Montaje de agar en capas: Preparación de embriones de pez cebra vivo para imágenes a largo plazo con un microscopio invertido

Overview

En este artículo se describe un método para montar embriones de pez cebra vivos para obtener imágenes a largo plazo. Este método es rentable y fácil de realizar utilizando platos regulares de microscopía con fondo de vidrio para obtener imágenes en el microscopio invertido. El montaje se realiza en capas de agarose a diferentes concentraciones.

Protocol

1. Preparación de embriones

1. Después del apareamiento, coseche embriones en E3 en una placa de Petri e incubarlos a 26,5 °C durante aproximadamente 28 h antes de montarlos.
   NOTA: Esto ralentiza el desarrollo de los embriones para que los embriones estén aproximadamente en 30 etapas de somite al comienzo de la toma de imágenes.
2. Embrións anestesiados en 0,016-0,020% Tricarina en E3. Para inhibir la pigmentación, añadir PTU a una concentración de 200 μM.
3. Desconocra los embriones usando fórceps bajo un microscopio diseccionador. Usando dos fórceps, agarre y tire suavemente de la carroza para liberar el embrión.

2. Montaje en agarose

NOTA: El método de montaje desarrollado requiere dos concentraciones diferentes de agarose de baja fusión en E3 con 0.02% Tricaine y PTU según sea necesario. La primera solución de agarose contiene una concentración óptima de agarose en la que la distorsión y la motilidad son como mínimo. La optimización se describe en el paso 5 siguiente.

1. Caliente las soluciones de agarose para las dos capas (concentración definida en el paso 5 por debajo y 1%) a 65 °C. Deje que la agarose se enfríe a aproximadamente 30 °C justo antes de montar para que el embrión no se dañe por el calor. Para el montaje, utilice platos inferiores de vidrio de 35 mm con un fondo de vidrio de cubierta Nº 0. El vidrio de la cubierta unido a la parte inferior del plato crea un pozo superficial de 10 mm (aprox. 1,2 mm de profundidad), en el que se va a colocar el embrión.
   NOTA: En este caso, la concentración con menos motilidad y distorsiones fue entre 0,025 y 0,040% de agarose.
2. Coloque suavemente un embrión deschorionado con uno de sus lados laterales hacia la parte inferior del plato usando una pipeta de vidrio o micropipette. Si utiliza un micropipette, corte la parte externa de la punta para aumentar el tamaño de la abertura para que se ajuste al embrión (Figura 1A). Retire cuidadosamente cualquier E3 restante con un micropipette.
3. Añadir la primera solución de agarose al pequeño pozo creado por el vidrio de la cubierta unido a la parte inferior del plato para cubrir el embrión (Capa 1) (Figura 1B). Asegúrese de que la agarose cubra el pequeño pozo, pero no lo desbordará.
4. Cubra el pequeño pozo con un vidrio de cubierta (22 mm x 22 mm)(Figura 1C)para crear un espacio estrecho lleno de agarose con el embrión entre las dos gafas de cubierta.
5. Coloque una capa de solución de agarose al 1% en la parte superior del vidrio de la cubierta por toda la parte inferior del plato (Capa 2) (Figura 1D). A medida que esta capa se solidifica, mantiene el vidrio de la cubierta en su lugar.
6. Llene la porción restante del plato con E3 que contenga 0.02% de tricarina para mantener el sistema hidratado (Capa 3) (Figura 1E).
   NOTA: En esta configuración, el vidrio de la cubierta y el 1% de agarose protegen la capa inferior de diluirse.

3. Optimización de la solución de agarose para la capa 1

1. Para identificar la concentración óptima de agarose para la Capa 1, utilice un enfoque de búsqueda de cuadrícula multiescala. Monte embriones en concentraciones crecientes de agarose que van del 0,01% al 1%, seguidos de imágenes de lapso de tiempo de restricción del crecimiento embrionario y motilidad en el campo de visión. Identifique las concentraciones en las que tanto la distorsión como la motilidad son mínimas.
2. Para optimizar aún más la concentración de agarose, monte los embriones utilizando un rango más fino de concentraciones de agarose (por ejemplo, entre 0,025 y 0,040% de agarose) dependiendo de la concentración que se encuentre mejor en el paso 3,1 (por ejemplo, 0,025%, 0,028%, 0,031%, etc.).
   NOTA: En nuestro laboratorio, la concentración óptima de agarose fue de alrededor del 0,03%.

Representative Results

Figura 1 : Descripción del método de montaje. (A) Añadir el embrión de pez cebra al pequeño pozo creado por el fondo de vidrio en el plato de 35 mm. (B) Añadir la capa de agarose 1 al pequeño pozo para cubrir el embrión. (C) Coloque cuidadosamente un vaso de cubierta sobre el pequeño pozo. (D) Añadir la capa de agarose 2 en toda la parte inferior del plato de 35 mm. (E) Añadir E3 al plato. (F) Dibujo esquemático de una sección transversal de la configuración de montaje. (G) Imagen del microscopio (objetivo 5x) del embrión de pez cebra en el montaje final.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Micro cover glass 22x22 mm	VWR	48366 067