Summary
الأسلاف، معربا عن Nestin هي التي تم تشخيصها حديثا من السكان الأسلاف العصبية في المخيخ النامية. باستخدام تقنية تسليخ مجهري المقدمة هنا في تركيبة مع الفلورسنت تنشيط الفرز الخلية، ويمكن تنقية هذا السكان الخلية مع عدم وجود تلوث من المناطق الأخرى للدماغ ويمكن تربيتها لمزيد من الدراسات.
Abstract
تسليخ مجهري هو أسلوب الرواية التي يمكن عزل مناطق معينة من الأنسجة وإزالة التلوث من مصادر الخلوية في المناطق المجاورة. وقد استخدمت هذه الطريقة لأول مرة في دراسة Nestin، معربا عن الأسلاف (NEPS)، يبلغ عدد سكانها التي تم تشخيصها حديثا من الخلايا في الطبقة الخارجية للدماغ جرثومي (EGL). باستخدام تسليخ مجهري في تركيبة مع الفلورسنت تنشيط الفرز الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية)، تم جمع السكان نقية من NEPS بشكل منفصل عن التقليدية السلائف الحبيبية الخلايا العصبية في EGL من تلويث وخلايا Nestin، معربا عن الأخرى في المخيخ. دون تسليخ مجهري، والتحليلات الوظيفية للNEPS لم يكن ممكنا مع الأساليب المتاحة حاليا، مثل التدرج Percoll الطرد المركزي والقبض على الليزر تسليخ مجهري. ويمكن أيضا أن تطبق هذه التقنية للاستخدام مع الأنسجة المختلفة التي تحتوي إما مناطق معروفة أو خلايا fluorescently المسمى. الأهم من ذلك، الميزة الرئيسية لهذا microdissectioن الأسلوب هو أن الخلايا المعزولة يعيشون ويمكن تربيتها لمزيد من التجارب، وهو حاليا غير ممكن مع الأساليب المذكورة الأخرى.
Introduction
يتكون المخيخ من طبقات خلايا متعددة، تحتوي على كل أنواع الخلايا متميزة. خلال التنمية، وEGL يحتوي المتكاثرة السلائف الحبيبية الخلايا العصبية (الناتج القومي الإجمالي) في حين أن طبقة طبقة الجزيئية والعصبية تحتوي على بيرجمان الدبقية والخلايا العصبية، على التوالي. في عمق المخيخ تكمن المادة البيضاء، والذي يحتوي على الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) و oligodendrocytes 1.
القنفذ الصوتي (شش) يلعب دورا حاسما في تنظيم وتطوير المخيخ على وجه الخصوص، أنه يعزز انتشار الناتج القومي الإجمالي عن طريق ملزمة لمستقبله مرقع (PTC)، منظم السلبي للشش يشير 2-4. تفعيل الشاذة من شش الإشارات يولد نخاعي (MB)، ورم خبيث في الدماغ الأكثر شيوعا في الأطفال 5،6.
المؤسسة العامة للاتصالات MB متحولة نماذج الماوس المعدلة وراثيا هي أدوات قوية لدراسة MB وتطوير الأورام تشبه MB 7،8 البشري. باستخدام هذهالفئران، تم اكتشاف أن الناتج القومي الإجمالي هي خلايا المنشأ للالقنفذ من نوع MB 7. وعلاوة على ذلك، بالإضافة إلى الناتج القومي الإجمالي، حددنا مؤخرا السكان فريد من الأسلاف العصبية داخل EGL من المخيخ النامية التي يمكن أن تؤدي إلى MB. هذه الخلايا التعبير عن مستويات عالية من النوع السادس بروتين خيوط وسيطة، Nestin، وصفته NEPS 9. وتقع NEPS داخل الجزء العميق من EGL وجود عابر فقط خلال تطوير المخيخ الولدان. انهم ملتزمون النسب الخلية الحبيبية حيث الناتج القومي الإجمالي ولكنها متميزة كما هي هادئة ولا تعبر Math1، علامة راسخة لالناتج القومي الإجمالي التقليدية 10. بالإضافة إلى ذلك، NEPS تثير MB أكثر كفاءة من الناتج القومي الإجمالي بعد تفعيل شش 9 إشارات الطريق، مما يجعلها أصل الرواية لMB تكون الأورام.
نحن معزولة سابقا NEPS من EGL المخيخ في يوم ما بعد الولادة 4 (P4) بواسطة تقنية تسليخ مجهريالموصوفة هنا 9. تسليخ مجهري عبر التصور المجهري المباشر من الأنسجة يسمح للتشريح محدد من EGL المخيخ. وهذا أمر ضروري كما يعبر Nestin أيضا NSCs في المادة البيضاء للدماغ وبيرجمان الدبقية في طبقة الجزيئية 1،7،11،12 وكان من الأهمية بمكان أن هذه الخلايا لم تدرج، لأنها نخلط التحليل. خلايا معزولة عن الأنسجة microdissected يمكن استخدامها على الفور للتحليل الجزيئي أو أنها يمكن تربيتها لمزيد من التطبيقات.
للمساعدة في microdissecting تحديدا EGL، ومواصلة تنقية NEPS، وقد عبرت Math1-GFP (ببروتين أخضر) الفئران مع Nestin-CFP (سماوي البروتين الفلوري) الفئران. عامل النسخ يتم التعبير Math1 تحديدا من الناتج القومي الإجمالي وGFP التعبير مرئيا بوضوح في EGL 9،13. الفئران Nestin-CFP تعبر عن شكل النووي الحراجية ويمكن تصور بسهولة في طبقة الجزيئية 9،14. معا، وGFP CFP التعبير خلق الحدود للتسليخ مجهري من EGL (انظر الشكل 1). تم NEPS CFP إيجابية ثم عزل من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية، في أعقاب تفكك الأنزيمية للEGLs تشريح.
حاليا، الأسلوب الأكثر استخداما جيدا لعزل الخلايا من EGL هو Percoll الطرد المركزي التدرج من الأنسجة دماغ كامل 15،16. هذه الطريقة، ومع ذلك، غير قادر على أن تستبعد كليا السكان الخلية Nestin + من الطبقة الجزيئية والمادة البيضاء، وبالتالي لا يمكن استخدامها لدراسة NEPS. القبض على الليزر تسليخ مجهري، والذي يستخدم نقل طاقة الليزر لإزالة الخلايا من الفائدة، هو طريقة أخرى تستخدم لعزل خلايا معينة داخل الأنسجة غير المتجانسة 17،18 ولكن يمكن فقط أن تستخدم الخلايا والقبض لاسترداد DNA، RNA والبروتين وليس قادرة على أن تكون مثقف.
يوفر هذا البروتوكول طريقة لعزل وحيا، والسكان نقية من NEPS من EGL على وجه التحديد.ويمكن أيضا أن تطبق هذه التقنية لأنواع الأنسجة المختلفة التي إما بنية تشريحية أو التعرف fluorescently المسمى خلايا / المناطق. ولذلك، فإن الميزة الرئيسية لدمج هذه التقنية الجديدة في تسليخ مجهري بروتوكولات العزل الخلية أن الخلايا يمكن أن تكون معزولة من مناطق الأنسجة محددة للقضاء على تلوث الأنسجة المجاورة والخلايا يمكن جمعها فورا للتحليل أو مثقف لتطبيقات أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تم تنفيذ استخدام الحيوانات في هذا البروتوكول وفقا للإجراءات المعتمدة من قبل لجنة مركز سرطان رعاية الحيوان واستخدام فوكس تشيس.
1. إعداد الآلات، حلول، وCoverslips
- نظيفة مجموعتين من # 5 ملقط غرامة، مجموعة واحدة من رقم 7 ملقط المنحنية الجميلة، واحدة كبيرة مقص جراحي، مقص microdissecting واحدة، ملعقة واحدة وملعقة مثقوبة واحد. وضع الصكوك في الحقيبة التعقيم الختم الذاتي والأوتوكلاف. إبقاء الأدوات في الحقيبة حتى جاهزة للاستخدام.
- إعداد 3٪ درجة حرارة انصهار منخفضة الحل الاغاروز.
- إضافة 1.5 غرام الاغاروز في 50 مل من العقيمة Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS) ثم وضع في الميكروويف والحرارة حتى تظهر فقاعات. وقد حل قارورة دوامة ويسخن حتى كل الاغاروز. مزيج حل مع بقضيب قبل التدفئة إذا ظهرت كتل.
- مخزن حل في 37 ° C حمام الماء لحين الحاجة إليها.
- لstorag على المدى الطويلالإلكترونية، وتخزين الحل الاغاروز لاستخدامها في المستقبل في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجة مئوية لمدة أشهر. يسخن في الميكروويف لتسييل. لتسخين المتكررة من الحل الاغاروز، وزن القارورة قبل تسخين للحفاظ على الوزن الأولي بالماء المقطر المعقم الدافئ.
- إعداد الحلول التالية للغراء التفكك القائم على خلية كما هو موضح سابقا 2:
- والحل مع غراء غراء (100 U / مل)، السيستين (0.2 ملغ / مل) والدناز (250 U / مل) في الفينول الأحمر العقيمة التي تحتوي DPBS.
- حل مخاطاني البيض مع ألبومين المصل البقري (BSA و 8 ملغ / مل)، فول الصويا مثبط التربسين (8 ملغ / مل)) والدناز (250 U / مل) في العقيمة التي تحتوي على الفينول الأحمر DPBS.
فلتر تعقيم كل من الحلول وضبط درجة الحموضة للعودة اللون الأصلي من الفينول التي تحتوي الأحمر DPBS.
- تعد وسائل الإعلام ثقافة الخلية (ملحوظة / B27): استكمال وسائل الاعلام القاعدية مع 1 ملي البيروفات الصوديوم، 2 مم L-الجلوتامين، 1٪ البنسلين الستربتوميسين (P / S) وB27 الملحق. Filteص تعقيم وحماية من الضوء. تتوازن وسائل الإعلام عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 قبل الاستخدام.
- إعداد عازلة FACS: 5٪ مصل بقري جنيني (FBS) في DPBS. إضافة 2.5 مل FBS إلى 47.5 مل DPBS.
- إعداد بولي-D-يسين (PDL) coverslips -coated.
- الأوتوكلاف coverslips الزجاج جديدة.
- معطف لل coverslips مع PDL (100 ميكروغرام / مل في الماء المقطر المعقم)، واحتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية أو درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
- غسل coverslips مع الماء المقطر المعقم. يغسل مرة واحدة مع ملاحظة / B27 سائل الإعلام. دعونا coverslips تجف تماما في الأنسجة الثقافة غطاء محرك السيارة قبل استخدامها.
2. تشريح وإعداد شرائح الأنسجة
- في يوم تشريح، مسح أسفل منطقة تشريح مع الايثانول 70٪ والغطاء مع وسادة ماصة.
- إزالة أدوات تشريح من الحقيبة التعقيم. إضافة الجليد الباردة، DPBS العقيمة / 1٪ P / S لطبق بيتري صغير ومكان على الجليد.
- قطع رأس P4 Math1-GFP / Nestin-CFP الجراء الفأر مع مقص جراحي كبيرة ثم تمسك الرأس إلى أسفل مع ملقط المنحنية الجميلة. إزالة الجلد وقشر بلطف بعيدا الجمجمة مع # 5 ملقط غرامة ثم مغرفة من الدماغ من الجمجمة باستخدام ملعقة وتحويلها إلى طبق بتري تحتوي DPBS / 1٪ P / S.
- باستخدام # 5 ملقط غرامة، بعناية فصل المخيخ عن بقية الدماغ. تأكد من تشريح الجرو في وقت واحد في أسرع وقت ممكن.
- جمع ما لا يقل عن 8 مخيخات من أجل الحصول على ما يكفي من NEPS للالتحليلات الجزيئية والوظيفية.
- ملء القالب تضمين قياس 2 × 2 × 2 سم 3٪ مع انخفاض درجة حرارة انصهار الحل الاغاروز. تأكد من أن درجة حرارة الاغاروز لا تتجاوز 37 درجة مئوية.
- إزالة السائل الزائد من المخيخ بواسطة اللمس بلطف على الأنسجة المختبر. وضع المخيخ في القالب في وضع عمودي. وضع القالب على الجليد لتمكينه من ترسيخ بسرعة. استخدام ~ 4 مخيخات لكل كتلة.
- الحصول لىأقسام الأنسجة فينج مع تهتز شفرة vibratome. تقليم التي تحتوي على مخيخات كتلة الاغاروز بشفرة حلاقة. الغراء كتلة agarose إلى لوحة vibratome مع مخيخات الموجهة في وضع عمودي.
- ملء علبة من vibratome مع الجليد الباردة DPBS العقيمة / 1٪ P / S ومكان تحت الجليد.
- قطع 600 ميكرون من خلال أقسام طول كل من المخيخ. جمع المقاطع من علبة الجليد باستخدام ملعقة مثقوبة. أقسام مكان في طبق بتري مليئة DPBS / 1٪ P / S على الجليد.
3. تسليخ مجهري والتفكك خلية
- وضع طبق بتري تحتوي على شرائح الأنسجة تحت المجهر الفلورسنت تشريح.
- فصل بعناية EGL عن بقية القسم المخيخ باستخدام ملقط غرامة من قبل في تشريح بين CFP + طبقة الجزيئية وGFP + EGL (يرجى الرجوع إلى الخط المنقط في الشكل 1). كن حذرا حتى لا يتضمن أي جزء من طبقة الجزيئية، الأمر الذي سيؤدي فيتلوث، معربا عن Nestin بيرجمان الدبقية.
- إتمام هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن والحفاظ على الأنسجة على الجليد لتجنب موت الخلية.
- إزالة الأنسجة المحيطة الاغاروز قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
- هضم الأنسجة EGL microdissected باستخدام بروتوكول القائم على غراء كما هو موضح سابقا 2 للحصول على تعليق خلية واحدة.
- إعادة تعليق الخلايا في عازلة نظام مراقبة الأصول الميدانية لجمع الخلايا CFP إيجابية عبر نظام مراقبة الأصول الميدانية.
4. خلية الفرز والتصفيحات
- نوع خلايا لمضان CFP باستخدام معقم، وارتفاع سرعة تدفق عداد الكريات التي تحتوي على عامل تصفية الحراجية المناسبة وجمع الخلايا في المخزن FACS على الجليد. الحصول على ما يقرب من 100،000 NEPS من كل المخيخ P4.
- خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. استخدام خلايا فورا للتحليل الجزيئي أو ثقافة لمزيد من التجارب.
- إلى خلايا الثقافة، واعادة تعليق الخلايا في مرحلة ما قبل تحسنت NB / B27 موالقانونين لوحة coverslips على PDL المغلفة كما سبق وصفه 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كما هو مبين في الشكل 1A، تم إعداد شرائح من دماغ P4 Math1-GFP / الفئران Nestin-CFP، الذي سيطر على EGL المخيخ من الناتج القومي الإجمالي، معربا عن GFP وإثراء طبقة الجزيئية الخلايا الدبقية CFP إيجابية. لعزل NEPS التي تقع في الجزء العميق من EGL، تم microdissected بين شرائح EGL وطبقة الجزيئية (على طول خط متقطع. الشكل 1A). EGLs تشريح (الشكل 1B) ثم جمعت لتفارق الأنزيمية تليها FACS.
كما هو متوقع، كانت أغلبية (أكثر من 85٪) من الخلايا في EGL تشريح الناتج القومي الإجمالي التقليدية، التي كانت إيجابية للGFP (الشكل 2A). NEPS (CFP +) تمثل فقط حوالي 5٪ من السكان الخلية EGL. لا شيء تقريبا من الخلايا كانت نقرا مزدوجا إيجابي لGFP والحراجية استنادا إلى تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. كانت CFP + الخلايا تنقيته بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية، تربيتها في المختبر لدراسة التمايز بوتيهntial. كما هو مبين في الشكل 2B، NEPS أعطى حصرا أدى إلى β-تويولين + الخلايا العصبية بعد 4 أيام في الثقافة، مما يوحي NEPS هي المقيدة نسب الأسلاف العصبية.
بواسطة هذا البروتوكول تسليخ مجهري، وتنقيته NEPS والناتج القومي الإجمالي أيضا من EGL من المؤسسة العامة للاتصالات المخيخ ناقص. على زرع داخل الجمجمة، NEPS تطوير ميجا بسرعة أكبر مقارنة مع الناتج القومي الإجمالي، مشيرا إلى أن NEPS عرضة بشكل خاص للتحول أنكجنيك 9.
الرقم 1. تحديد المنطقة لEGL تسليخ مجهري. الصور الفلورسنت من P4 Math1-GFP / حيوانات Nestin-الحراجية المعتمدة. يقع (A) GFP التعبير في EGL، في حين أن غالبية CFP التعبير يقع في طبقة الجزيئية. تم تسليخ مجهري على طول رانه خط منقط الأصفر. جمعت (B) EGLs للتفكك الأنسجة. تم تعديل هذا الرقم من لي وآخرون 9.
الشكل 2. NEPS تمثل عدد صغير من السكان من الخلايا في EGL والمقيدة هي نسب الأسلاف العصبية. (A) التدفق الخلوي تحليل CFP + خلايا معزولة من microdissected EGL. كان المثقف (B) NEPS في ظل ظروف التمايز لمدة 4 أيام وملطخة لβ-تويولين (الحمراء) و counterstained مع دابي (الأزرق). تم تعديل هذا الرقم من لي وآخرون. 9
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة تسليخ مجهري الموصوفة هنا هو الإجراء الأول قادرا على عزل السكان نقية من الخلايا الحية لاستخدامها في التحليلات الجزيئية والوظيفية. كما يتبين من لي وآخرون. 9، NEPS التي حصلت عليها هذه الطريقة يمكن تربيتها ودمجها في التجارب المختلفة وبسبب نقاء عالية، ويمكن أن تستخدم أيضا لتحليل ميكروأري.
من المهم جدا أن تأخذ الوقت لإتقان هذه التقنية مع تسليخ مجهري. وتقع NEPS في المنطقة العميقة من EGL على مقربة جدا من طبقة الجزيئية، التي، معربا عن Nestin بيرجمان الدبقية يمكن أن تلوث العزلة خلية NEP وبخرق النقاء. ولذلك ينبغي أن يتم تسليخ مجهري متحفظ لجعل خلايا تلويث المؤكد في الأنسجة المجاورة ليست مدرجة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية تسليخ مجهري الموصوفة هنا هي القدرة على الحصول على الخلايا الحية التي يمكن تربيتها لابعد من ذلكص التجريب. وبسبب هذا، فمن الأهمية بمكان أن جميع الخطوات خلال هذا الإجراء أن يتم بسرعة وأن تبقى أن الأنسجة على الجليد قدر الإمكان. أيضا، يجب أن تكون جميع الأجهزة والكواشف العقيمة. وباتباع هذه الخطوات تقليل موت الخلايا وتلوث ثقافة الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تصاعد مخيخات متعددة لكل كتلة الاغاروز تساعد في تقليل الوقت الإجراء.
هذه التقنية لا يقتصر على عزل NEPS، ويمكن استخدامها لجمع الخلايا من مناطق أخرى من المخيخ، مثل الخلايا الدبقية من الطبقة الجزيئية والخلايا الجذعية العصبية من المادة البيضاء. بجانب المخيخ، تسليخ مجهري يمكن استخدامها مع الأنسجة الأخرى التي تحتوي على مناطق معترف بها، مثل الحصين، على سبيل المثال. استخدام الجينات المحورة الفلورسنت، وتستخدم هنا، يمكن أن تساعد في خلق حدود أو تحديد مناطق للتشريح، التي يمكن أن تكون مفيدة خاصة في الأنسجة التي تفتقر المناطق التي يسهل التعرف عليها وإلا لن تكون قادرة على أن تكون مicrodissected. وبالتالي يمكن لهذه التقنية أن تساعد في التنقيات خلية في مجموعة واسعة من المجالات البحثية والتطبيقات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر جيمس Oesterling عن التدفق الخلوي المساعدة. وأيد هذا البحث من خلال منحة من المعهد الأمريكي الوطني للسرطان (R01-CA178380، ZY) ومنحة المعاهد الوطنية الأمريكية للتدريب ما بعد الدكتوراه (5T32CA009035-37، LWY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| Ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
References
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-114 (1999).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
- Riobo, N. A., Manning, D. R. Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs. Biochem J. 403, 369-379 (2007).
- Dahmane, N., et al. The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis. Development. 128, 5201-5212 (2001).
- Marino, S. Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control. Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).
- Yang, Z. J., et al. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Sutter, R., et al. Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas. Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).
- Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells. J Neurosci. 14, 124-133 (1994).
- Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).
- Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Espina, V., et al.
