200 МКМ.
3. Дехорионат эмбрионов с помощью хлипов под рассеченным микроскопом. Используя два типса, сцепление и осторожно тянуть хорион друг от друга, чтобы освободить эмбрион.

2. Монтаж в агарозе

ПРИМЕЧАНИЕ: Разработанный метод монтажа требует двух различных концентраций низкорастуающей агарозы в E3 с 0,02% Tricaine и PTU по мере необходимости. Первый раствор агарозы содержит оптимальную концентрацию агарозы, при которой искажение и подвижность являются минимальными. Оптимизация описана в шаге 5 ниже.

1. Нагрейте агарозные растворы для двух слоев (концентрация, определяемая в шаге 5 ниже и 1%) до 65 градусов по Цельсию. Пусть агароза остынет примерно до 30 градусов по Цельсию перед монтажом, чтобы эмбрион не пострадал от жары. Для монтажа используйте 35 мм стеклянные нижние блюда с крышкой No 0. Крышка стекла прилагается к нижней части блюда создает 10 мм мелкой (около 1,2 мм глубиной) хорошо, в котором эмбрион должен быть помещен.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае концентрация с наименьшей подвижностью и искажениями составила от 0,025 до 0,040% агарозы.
2. Аккуратно поместите деторионированный эмбрион с одной из боковых сторон к нижней части блюда с помощью стеклянной пипетки или микропипетта. При использовании микропипета, вырезать внешнюю часть кончика, чтобы увеличить размер отверстия, чтобы соответствовать эмбриона(рисунок 1A). Аккуратно удалите оставшийся E3 с помощью микропипетта.
3. Добавьте первый раствор агарозы в небольшой колодец, созданный крышкой стекла, прикрепленного к нижней части блюда, чтобы покрыть эмбрион (слой 1) (Рисунок 1B). Убедитесь, что агароза покрывает небольшой колодец, но не переполнит его.
4. Обложка небольшой колодец с крышкой стекла (22 мм х 22 мм) (Рисунок 1C), чтобы создать узкую агарозу заполнены пространство с эмбрионом между двумя крышками очки.
5. Поместите слой 1% агарозного раствора поверх крышки стекла по всей нижней части блюда (слой 2) (Рисунок 1D). Как этот слой затвердевает, он держит крышку стекла на месте.
6. Заполните оставшуюся часть блюда СЕ3, содержащую 0,02% Tricaine, чтобы сохранить систему гидратированной (слой 3) (Рисунок 1E).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этой установке, крышка стекла и 1% агарозы защитить нижний слой от разбавления.

3. Оптимизация раствора агарозы для слоя 1

1. Для определения оптимальной концентрации агарозы для слоя 1 используйте многомасштабный подход к поиску сетки. Гора эмбрионов в увеличении концентрации агарозы в диапазоне от 0,01% до 1%, а затем замедленной визуализации ограничения роста эмбриона и подвижности в области зрения. Определите концентрации, где искажение и подвижность минимальны.
2. Для дальнейшей оптимизации концентрации агарозы, смонтировать эмбрионы с использованием более тонкого диапазона концентраций агарозы (например, между 0,025 и 0,040% агарозы) в зависимости от концентрации оказались лучшими в шаге 3,1 (например, 0,025%, 0,028%, 0,031% и т.д.).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В нашей лаборатории оптимальная концентрация агарозы составила около 0,03%.

Representative Results

Рисунок 1 : Описание метода монтажа. (A) Добавить эмбрион зебры к небольшой хорошо созданный стеклянным дном в 35 мм блюдо. (B) Добавить агарозный слой 1 к небольшой колодец, чтобы покрыть эмбрион. (C) Аккуратно поместите крышку стекла над небольшой колодец. (D) Добавить слой агарозы 2 на всем дне 35 мм блюдо. (E) Добавить E3 в блюдо. (F) Схематический рисунок поперечного сечения монтажа создан. (G) Микроскоп изображение (5x цель) эмбриона зебры в окончательном монтаже.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Micro cover glass 22x22 mm	VWR	48366 067