Summary
Progenitores nestina que expresan son una población recientemente identificado de progenitores neuronales en el cerebelo en desarrollo. Utilizando la técnica de microdisección se presenta aquí en combinación con la clasificación de células activadas por fluorescencia-, esta población de células puede purificarse sin contaminación de otras regiones del cerebelo y puede ser cultivado para estudios posteriores.
Abstract
Microdissection es una nueva técnica que puede aislar regiones específicas de un tejido y eliminar la contaminación de fuentes celulares en las zonas adyacentes. Este método fue utilizado por primera vez en el estudio de la expresión de nestina progenitoras (NEP), una población recientemente identificado de células en la capa germinal externa cerebelosa (EGL). Uso de microdisección en combinación con la clasificación de células fluorescentes activadas (FACS), una población pura de NEP se recogió por separado a partir de precursores neuronales de gránulos convencionales en la EGL y de otras células que expresan nestina contaminantes en el cerebelo. Sin microdisección, análisis funcionales de los PIJ no habría sido posible con los métodos actualmente disponibles, como la centrifugación en gradiente de Percoll y captura microdissection láser. Esta técnica también se puede aplicar para su uso con diversos tejidos que contienen cualquiera de las regiones reconocibles o células marcadas con fluorescencia. Lo más importante, una gran ventaja de este microdissectiotécnica n es que las células aisladas viven y pueden ser cultivadas para la experimentación, que en la actualidad no es posible con otros métodos descritos.
Introduction
El cerebelo se compone de múltiples capas de células, cada uno con distintos tipos de células. Durante el desarrollo, el EGL contiene la proliferación de precursores neuronales de gránulos (PNB), mientras que la capa molecular y la capa de Purkinje contienen neuronas Bergmann neuroglia y de Purkinje, respectivamente. En lo profundo de cerebelo se encuentra la sustancia blanca, que contiene células madre neurales (NSC) y oligodendrocitos 1.
Sonic hedgehog (Shh) juega un papel crítico en la regulación de desarrollo del cerebelo y, en particular, promueve la proliferación de PNB través de la unión a su receptor Patched (Ptc), un regulador negativo de la señalización de Shh 2-4. La activación aberrante de la señalización de Shh genera meduloblastoma (MB), el tumor cerebral maligno más común en los niños 5,6.
MB mutantes modelos de ratones transgénicos de PTC son herramientas poderosas para el estudio de la MB y se desarrollan los tumores se asemejan MB humana 7,8. El uso de estosratones, se descubrió que PNB son la célula de origen de hedgehog de tipo MB 7. Además, en adición a PNB, recientemente hemos identificado una población única de células progenitoras neuronales dentro de la EGL del cerebelo en desarrollo que también puede dar lugar a MB. Estas células expresan altos niveles de la proteína de filamentos intermedios VI tipo, Nestin, y se denominan NEP 9. NEP se encuentran dentro de la parte profunda de la EGL y existen transitoriamente sólo durante el desarrollo del cerebelo neonatal. Están comprometidos con el linaje de células granulares como PNB, pero son distintas, ya que son de reposo y no expresan Math1, un marcador bien establecido para la PNB convencionales 10. Además, NEP dan lugar a MB más eficientemente que PNB después de la activación de la vía de señalización Shh 9, lo que les una novela origen para MB tumorigénesis hace.
Se aislaron previamente NEPs del cerebelo EGL en el día postnatal 4 (P4) mediante la técnica de microdisección9 describe aquí. Microdisección mediante visualización microscópica directa del tejido permite la disección específica de la cerebelosa EGL. Esto es necesario ya Nestin también se expresa por NSC en la sustancia blanca del cerebelo y por glía de Bergmann en la capa molecular 1,7,11,12 y era fundamental que estas células no se incluirán, como lo harían confundir el análisis. Las células aisladas de tejido microdissected se pueden utilizar inmediatamente para el análisis molecular o pueden ser cultivadas para otras aplicaciones.
Para ayudar en microdissecting específicamente el EGL y para purificar aún más los NEP, los ratones Math1-GFP (proteína verde fluorescente) se cruzaron con ratones Nestin-PPC (proteína fluorescente cian). El factor de transcripción Math1 se expresa específicamente por PNB y la expresión de GFP es claramente visible en el EGL 9,13. Ratones Nestin-PPC expresan una forma nuclear de la PPC y se pueden visualizar fácilmente en la capa molecular 9,14. En conjunto, las buenas prácticas agrarias y la expresión PPC crean límites para microdisección del EGL (ver Figura 1). NEP CFP-positivas se aislaron por FACS, después de la disociación enzimática de las EGLS disecados.
Actualmente, el método más bien utilizada para aislar las células de la EGL es centrifugación en gradiente de Percoll de todo el tejido cerebelar 15,16. Este método, sin embargo, no es capaz de excluir completamente las poblaciones de células nestina + de la capa molecular y la materia blanca y por lo tanto no se puede utilizar para el estudio de NEP. Microdisección de captura por láser, que utiliza la transferencia de energía de láser para eliminar las células de interés, es otro método usado para aislar las células específicas dentro de un tejido heterogéneo 17,18 pero las células capturadas sólo se pueden utilizar para la recuperación de ADN, ARN y proteínas y no son capaces de cultivarse.
Este protocolo proporciona una forma de aislar específicamente una población pura vida de los PIJ de la EGL.Esta técnica también se puede aplicar a diferentes tipos de tejidos que tienen ya sea la arquitectura anatómica reconocible o células marcadas fluorescentemente / regiones. Por lo tanto, la principal ventaja de la incorporación de esta nueva técnica de microdisección en los protocolos de aislamiento de células es que las células pueden ser aisladas de regiones específicas de tejido para eliminar la contaminación de los tejidos vecinos y las células se pueden recoger inmediatamente para su análisis o se cultivaron durante otras aplicaciones.
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Protocol
El uso de animales en este protocolo se ha realizado de acuerdo con los procedimientos aprobados por el Comité del Centro de Cáncer de Cuidado de Animales y el empleo Fox Chase.
1. preparación de instrumentos, soluciones y Cubreobjetos
- Limpiar dos conjuntos de # 5 pinzas finas, un conjunto de # 7 pinzas curvas finas, una tijera quirúrgica grande, uno de tijera microdissecting, una espátula y una cuchara perforada. Coloque los instrumentos en una bolsa de esterilización autosellante y autoclave. Mantenga los instrumentos en la bolsa hasta que esté listo para su uso.
- Preparar una solución de agarosa de baja temperatura de fusión 3%.
- Añadir 1,5 g de agarosa en 50 ml de tampón fosfato salino estéril de Dulbecco (DPBS) y luego coloque en el microondas y el calor hasta que aparezcan burbujas. Frasco Remolino y recalentar hasta que todo agarosa ha disuelto. Mezclar la solución con una barra de agitación antes del calentamiento si aparecen grumos.
- Guarde la solución en un baño a 37 ° C hasta que se necesite.
- Para storag largo plazoe, almacenar la solución de agarosa para uso futuro a temperatura ambiente o a 4 ° C durante meses. Vuelva a calentar en el microondas para licuar. Para el calentamiento repetido de la solución de agarosa, se pesa el matraz antes de calentar para mantener su peso inicial con agua caliente destilada estéril.
- Preparar las siguientes soluciones para la disociación de células basados en papaína como se describió previamente 2:
- Una solución de papaína con papaína (100 U / ml), cisteína (0,2 mg / ml) y DNasa (250 U / ml) en fenol rojo-estéril que contiene DPBS.
- Una solución de ovomucoide con albúmina de suero bovino (BSA; 8 mg / ml), inhibidor de tripsina de soja (8 mg / ml)) y DNasa (250 U / ml) en fenol-estéril que contiene rojo DPBS.
Filtro esterilizar ambas soluciones y ajustar el pH a devolver el color original del fenol que contienen rojo DPBS.
- Preparar medios de cultivo celular (NB / B27): Suplemento medios basales con piruvato de sodio 1 mM, 2 mM L-glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina (P / S) y suplemento B27. Filter esterilizar y protegerlo de la luz. Equilibrar los medios de comunicación a 37 ° C y 5% de CO 2 antes de su uso.
- Preparar tampón FACS: suero bovino fetal al 5% (FBS) en DPBS. Añadir 2,5 ml de FBS al 47,5 ml de DPBS.
- Preparar poli-D-lisina (PDL) recubiertas con cubreobjetos.
- Nuevos cubreobjetos de vidrio autoclave.
- Escudo los cubreobjetos con PDL (100 ug / ml en agua destilada estéril) y se incuba durante 2 horas a 37 ° C o temperatura ambiente durante la noche.
- Lavado cubreobjetos con agua destilada estéril. Lavar una vez con medio NB / B27. Deje cubreobjetos se sequen por completo en el tejido campana de cultivo antes de su uso.
2. disección y preparación de cortes de tejido
- En el día de la disección, limpie la zona de disección con etanol al 70% y la cubierta con una almohadilla absorbente.
- Retire las herramientas de disección de la bolsa de esterilización. Añadir hielo frío, DPBS estériles / 1% P / S a una pequeña placa de Petri y el lugar en el hielo.
- Decapitate P4 Math1-GFP / Nestin-PPC crías de ratón con grandes tijeras quirúrgicas a continuación, mantenga la cabeza hacia abajo con pinzas curvas finas. Quite la piel y que despegar el cráneo con # 5 pinzas finas Después vacíe el cerebro del cráneo con una espátula y lo transfieren a la placa de Petri que contiene DPBS / 1% P / S.
- Usando unas pinzas finas # 5, separar cuidadosamente el cerebelo del resto del cerebro. Asegúrese de diseccionar una cría a la vez lo más rápidamente posible.
- Reunir un mínimo de 8 cerebelo con el fin de obtener suficientes NEP para los análisis moleculares y funcionales.
- Llenar un molde de inclusión de 2 x 2 x 2 cm con una solución de agarosa de baja temperatura de fusión 3%. Asegúrese de que la temperatura de agarosa es no más de 37 ° C.
- Retire el exceso de líquido del cerebelo frotando suavemente sobre un pañuelo de papel de laboratorio. Coloque cerebelo en el molde en una posición vertical. Colocar el molde en hielo para permitir que se solidifique rápidamente. Utilice ~ 4 cerebella por bloque.
- Obtener lisecciones de tejido ving con un vibratome cuchilla vibratoria. Recorte bloque de agarosa que contiene el cerebelo-con una hoja de afeitar. Pegar el bloque de agarosa a la placa de vibratome con orientado en una posición vertical cerebelo.
- Llenar la bandeja del vibratome con heladas DPBS estériles / 1% P / S y el lugar de hielo debajo.
- Cortar 600 micras secciones a través de toda la longitud del cerebelo. Recoge las secciones de la bandeja de hielo utilizando una cuchara perforada. Se colocan los cortes en una placa de Petri llena de DPBS / 1% P / S en el hielo.
3. Microdissection y disociación celular
- Coloque la placa de Petri que contiene cortes de tejido bajo un microscopio de disección fluorescente.
- Separar cuidadosamente el EGL del resto de la sección del cerebelo utilizando unas pinzas finas mediante la disección entre la PPC + capa molecular y la GFP + EGL (consulte la línea de puntos en la Figura 1). Tenga cuidado de no incluir ninguna parte de la capa molecular, que se traducirá encontaminación de Nestin-expresión de glía de Bergmann.
- Completar este paso lo más rápidamente posible y mantener el tejido en hielo para evitar la muerte celular.
- Retire la agarosa que rodea el tejido antes de proceder a la siguiente etapa.
- Digerir el tejido microdissected EGL utilizando un protocolo basado en papaína 2 como se describió previamente para obtener una suspensión de células individuales.
- Vuelva a suspender las células en tampón FACS para la recolección de células CFP-positivos mediante FACS.
4. Cell Sorting y Plating
- Ordenar células para PPC fluorescencia utilizando un flujo de alta velocidad de citómetro estéril que contiene un filtro de PPC apropiado y recoger las células en tampón de FACS en hielo. Obtener aproximadamente 100.000 NEPs de cada cerebelo P4.
- Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min. Utilice células inmediatamente para el análisis molecular o de cultivo para experimentación adicional.
- Para células de cultivo, vuelva a suspender las células en pre-calentado NB / B27 media y placa en cubreobjetos recubiertos-PDL como anteriormente descritos 2.
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Representative Results
Como se muestra en la Figura 1A, rebanadas del cerebelo se prepararon a partir P4 Math1-GFP / ratones Nestin-PPC, en el que el cerebelo EGL estaba dominado por PNB que expresan GFP y la capa molecular fue enriquecida por las células gliales CFP-positivas. Para aislar los PIJ que se encuentran en la parte profunda de la EGL, rebanadas se microdissected entre el EGL y la capa molecular (por la línea discontinua; Figura 1A). EGLS diseccionado (Figura 1B) se recogieron a continuación, para la disociación enzimática seguida por FACS.
Como era de esperar, la mayoría (más del 85%) de células en el EGL diseccionado eran PNB convencionales, que fueron positivas para GFP (Figura 2A). NEP (PPC +) representan sólo alrededor del 5% de la población de células EGL. Casi ninguna de las células fueron doble positivas para GFP y PPC basado en el análisis FACS. Células de la PPC + purificadas por FACS, se cultivaron in vitro para examinar la diferenciación potential. Como se muestra en la Figura 2B, NEP dio exclusivamente lugar a β-tubulina + neuronas después de 4 días de cultivo, los PIJ que sugieren son progenitoras neuronales linaje restringido.
Por este protocolo microdisección, NEP y PNB también se purificaron de la EGL de Ptc cerebelo deficiente. Tras el trasplante intracraneal, NEP MBs desarrollan más rápidamente en comparación con el PNB, lo que indica que los NEP son particularmente susceptibles a la transformación oncogénica 9.
Figura 1. Identificación de la región de EGL microdisección. Imágenes fluorescentes de P4 Math1-GFP / animales Nestin-PPC. (A) expresión de GFP se encuentra en el EGL, mientras que la mayoría de la expresión de la PPC se encuentra en la capa molecular. Microdissection se realizó a lo largo de tque la línea de puntos de color amarillo. (B) EGLS se recogieron para la disociación del tejido. Esta cifra ha sido modificado de Li et al 9.
Figura 2. NEP representan una pequeña población de células en el EGL y son progenitoras neuronales linaje restringido. (A) análisis de citometría de flujo de células de la PPC + aisladas de microdissected EGL. (B) NEP se cultivaron bajo condiciones de diferenciación durante 4 días y se tiñeron para β-tubulina (rojo) y se contratiñeron con DAPI (azul). Esta cifra ha sido modificado de Li et al. 9
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Discussion
El método de microdisección se describe aquí es el primer procedimiento capaz de aislar una población pura de células vivas para su uso en análisis moleculares y funcionales. Como se ha demostrado por Li et al. 9, NEP obtenidos por este método pueden ser cultivadas y se incorporan en diversos experimentos y debido a su alta pureza, también se pueden utilizar para el análisis de microarrays.
Es muy importante tomar el tiempo para alcanzar la competencia con esta técnica de microdisección. NEP se encuentran en la región profunda de la EGL en muy estrecha proximidad a la capa molecular, en el que Nestin-expresión de glía de Bergmann podría contaminar el aislamiento de células NEP y comprometer la pureza. Por lo tanto, Microdissection debe hacerse de manera conservadora para hacer células contaminantes seguro en el tejido adyacente no están incluidos. La principal ventaja de la técnica de microdisección se describe aquí es la capacidad de obtener células vivas que pueden ser cultivadas durante further experimentación. Debido a esto, es crucial que todos los pasos durante este procedimiento puede hacer rápidamente y que el tejido se mantuvieron en hielo tanto como sea posible. Además, todos los instrumentos y reactivos deben ser estériles. Sigue estos pasos se reducir la muerte celular y la contaminación del cultivo celular. Además, el montaje cerebella múltiple por bloque de agarosa ayudará en la reducción del tiempo del procedimiento.
Esta técnica no se limita al aislamiento de NEP y se puede utilizar para recoger las células de otras áreas del cerebelo, tales como células gliales de la capa molecular y las células madre neurales de la materia blanca. Al lado de la cerebelo, microdisección se puede utilizar con otros tejidos que contienen regiones reconocibles, tales como el hipocampo, por ejemplo. El uso de transgenes fluorescentes, como se utiliza aquí, puede ayudar en la creación de fronteras o identificar las regiones para la disección, lo que puede ser especialmente útil en los tejidos que carecen de áreas fácilmente identificables y, de otro modo que no pueda ser microdissected. Por tanto, esta técnica podría ayudar en la purificación de células en una amplia gama de áreas de investigación y aplicaciones.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a James Oesterling para citometría de flujo asistencia. Esta investigación fue apoyada por una subvención del Instituto Nacional del Cáncer (R01-CA178380, ZY) y una donación de US Nacional Institutos de formación postdoctoral (5T32CA009035-37, LWY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| Ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
References
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