Summary
Progenitores que expressam nestina são uma população recentemente identificada de progenitores neuronais no cerebelo em desenvolvimento. Usando a técnica de microdissecção aqui apresentados em combinação com separação de células activada por fluorescência, esta população de células pode ser purificado sem contaminação de outras regiões do cerebelo e podem ser cultivadas para estudos posteriores.
Abstract
Microdissecção é uma nova técnica que pode isolar regiões específicas de um tecido e eliminar a contaminação a partir de fontes celulares em áreas adjacentes. Este método foi utilizado pela primeira vez no estudo de nestina expressa progenitoras (NEPs), uma população de células recentemente identificados na camada germinal externa cerebelar (EGL). Usando microdissecção em combinação com separação de células activada por fluorescência (FACS), uma população pura de NEPs foi recolhido separadamente, a partir de precursores neuronais dos grânulos convencionais na EGL e de outros contaminantes células que expressam nestina-no cerebelo. Sem microdissecção, análises funcionais de NEPs não teria sido possível com os atuais métodos disponíveis, tais como a centrifugação em gradiente de Percoll e captura a laser microdissecção. Esta técnica também pode ser aplicado para utilização com vários tecidos que contêm tanto regiões conhecidas ou células marcadas fluorescentemente. Mais importante ainda, uma grande vantagem do presente microdissection técnica é que as células isoladas são de vida e pode ser cultivado para experimentação posterior, o que não é actualmente possível com os outros métodos descritos.
Introduction
O cerebelo é composta de várias camadas de células, cada uma contendo tipos celulares distintas. Durante o desenvolvimento, a EGL contém proliferando grânulos dos neurônios precursores (PNB), enquanto a camada molecular e camada de Purkinje conter Bergmann glia e neurônios de Purkinje, respectivamente. Profundamente dentro do cerebelo encontra-se a substância branca, que contém células-tronco neurais (NCCC) e oligodendrócitos 1.
Sonic hedgehog (Shh) desempenha um papel fundamental na regulação do desenvolvimento do cerebelo e, em particular, que promove a proliferação de PNB através da ligação ao seu receptor de Patched (Ptc), um regulador negativo da sinalização Shh 2-4. A ativação anormal de sinalização Shh gera meduloblastoma (MB), o tumor cerebral maligno mais comum em crianças 5,6.
PTC MB mutantes modelos transgênicos são ferramentas poderosas para o estudo da MB e desenvolver tumores que lembram MB humano 7,8. Usando estesratos, foi descoberto que PNB são a célula de origem para hedgehog de tipo MB 7. Além disso, em adição ao PNB, que recentemente identificada uma população única de células progenitoras neuronais dentro da EGL do cerebelo em desenvolvimento, que também pode dar origem a MB. Estas células expressam níveis elevados da proteína de tipo VI filamento intermediário, nestina, e são denominados NEPs 9. NEPs estão localizados na parte profunda da EGL existir transitoriamente e apenas durante o desenvolvimento do cerebelo neonatal. Eles estão comprometidos com a linhagem de células granulares como PNB, mas são distintos como eles estão quietos e não expressam Math1, um marcador bem estabelecido para PNB convencionais 10. Além disso, NEPs dar origem a MB de forma mais eficiente do que o PNB após a ativação da via de sinalização Shh 9, que lhes uma nova origem para MB tumorigenesis faz.
Nós NEPs da EGL cerebelar previamente isolada no dia pós-natal 4 (P4) pela técnica de microdissecçãodescrito aqui 9. Microdissecção visualização microscópica directa através do tecido permite a dissecção específica da EGL cerebelar. Isto é necessário porque Nestin também é expressa por NSC na substância branca do cerebelo e por Bergmann glia na camada molecular 1,7,11,12 e era crucial que estas células não ser incluídos, como eles iriam confundir análise. As células isoladas a partir de tecido microdissecados pode ser imediatamente utilizado para a análise molecular, ou podem ser cultivadas para outras aplicações.
Para ajudar na especificamente microdissecting a EGL e para purificar ainda mais NEPs, ratos Math1-GFP (proteína fluorescente verde) foram cruzados com camundongos Nestin-CFP (proteína fluorescente ciano). O factor de transcrição de Math1 é especificamente expresso por PNB e expressão da GFP é claramente visível na EGL 9,13. Ratinhos nestina-PCP expressar uma forma nuclear de PCP e podem ser facilmente visualizadas na camada molecular 9,14. Juntos, GFP e expressão PCP criar limites para microdissecção do EGL (ver Figura 1). NEPs PCP-positivos foram então isolados por FACS, após dissociação enzimática das GECV dissecados.
Actualmente, o método mais bem utilizados para isolar células da EGL é centrifugação em gradiente de Percoll de tecido cerebelar toda 15,16. Este método, no entanto, não é capaz de excluir completamente populações celulares nestina + a partir da camada molecular e da matéria branca e, portanto, não pode ser usado para o estudo de NEPs. Microdissecção captura a laser, que utiliza a transferência de energia laser para remover as células de interesse, é outro método usado para isolar células específicas dentro de um tecido heterogéneo 17,18 mas apenas células capturadas podem ser usadas para a recuperação de ADN, ARN e proteína e não está capazes de ser cultivadas.
Este protocolo fornece uma maneira de isolar especificamente um puro população vivo, de NEPs da EGL.Esta técnica também pode ser aplicado para diferentes tipos de tecidos que tenham ou arquitectura anatómica reconhecível ou marcados com fluorescência células / regiões. Por conseguinte, a principal vantagem de incorporar esta técnica microdissecção novo em protocolos de isolamento de células é que as células podem ser isoladas a partir de regiões específicas do tecido para eliminar os contaminantes de tecidos vizinhos e as células podem ser recolhidas para análise imediatamente ou cultivadas durante outras aplicações.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
A utilização de animais neste protocolo foi realizado de acordo com os procedimentos aprovados pelo Comitê Cancer Center, Animal Care and Use a Fox Chase.
1. preparação de instrumentos, Solutions e Lamelas
- Limpe dois conjuntos de # 5 pinça fina, um conjunto de # 7 pinças curvas finas, uma grande tesoura cirúrgica, uma tesoura microdissecting, uma espátula e uma colher perfurada. Coloque os instrumentos em uma auto-selante bolsa de esterilização e autoclave. Mantenha instrumentos em bolsa até que esteja pronto para uso.
- Prepara-se uma solução de agarose de baixo ponto de fusão de 3%.
- Adicionar 1,5 g de agarose em 50 ml de tampão fosfato salina estéril por Dulbecco (DPBS) em seguida, coloque no microondas e aqueça até que apareçam bolhas. Frasco do redemoinho e reaquecimento até que todos agarose foi dissolvida. Misturar a solução com uma barra de agitação, antes do aquecimento, se aglomerados aparecer.
- Solução da loja em um banho de água a 37 ° C até ser necessário.
- Para armaze longo prazoe, armazenar a solução de agarose para uso futuro, à temperatura ambiente ou a 4 ° C, durante meses. Reaquecimento no microondas para liquefazer. Para o aquecimento repetido da solução de agarose, pesar o frasco antes de aquecimento para manter o seu peso inicial, com água destilada estéril quente.
- Preparar as seguintes soluções para a dissociação de células à base de papaína como descrito previamente 2:
- A solução de papaína com papaína (100 U / ml), cisteína (0,2 mg / ml) e ADNase (250 U / ml) em fenol vermelho estéril contendo DPBS.
- Uma solução ovomucóide com albumina de soro bovino (BSA, 8 mg / ml), inibidor de tripsina de soja (8 mg / ml)) e DNase (250 U / ml) em fenol estéril contendo vermelho-DPBS.
Filtrar esterilizar ambas as soluções e ajustar o pH para retornar cor original de fenol contendo vermelho-DPBS.
- Preparar meios de cultura de células (NB / B27): complementar meio basal com piruvato de sódio 1 mM, 2 mM de L-glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina (P / S) e suplemento de B27. Filter esterilizar e proteger da luz. Equilibrar media a 37 ° C e 5% de CO 2 antes da sua utilização.
- Preparar tampão de FACS: 5% de soro fetal bovino (FBS) em DPBS. Adicionar 2,5 ml de FBS a 47,5 ml de DPBS.
- Prepare a poli-D-lisina (PDL) -Revestido lamelas.
- Autoclave novas lamelas de vidro.
- Revestir as lamelas com PDL (100 ug / ml em água destilada estéril) e incubar durante 2 horas a 37 ° C ou à temperatura ambiente durante a noite.
- Lavar lamelas com água destilada estéril. Lave uma vez com meio NB / B27. Vamos lamelas secar completamente no tecido de cultura capa antes de usar.
2 Dissecção e Preparação de fatias de tecido
- No dia da dissecção, limpe a área de dissecção com etanol e 70% de cobertura com um pano absorvente.
- Remover ferramentas de dissecção da bolsa de esterilização. Adicionar gelada, DPBS estéril / 1% P / S para uma pequena placa de Petri e colocar no gelo.
- Decapitaria P4 Math1-GFP / nestin-PCP filhotes de rato com grandes tesouras cirúrgicas em seguida, mantenha a cabeça para baixo com uma pinça curva finas. Retire a pele e descascar delicadamente fora o crânio com # 5 pinça fina, em seguida retire o cérebro do crânio utilizando uma espátula e transfira-o para a placa de Petri contendo DPBS / 1% P / S.
- Usando # 5 fórceps finos, cuidadosamente separar o cerebelo a partir do resto do cérebro. Certifique-se de dissecar um filhote de cada vez mais rápido possível.
- Recolha um mínimo de 8 cerebelo, a fim de obter NEPs suficientes para análises moleculares e funcionais.
- Encher um molde medindo a incorporação de 2 x 2 x 2 cm de altura com uma solução de agarose de baixo ponto de fusão de 3%. Certifique-se de que a temperatura de agarose é não mais do que 37 ° C.
- Retire o excesso de líquido do cerebelo, esfregando suavemente sobre um tecido de laboratório. Coloque cerebelo em molde na posição vertical. Coloque o molde em gelo para permitir que solidifique rapidamente. Use ~ 4 cerebelo por bloco.
- Obter licortes de tecido ving com uma lâmina vibratome vibrando. Apare contendo cerebelo bloco de agarose com uma lâmina de barbear. Cole o bloco de agarose para a placa com vibratome orientada na posição vertical, os cerebelos.
- Encha a bandeja do vibratome com geladas DPBS estéril / 1% P / S e local de gelo embaixo.
- Cortar 600 uM secções através de todo o comprimento do cerebelo. Colete seções da bandeja de gelo utilizando uma colher perfurada. Seções coloque em um prato de Petri cheia de DPBS / 1% P / S no gelo.
3. Microdissecção e dissociação celular
- Coloque a placa de Petri contendo fatias de tecido sob um microscópio de dissecação fluorescente.
- Cuidadosamente separar o EGL do resto da secção de cerebelar usando uma pinça fina dissecando entre o PCP + camada molecular e a GFP + EGL (referem-se a linha a tracejado na Figura 1). Ter cuidado para não incluir qualquer parte da camada molecular, o que irá resultar emcontaminação de expressando nestina Bergmann glia.
- Conclua esta etapa, tão rapidamente quanto possível e manter o tecido em gelo para evitar a morte celular.
- Retire a agarose em torno do tecido antes de prosseguir para a próxima etapa.
- Digerir o tecido EGL microdissecados utilizando um protocolo baseado em papaína como descrito previamente 2 para se obter uma suspensão de célula única.
- Re-suspender as células em tampão FACS para a coleta de células CFP-positivos através de FACS.
4 células de triagem e Galvanização
- Ordenação de células de fluorescência utilizando um PCP e de alta velocidade de fluxo estéril citómetro contendo um filtro apropriado PCP e recolher células em tampão de SCAF em gelo. Obter aproximadamente 100.000 NEPs de cada cerebelo P4.
- Células centrifugar a 300 xg por 5 min. Utilizar imediatamente células para análise molecular ou cultura para mais experimentação.
- Para células de cultura, re-suspender as células pré-aquecido NB / B27 mEDIA e placa em lamelas PDL-revestidos como descrito anteriormente 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Como mostrado na Figura 1A, as fatias de cerebelo foram preparadas a partir de P4 Math1-GFP / mice nestina-PCP, em que a EGL cerebelar foram dominados por PNB-expressando GFP e a camada molecular foi enriquecida por células gliais PCP-positivos. Para isolar NEPs que estão localizadas na parte profunda da EGL, fatias foram microdissecadas entre o EGL e a camada molecular (ao longo da linha tracejada, Figura 1A). GECV dissecado (Figura 1B) foram, em seguida, recolhido por dissociação enzimática seguido de FACS.
Como esperado, a maioria (mais do que 85%) de células da EGL dissecados foram PNB convencionais, as quais eram positivas para GFP (Figura 2A). NEPs conta (PCP +) para apenas cerca de 5% da população de células EGL. Quase nenhuma das células foram duplamente positivo para GFP e CFP, baseado na análise por FACS. PCP + células purificadas por FACS, foram cultivadas in vitro, para analisar o pote diferenciaçãontial. Como mostrado na Figura 2B, NEPs exclusivamente deu origem a β-tubulina + neurónios após 4 dias em cultura, sugerindo NEPs são progenitores neuronais de restrição de linhagem.
Por esse protocolo microdissecção, NEPs e PNB também foram purificados a partir do EGL da PTC cerebelo deficiente. Após transplante intracraniana, NEPs desenvolver MBs mais rapidamente em comparação com os PNB, indicando que NEPs são particularmente suscetíveis a transformação oncogênica 9.
Figura 1 Identificação da região de microdissecção EGL. Imagens fluorescentes da P4 Math1-GFP / animais nestina-PCP. (A) a expressão da GFP está localizado na EGL, enquanto a maioria de expressão PCP está localizado na camada molecular. Microdissecção foi feito ao longo de tele linha pontilhada amarela. (B) GECV foram coletadas para a dissociação de tecidos. Este valor foi modificado de Li et al 9.
Figura 2. NEPs representam uma pequena população de células da EGL e são progenitores neuronais de restrição de linhagem. (A) análise de citometria de fluxo de células isoladas a partir da PCP + microdissecados EGL. (B) NEPs foram cultivadas sob condições de diferenciação durante 4 dias e coradas para β-tubulina (vermelho) e contrastadas com DAPI (azul). Este valor foi modificado de Li et al. 9
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O método descrito aqui é microdissecção o primeiro procedimento capaz de isolar uma população pura de células vivas para utilização em análises moleculares e funcionais. Como demonstrado por Li et al. 9, NEPs obtidos por este método podem ser cultivadas e retomado em diferentes experiências e por causa do seu elevado grau de pureza, pode também ser utilizado para a análise de microarray.
É muito importante ter tempo para se tornar proficientes com esta técnica de microdissecção. NEPs estão localizados na região profunda do EGL em estreita proximidade com a camada molecular, em que expressam nestina Bergmann glia podem contaminar o isolamento de células de NEP e comprometer a pureza. Microdissecção deve ser feito de forma conservadora para fazer células contaminantes certeza no tecido adjacente não estão incluídos. A principal vantagem da técnica de microdissecção descritos aqui é a capacidade de obtenção de células vivas que podem ser cultivadas para further experimentação. Devido a isto, é essencial que todos os passos durante esse procedimento ser realizado rapidamente e que o tecido ser mantidos em gelo tanto quanto possível. Além disso, todos os instrumentos e reagentes devem ser estéreis. Seguindo esses passos irá reduzir a morte celular e contaminação dos cultivos celulares. Além disso, a montagem cerebelos múltiplo por bloco de agarose vai ajudar a reduzir o tempo de processo.
Esta técnica não é limitada ao isolamento de NEPs e pode ser utilizado para recolher células a partir de outras zonas do cerebelo, tais como células gliais da camada molecular e células estaminais neurais a partir de matéria branca. Ao lado do cerebelo, microdissecção podem ser utilizados com outros tecidos que contêm regiões conhecidas, tais como o hipocampo, por exemplo. O uso de transgenes fluorescentes, como utilizada aqui, pode auxiliar na criação de fronteiras ou identificar regiões de dissecação, o que pode ser especialmente útil em tecidos que não possuem áreas identificáveis facilmente e, de outra forma não ser capaz de ser microdissected. Esta técnica pode, por conseguinte, ajuda na purificação de células de uma ampla variedade de áreas de investigação e aplicações.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a James Oesterling para citometria de fluxo assistência. Esta pesquisa foi suportada por uma concessão do Instituto Nacional do Câncer (R01-CA178380, ZY) e uma bolsa de US National Institutes de Pós-Doutorado formação (5T32CA009035-37, Lwy).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| Ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
References
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-114 (1999).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
- Riobo, N. A., Manning, D. R. Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs. Biochem J. 403, 369-379 (2007).
- Dahmane, N., et al. The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis. Development. 128, 5201-5212 (2001).
- Marino, S. Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control. Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).
- Yang, Z. J., et al. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Sutter, R., et al. Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas. Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).
- Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells. J Neurosci. 14, 124-133 (1994).
- Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).
- Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Espina, V., et al.
