Trasplante de células madre en un In vitro Simulación de isquemia / reperfusión modelo

Summary

Demostramos cómo configurar un

Abstract

El trasplante de células madre protocolos están encontrando su camino en la práctica clínica ^1,2,3. Obtener mejores resultados, por lo que los protocolos más robustos, y la búsqueda de nuevas fuentes de células implantables son el foco de las investigaciones recientes ^4,5. La investigación de la eficacia de las terapias con células no es una tarea fácil y se necesitan nuevas herramientas para investigar los mecanismos implicados en el proceso de tratamiento ^6. Hemos diseñado un protocolo experimental de isquemia / reperfusión con el fin de permitir la observación de las conexiones celulares y los mecanismos subcelulares incluso durante la lesión por isquemia / reperfusión y después del trasplante de células madre y para evaluar la eficacia de la terapia celular. H9c2 células cardiomyoblast se colocaron en placas de cultivo celular ^7,8. La isquemia se simuló con 150 minutos en un medio de glucosa libre con el nivel de oxígeno por debajo del 0,5%. Entonces, los medios de comunicación normales y los niveles de oxígeno se volvieron a introducir para simular la reperfusión. Después de la falta de oxígeno la glucosa,las células dañadas fueron tratados con trasplante de médula ósea humana etiquetados derivados de células madre mesenquimales mediante su inclusión en la cultura. Las células madre mesenquimales son las preferidas en los estudios clínicos porque son de fácil acceso con la cirugía mínimamente invasiva, ampliable fácilmente y autólogo. Después de 24 horas de co-cultivo, las células fueron teñidas con calceína y homodímero de etidio-para diferenciar entre células vivas y muertas. Esta configuración nos permite investigar las conexiones intercelulares mediante microscopía confocal de fluorescencia y para cuantificar la tasa de supervivencia de las células postisquémica por citometría de flujo. La microscopía confocal mostraron las interacciones de las dos poblaciones de células, como la fusión celular y la formación de los nanotubos intercelulares. Análisis de citometría de flujo reveló tres grupos de células dañadas que se pueden representar en un gráfico y se analizaron estadísticamente. Estas poblaciones pueden ser investigados por separado y se pueden sacar conclusiones sobre estos datos sobre la eficacia de la simulaciónenfoque terapéutico.

Protocol

1. Preparación de las células H9c2 cardiomyoblast

H9c2 cardiomyoblasts rata se obtuvieron de ATCC (Wesel, Alemania) y ampliado en el alto nivel de glucosa (4,5 g / L) DMEM con 10% de suero fetal bovino, 4 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina y estreptomicina 100 mg / ml. La línea de mioblastos H9c2 células se deriva de corazón de rata embrionaria, que se utiliza como un modelo in vitro para ambos músculo esquelético y cardíaco ^8,9.

Prepare 12 y placa de células H9c2:

1. Quitar medio de cultivo de una placa de Petri de células H9c2.
2. Lavar las células dos veces con 5 ml de PBS y digerir con 2-3 ml de 0,05% de tripsina / EDTA.
3. Colocar placa de Petri durante 5 minutos en la incubadora a 37 ° C.
4. Inhibir la tripsina con 10 ml de medio de cultivo DMEM.
5. Centrifugar las células a 1200 rpm durante 8 minutos.
6. Después de la eliminación de las células sobrenadante, resuspender en 1 ml de medio de cultivo DMEM y las células cuentan con hemocitómetro utilizando tinción con azul tripán.
7. Semillas de 30.000 H9c2 células en 2 ml de DMEM por pocillo en una placa de 12 también.
8. Colocar la placa en los 37 ° C incubadora de CO ₂ durante 24 horas.

2. Isquemia simulada / reperfusión

Isquemia / reperfusión fue simulada in vitro mediante la realización de la privación de oxígeno la glucosa (OGD) en cultivos de células H9c2. Este procedimiento se realizó en la platina del microscopio confocal Zeiss con el sistema de incubación de células PECON (Erbach, Alemania), que permite la observación de las células durante la OGD.

1. Quitar medio por aspiración de 12 pocillos de células H9c2.
2. Lavar las células dos veces con PBS.
3. Añadir 3 ml de medio de glucosa libre por pozo.
4. Colocar la placa en el sistema de incubación de células.
5. Inicio de gas nitrógeno para purgar el oxígeno fuera del sistema de incubación.
6. Espere hasta que el nivel de oxígeno llega a 0,5% luego iniciar el temporizador. 0,5% de oxígeno significa aproximadamente 3 mmHg la tensión parcial. Células sujetas a una50 minutos de isquemia simulada.
7. Al final de la isquemia simulada, eliminar el medio de glucosa libre de las células.
8. Pipetear 2 ml de medio de cultivo normal de los pozos.
9. Coloque la placa de 12 pocillos durante 30 minutos en los 37 ° C incubadora de CO _2, lo que es el "período de reperfusión".

3. Preparación de las células madre mesenquimales de rescate

La médula ósea de origen humano se ha tenido en frascos T75 y se diluye con medio modificado de Dulbecco Eagle (DMEM) medio de cultivo con 10% de suero fetal bovino (FCS), 100 de penicilina U / ml y 100 estreptomicina mg / ml, 4 mM L-glutamina y 1 g / l de glucosa. Los matraces se incubaron a 37 º C en una atmósfera completamente humidificada de 5% de CO ₂ durante 3 días. Después del período de incubación de la BMSCs adherida a la superficie de los frascos y los restantes componentes de la médula ósea se han eliminado mediante el lavado con PBS. El BMSCs utilizados fueron entre 1 y 5 pasajes en los experimentos. La identidadtidad de las células fue confirmado por la presencia del linaje de los marcadores específicos de la superficie celular por citometría de flujo. Hematopoyéticas linaje específico de los marcadores de superficie (CD34, CD45) y marcadores mesenquimales de la superficie (CD73, CD90, CD105 y CD166) fueron investigados.

Durante la isquemia simulada, preparar las células madre mesenquimales de rescate para el trasplante.

1. Diluir el colorante fluorescente Vybrant hizo en relación 1:200 en medio de cultivo DMEM.
2. Aspirar medio de las células de rescate y añadir 300 l DMEM con Vybrant DID.
3. Colocar placa de Petri durante 30 minutos en los 37 ° C incubadora de CO _2.
4. Quitar medio de cultivo de una placa de Petri de células madre mesenquimales.
5. Lavar las células dos veces con 5 ml de PBS y digerir con 2-3 ml de 0,05% de tripsina / EDTA.
6. Colocar placa de Petri durante 5 minutos en la incubadora a 37 ° C.
7. Inhibir la tripsina con 10 ml de medio de cultivo DMEM.
8. Centrifugar las células a 1200 rpm durante 8 minutos.
9. Después de retirar la supecélulas rnatant, resuspender en 1 ml de medio de cultivo DMEM y las células cuentan con hemocitómetro utilizando tinción con azul tripán.
10. Después de 30 minutos al final de la reperfusión añadir 20.000 células madre mesenquimales por tanto a la post-isquémica cardiaca H9c2 mioblastos.
11. Lugar de co-cultivo de células en los 37 ° C incubadora de CO ₂ durante 24 horas.

4. Análisis con microscopía confocal

Después de la simulación de la isquemia / reperfusión, las células se incubaron en medio de cultivo normal durante 24 horas.

1. Después de 24 horas, lave las células dos veces con PBS.
2. Tinción de las células en 500 l en vivo / muerto solución colorante durante 30 minutos (5 nM calceína y 400 Nm de etidio-homodímero-2 en PBS) (5x10 ⁴ células / ml).

La evaluación de las imágenes de confocal de las células vivas y muertas, seleccionados por la morfología y la fluorescencia se puede realizar con el software ImageJ (National Institutes of Health, EE.UU.). En el caso de co-las culturas, las MSC se pueden distinguir de las células H9c2 debido a su etiquetado Vybrant celular DID. La proporción de células muertas pueden ser evaluados en cuatro campos de vista independiente (objetivo 10x) para cada cultura a ciegas ^10.

H9c2 cardiomyoblasts cultivadas en cubreobjetos de 42 mm de cristal también puede ser investigado con el microscopio de vídeo lapso de tiempo durante y después de la lesión por isquemia / reperfusión mediante el sistema de incubación de células del microscopio confocal. Célula a célula de las interacciones, como la fusión celular y la formación de los nanotubos intercelulares, se pueden estudiar a través del tiempo.

5. Análisis por citometría de flujo

Después de la simulación de la isquemia / reperfusión, las células se incubaron en medio de cultivo normal durante 24 horas.

1. Después de 24 horas, la cosecha de los medios de cultivo. Es muy importante para recoger el medio de cultivo también porque algunas células muertas podría haber desprendido de la superficie de la placa de cultivo durante la incubación de 24 horasción.
2. Lavar las células dos veces con PBS y se digieren con 0,05% de tripsina-EDTA.
3. Inhibir la tripsina con medio de cultivo DMEM.
4. Centrifugar las células y el medio de cultivo cosechado a 1200 rpm (aproximadamente 150-200g) durante 8 minutos.
5. Eliminar el sobrenadante.
6. Suspender las células en 500 l en vivo / muerto solución colorante durante 30 minutos (5 nM calceína y 400 Nm de etidio-homodímero-2 en PBS) (5x10 ⁴ células / ml).
7. La transferencia de las células de los tubos de flujo de citometría.
8. Inicie el software Pro CellQuest.
9. Para configurar el citómetro de flujo para la medición, el control de preparar muestras de células vivas y muertas.
   1. Placa H9c2 células a una densidad de 3x10 ⁴ en placas de 12 pocillos como se describe en el punto 1.
   2. Prepare vivir controles de células con tripsinización solo como se describe en el punto 1.
   3. Preparar los controles de las células muertas por el tratamiento con 10 mM H ₂ O ₂ durante 1 hora.
   4. Después de tripsinización, resuspend vivir y los controles de las células muertas en la solución de 500 l tinte vivo / muerto (5 nM calceína-AM y 400 Nm de etidio-homodímero-2 en PBS).
10. La configuración del instrumento se debe ajustar para que las células vivientes son calceína positivo y negativo homodímero de etidio, mientras que las células muertas son calceína negativos y positivos homodímero de etidio.
11. El porcentaje de estas poblaciones puede expresarse como barras en un gráfico y el análisis estadístico se pueden realizar en estos valores.
12. Medir los diferentes grupos experimentales.

6. Los resultados representativos:

Nuestros resultados mostraron que añadir las células madre mesenquimales podrían mejorar la supervivencia de las células cardíacas postisquémica. Imágenes de microscopía confocal reveló directa de célula a célula interacciones, como la conexión a la membrana parcial o nanotubos intercelulares, lo que probablemente juegan un papel importante en la protección observada ^10. Estos nanotubos abarcan distancias de varias células diameters, y sus diámetros son entre 200 y 500 nm (flechas blancas).

Figura 1. La formación de nanotubos de entre las células. Formación de nanotubos (flecha blanca) se observó entre Vybrant cardiomyoblasts DiO etiquetados y marcados Vybrant SABÍA células madre mesenquimales.

Análisis de citometría de flujo mostró las poblaciones de sobrevivir y cardiomyoblasts necrótico y las células madre mesenquimales. Curiosamente, también se observó una población cardiomyoblast tercero, 'herido' de células que contiene calceína, pero también contiene el indicador de las células muertas, homodímero de etidio (Figura 2).

Figura 2. Representante punto de parcelas de los diferentes poblaciones de células después de la isquemia simulada.

La evaluación de varios experimentos showed que la adición de células madre mesenquimales a postisquémica cardiomyoblast H9c2 aumentó significativamente el porcentaje de células vivas en comparación con los mioblastos cardiacos cultivadas solo después de la isquemia (Figura 3).

Figura 3. . Efecto del tratamiento con células madre en cardiomyoblasts postisquémica porcentaje de las células vivas se redujo significativamente después de la isquemia simulada en comparación con el control (control vs modelo IR: 90,36 ± 2,60 vs 10,52 ± 0,48, *** p> 0,001), que aumentó después de la adición de células madre mesenquimales (IR modelo vs IR + BMSC: 10,52 ± 0,48 vs 25,21 ± 2,13, *** p> 0,001). Los datos representan la media ± SEM. El análisis estadístico de los datos se realizó mediante un análisis de varianza con el mensaje comparación múltiple de Tukey hoc test.

Discussion

El protocolo se ha demostrado un enfoque in vitro a la cuestión mucho más compleja de la terapia celular en infarto de miocardio, con todas las ventajas y desventajas de este modelo. Obviamente, no puede reflejar el complejo (inmunológicos, por ejemplo) los acontecimientos que ocurren durante y después del infarto de miocardio, pero puede centrarse en los efectos directos de las células añadido en las células postisquémica. Los efectos de la isquemia simulada en H9c2 cardiomyoblasts dependen en gran medida el momento de la OGD, en el número de paso de las células utilizadas y en la concentración de O _2. Hay que ajustar estos parámetros con precisión y encontrar las condiciones óptimas para un tipo de célula determinado con el fin de tener un protocolo estandarizado. Posteriormente, el protocolo se puede utilizar de muchas maneras (renal, hepática o cerebral por isquemia / reperfusión ^11,12,13,14) para investigar los efectos de diferentes tipos de células agregado, como las células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas, o células madre adultas ^15, el correoEFICACIA de medio condicionado ^{de 16} diferentes tratamientos previos ^17,18 o cualquier otro parámetro en el centro de interés.