Summary
La ricostituzione della proteina transmembrana, KvAP, in giganti vescicole unilamellari (GUVs) è dimostrato per due metodi di disidratazione, reidratazione - electroformation, e gonfiore gel assistita. In entrambi i metodi, piccole vescicole unilamellari contenenti la proteina sono fusi insieme per formare GUVs che possono poi essere studiate mediante microscopia a fluorescenza e patch-clamp elettrofisiologia.
Abstract
Giant unilamellari vescicole (GUVs) sono un popolare sistema biomimetico per studiare membrana fenomeni associati. Tuttavia, comunemente usato protocolli di crescere GUVs devono essere modificati in modo da formare GUVs contenenti proteine transmembrana funzionali. Questo articolo descrive due metodi disidratazione-reidratazione - electroformation e gonfiore gel assistita - per formare GUVs contenenti il canale del potassio voltaggio-dipendenti, KvAP. In entrambi i metodi, una soluzione di piccole vescicole unilamellari contenenti proteine è parzialmente disidratato per formare una pila di membrane, che viene poi lasciata rigonfiare in un buffer reidratazione. Per il metodo electroformation, il film si deposita sugli elettrodi di platino in modo che un campo AC può essere applicato durante pellicola reidratazione. Al contrario, il metodo gonfiore gel assistita utilizza un substrato gel di agarosio per migliorare pellicola reidratazione. Entrambi i metodi possono produrre GUVs in (ad esempio, 100 mm) concentrazioni basse (ad esempio, 5 mm) e fisiologici di sale. I GUVs risultanti sono caratterizzati tramite microscopia a fluorescenza, e la funzione di canali ricostituiti misurate utilizzando la configurazione patch-clamp dentro-fuori. Mentre rigonfiamento in presenza di un campo elettrico alternato (electroformation) fornisce un alto rendimento di GUVs esenti da difetti, il metodo gonfiore gel assistita produce una distribuzione più omogenea della proteina e non richiede attrezzature speciali.
Introduction
Quando si studiano i principi fisici che governano i sistemi viventi, approcci bottom-up permettono uno sperimentatore di controllare la composizione del sistema e altri parametri che non sono facilmente manipolabili in sistemi basati su celle 1. Per i processi basati membrana, Giant unilamellari vescicole (GUVs, diametro ~ 1-100 micron) hanno dimostrato di essere un sistema molto utile biomimetico 2-7 in quanto sono adatti per gli studi di microscopia e micromanipolazione 8-10. Mentre ci sono molti protocolli diversi per produrre GUVs, la maggior parte rientrano in due categorie - emulsione a base avvicina 11,12 e tecniche basate su reidratante un film lipidico 13-16. Nei metodi basati emulsione, i volantini interni ed esterni delle membrane GUV sono assemblati sequenzialmente da monostrati lipidici alle interfacce acqua / olio. Questo approccio è ideale per incapsulare proteine solubili connei GUVs, e per formare GUVs con asimmetrico composizione lipidica volantino. Tuttavia, GUVs formati da emulsioni possono conservano tracce di solvente che modificano le proprietà meccaniche della membrana 17, e l'approccio non è particolarmente adatto a trans-membrana proteica ricostituzione.
Metodi reidratazione Film basano sul fatto che l'essiccazione (disidratazione) provoca molti miscele lipidiche a formare una pila multi-lamellare membrane. Se questo stack viene poi messo in contatto con un tampone acquoso, membrane della pila si sposteranno flussi a parte come solventi tra loro e sulla superficie della pila, singoli membrane possono staccarsi per formare GUVs 13,18 (così un vero e proprio zoo altri oggetti lipidiche). Tuttavia, anche per il tampone e lipidi composizioni ottimali, questo classico metodo di "gonfiore spontaneo" ha una relativamente bassa resa di GUVs prive di difetti. Un metodo ampiamente utilizzato per aumentare la resa di GUVs privi di difetti è "electroformation221 ;, in cui si applica un campo di corrente alternata (AC) durante pellicola reidratazione. Mentre il meccanismo resta poco conosciuto, "electroformation" può dare rendimenti GUV spettacolari (> 90% in circostanze favorevoli) per i buffer di concentrazione bassa di sale (<5 mm) 14,19, e può anche lavorare in tamponi fisiologici (~ 100 mm) con una frequenza più alta (500 Hz versus 10 Hz) campo AC e elettrodi di platino 15. Un approccio alternativo per aumentare la resa di GUVs senza difetti è "gel assistita rigonfiamento", in cui la soluzione lipidica viene depositato su un substrato di gel polimerico piuttosto che passiva (ad esempio, di vetro, PTFE) substrati usati in classica "gonfiore spontanea ". Quando il film lipidico / gel risultante viene reidratato, GUVs possono rapidamente formare anche per i buffer fisiologici 16,20.
Tutti questi metodi possono produrre solo GUVs lipidi che possono essere utilizzati per studiare membrana associata fenomeni come lainterazione tra proteine solubili e le membrane. Tuttavia, a includere una proteina trans-membrana nella GUVs, sono necessarie modifiche significative per garantire che la proteina rimane in uno stato funzionale durante la procedura di ricostituzione. Mentre le soluzioni di lipidi in solventi organici (ad esempio, cloroformio, cicloesano) sono ideali per la produzione di film lipidici, proteine transmembrana sono tipicamente stabile solo quando la loro idrofoba dominio trans-membrana viene incorporato in un doppio strato lipidico, o circondato da una micella detergente ( ad esempio, durante la purificazione della proteina). Così, il materiale di partenza per una ricostituzione è tipicamente membrane native, proteina purificata in una soluzione detergente, o piccole vescicole contenenti proteine unilamellari (Proteo-SUV) e / o vescicole multi-lamellari (Proteo-MLV) formate da rimozione del detersivo nel presenza di lipidi. La maggior parte dei metodi per incorporare queste proteine di membrana in GUVs rientrano in tre categorie.
Diretta insertion: proteine transmembrana sospeso nel detergente viene mescolato con preformati, lipidi-solo, GUVs solubilizzate leggermente detergenti, e il detersivo poi rimosso utilizzando biobeads 21. Mentre concettualmente semplice, questo metodo richiede un controllo preciso della concentrazione di detersivo, come troppo alta concentrazione di detersivo può sciogliere i GUVs mentre una concentrazione troppo bassa può causare la proteina di dispiegarsi o aggregata.
GUV / Proteo-SUV Fusion: Proteine in Proteo-SUV è combinato con preformati, lipidi soli GUVs e la fusione è facilitata con particolari peptidi fusogeniche 22 o detersivo 21. In genere il grado di fusione è limited portando a GUVs a bassa densità di proteine.
Disidratazione / reidratazione: Un film lipidico contenente proteine è formata mediante disidratazione parziale di un proteo-SUV (o Proteo-MLV) e soluzione GUVs vengono poi coltivata come un film lipidico pura. La sfida è ovvio per proteggere la proteina durante la dehydrati parzialiil passo 23, ma il metodo è stato utilizzato con successo per la ricostituzione delle proteine trans-membrana, come batteriorodopsina, calcio-ATPasi, integrina e VDAC in GUVs 7,23 - 25.
Questo articolo descrive i protocolli disidratazione / reidratazione per rendere GUVs contenenti il canale del potassio voltaggio-dipendenti, KvAP, dalla iper-termofila Archaea, Aeropyrum PERNIX. KvAP ha un alto grado di omologia con i canali del potassio voltaggio dipendenti eucariotiche 26 e una struttura cristallina nota 27 , il che rende un buon modello per studiare il meccanismo di tensione gating. Produzione di Proteo-SUV è stato descritto nel dettaglio in precedenza e non è parte di questo tutorial 26,28,29. È importante sottolineare che, KvAP Proteo-SUV non devono essere prodotte per ogni preparazione GUV, in quanto possono essere memorizzati in piccoli (ad esempio, 10 ml) aliquote a -80 ° C per lunghi periodi di tempo (> 1 anno). Electroformationo gonfiore gel assistita può quindi essere utilizzato per far crescere GUVs dalle KvAP Proteo-SUV (o Proteo-MLV).
I passi fondamentali per il protocollo electroformation sono illustrati nella Figura 1. Goccioline di una soluzione di SUV contenenti la proteina si depositano sui fili di platino (mostrati nella Figura 2). Disidratazione parziale della sospensione SUV porta alla formazione di un film lipidico proteine mediante la fusione di SUV. Durante reidratazione, un campo AC viene applicata agli elettrodi per aiutare gli strati lipidici delaminazione e formare GUVs. Un campo 10 Hz funziona bene quando si usa "basso contenuto di sale" (<5 mm) buffer di reidratazione 28 e GUVs richiedere diverse ore a crescere. Al contrario, i buffer fisiologici (contenente ~ 100 mM sale) lavorare bene con una tensione più bassa, 500 Hz campo AC ma richiedono un prolungato (~ 12 ore) gonfiore periodo 15. Questo metodo si basa su un protocollo precedente utilizzando ITO vetrini 24, ma utilizza una camera di cont personalizzatoaining due fili di platino, come illustrato nella figura 2 (vedi la discussione per i dettagli di design e suggerimenti per semplificare, camere improvvisato).
La figura 3 illustra il metodo di soffiatura gel assistita. Il protocollo funziona bene con tamponi con concentrazioni saline fisiologiche, è rapido, e produce GUVs con una distribuzione più omogenea della proteina. Tuttavia, il rendimento di isolati, GUVs apparentemente difetto liberi (cioè, la membrana GUV è uniforme a lunghezza-righe ottiche e non racchiude oggetti) è inferiore, anche se fornisce un numero sufficiente di patch-clamp ed esperimenti micro-manipolazione . Questo metodo è basato su un protocollo utilizzando gel di agarosio per produrre solo lipidi GUVs 16 e richiede attrezzature meno specializzata rispetto al metodo electroformation.
La caratterizzazione dei GUVs con microscopia a fluorescenza è descritto, così come procedure utilizzando uno standard patch-clamp set-up dimisurare l'attività KvAP in "inside-out" escisse patch di membrana.
Growing GUVs contenenti proteine può essere più difficile che GUVs solo lipidi. In particolare, la resa finale può dipendere GUV sensibilmente esattamente come la soluzione SUV viene deposto e disidratato per formare la pila membrana. Per qualcuno senza alcuna precedente esperienza con GUVs, può essere utile a crescere prima GUVs solo lipidi seguendo un protocollo convenzionale 15,16 in cui il film membrana è formata depositando lipidi da un solvente organico. Una volta che il protocollo tradizionale funziona bene, SUV deposizione e disidratazione parziale possono essere masterizzati utilizzando SUV solo lipidi, che sono anche molto utile quando si regola il protocollo per una nuova composizione lipidica. Quando GUVs crescono in modo affidabile da SUV solo lipidi, è quindi solo un piccolo passo per la produzione di proteine contenenti GUVs da Proteo-SUV.
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Protocol
1. Soluzione Preparazione
- Preparare 5 ml di 'tampone SUV' contenente KCl 5 mM, 1 mM HEPES (pH 7,4) o TRIS (pH 7,5), e trealosio mM 2. Filtrare il buffer con un filtro a siringa da 0,2 micron e dividere in 1 ml di aliquote che possono essere conservati a -20 ° C.
NOTA: Per ulteriori dettagli per reagenti e strumenti sono riportati nella lista dei materiali. - Preparare 40 ml di 'Buffer Growth' GUV che riempirà il GUV interno durante pellicola reidratazione. Per una crescita 'bassa percentuale di sale', unire 5 mM KCl, 1 HEPES mM (pH 7,4) o 1 TRIS mM (pH 7,5), e ~ saccarosio 400 mm. Per una crescita 'salina fisiologica', combinare KCl 100 mM, HEPES 5 mM (pH 7,4) o 5 mM TRIS (pH 7,5), e ~ saccarosio 200 mM.
- Preparare 40 ml di 'osservazione Buffer' per la soluzione esterna nella camera sperimentale combinando KCl 100 mM, HEPES 5 mM (pH 7,4) o 5 mM TRIS (pH 7,5), e ~ 200 mM di glucosio.
NOTA: Questi buffer sono solo examples. Vedere la discussione di adeguare i buffer per altri esperimenti. - Misurare le osmolarities dei buffer di crescita e di osservazione con un osmometer. Aggiungere granuli di saccarosio o glucosio per abbinarli a entro 1% in modo che GUVs non lisi o comprimere quando trasferito dalla camera di crescita per la camera di osservazione.
NOTA: In questo intervallo di concentrazione, aggiungendo 1 mM di saccarosio (13,7 mg per 40 ml) o di glucosio (7,2 mg per 40 ml) aumenta osmolarità da ~ 1 mOsm. - Filtrare i buffer di crescita e di osservazione con un filtro da 0,2 micron e conservare a 4 ° C per inibire la crescita batterica.
- Sciogliere 50 mg di beta-caseina in 10 ml di 20 mM TRIS (pH 7,5) buffer per formare una soluzione di beta-caseina 5 mg / ml necessario per passivare le superfici delle camere sperimentali in modo che non si attacchino GUVs, diffondono e scoppio. Una volta che la beta-caseina è completamente sciolto (fino a diverse ore a 4 ° C), il filtro (0,2 micron) in 0,5 ml aliquote che può essere istantaneo congelato e conservatoa -20 ° C per un uso successivo (aliquote scongelati conservati a 4 ° C in genere può essere utilizzato per un massimo di un 1 settimana).
2. SUV Preparazione
- Preparare e congelare aliquote di Proteo-SUV seguito il protocollo dettagliato pubblicato in precedenza 28. Utilizzare KvAP fluorescente con Alexa-488 maleimmide, ricostituito in DPhPC SUV (10 mg / ml) ad una proteina rapporto lipidi di 1:10 (massa).
NOTA: Wild-tipo KvAP contiene una cisteina per monomero situato vicino al C-terminale intracellulare (aminoacidi 247). - Fluorescenti, solo lipidi-SUV:
NOTA: Maneggiare cloroformio sotto una cappa di indossare guanti di nitrile e occhiali di sicurezza. Evitare l'uso di qualsiasi plastica come cloroformio possa dissolversi. Le soluzioni cloroformio possono essere conservate in flaconi di vetro ambrato con tappi in teflon e trasferiti tramite siringhe di vetro. Fare attenzione a lavare la vetreria almeno 5 a 10 volte con cloroformio prima e dopo pipettaggio lipidi.- Preparare 100 ml di10 SUV mg / ml DPhPC contenenti 0,5 moli% del lipide fluorescente rossa, Texas Red-DHPE, mescolando 100 ml di soluzione DPhPC (10 mg / ml in cloroformio) con 8,2 ml di soluzione di Texas Red-DHPE (1 mg / ml in metanolo) in una fiala di vetro da 1,5 ml ambra.
- Essiccare i lipidi sotto un flusso di azoto in una cappa chimica durante la rotazione della fiala. Quando il film appare asciutto, i lipidi sotto vuoto per 3 ore per rimuovere qualsiasi solvente residuo.
- Aggiungere 100 ml di buffer di SUV per i lipidi, e vortice vigorosamente fino a quando non lipidico rimane attaccato alle pareti del flaconcino e la soluzione è uniformemente lattiginoso.
- Sonicare la soluzione lipidica per formare SUV. Regolare la posizione di flaconcino fino ultrasuoni provoca la maggior parte dei movimenti e il flusso all'interno del flacone, e fare attenzione a non riscaldare la soluzione inutilmente. Continuare sonicazione finché la soluzione diventa trasparente, o quando possibile, trasparente (2-5 min per la punta sonicazione, ~ 20 min per il bagno sonicazione).
- Aliquot SUV (ad esempio, 10 microlitri o 20 microlitri) e congelamento (-20 ° C) per un uso successivo.
NOTA: Lipidi, in particolare lipidi insaturi, può facilmente ripartizione. Solutions Store lipidiche a 20 ° C (o 80 ° C) sotto argon e utilizzare entro 6 mesi. Prodotti di degradazione lipidi possono essere rilevati con cromatografia su strato sottile.
3. GUV crescita da Electroformation
- Preparare la camera electroformation.
- Se la camera non è stata pulita, rimuovere le finestre, pulire tutto sigillante e grasso, estrarre i cavi, e risciacquare e macchia la camera con un tessuto con acqua ed etanolo (≥70%) alternativamente.
- Rub i fili ben, immergere i fili e camera in acetone e ultrasuoni per 5 min. Pulire il tutto con un panno di nuovo con acetone. Mettere la camera in etanolo ed ultrasuoni per 5 min.
- Montare la camera inserendo i fili attraverso i fori, e ruotare e pulire i fili per assicurarsi che are pulito. Mettere la camera in acqua distillata, con ultrasuoni per 5 min e asciugare la camera con un flusso di azoto o aria.
- Preparare 30 ml di 3 mg / sospensioni SUV ml in tampone SUV. Per formare GUVs contenenti proteine, combinare 8 ml di Proteo-SUV (DPhPC 10 mg / ml KvAP 1,10), 2 ml di SUV fluorescenti (10 mg / ml DPhPC, 0.5 mol% TexasRed-DHPE) e 20 ml di SUV buffer in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga per una proteina finale lipidi (massa) rapporto di 1: 12,5 e 0,1 moli% TexasRed-DHPE. Mescolare la soluzione vigorosamente.
- In alternativa, a praticare il protocollo con lipidi solo SUV, semplicemente unire 10 ml di SUV fluorescenti (10 mg / ml DPhPC e 0,5 mol% TexasRed-DHPE) con tampone SUV 20 microlitri.
- Depositare la soluzione SUV.
- Utilizzare una pipetta 2 microlitri o 5 microlitri siringa di vetro depositare piccole (<0,2 microlitri) gocce della soluzione SUV sui fili. Circa è necessario 1 ml di soluzione per formare una serie di gocce lungo1 cm di filo. Assicurarsi che le gocce sono abbastanza piccoli e una distanza tra loro che non si tocchino o il fusibile.
- Lasciate che i SUV depositati asciugare per ~ 30 minuti all'aria aperta. Quando tutte le gocce sono insediati, ruotare il filo in modo depositi lipidici sono più facili da osservare con il microscopio.
NOTA: Se i SUV non si asciugano abbastanza, si può solo lavare i fili quando si aggiunge il buffer di crescita, mentre l'essiccazione troppo può danneggiare la proteina. Perché l'umidità dell'aria influenza la velocità di asciugatura, il tempo di asciugatura e / o umidità dell'aria può essere regolata per ottenere risultati ottimali 30. Il film lipidico sui fili dovrebbe essere visibili al microscopio.
- Montare la camera.
- Sigillare il fondo della camera: utilizzare una siringa per applicare grasso per vuoto al fondo della camera intorno ai tre pozzi e premere 40 x 22mm coprioggetto delicatamente contro di essa per sigillare il fondo della camera in modo che aderisca senza fessure. Sigillare le pareti della camera in cui l'uscita (fili) conpasta di tenuta. Applicare grasso per vuoto sulla parte superiore della camera di delineare i tre pozzi.
- Lentamente aggiungere buffer di crescita fino a quando ogni bene è riempito al top. Evitare qualsiasi movimento rapido della soluzione nei pozzetti come questo può togliere il film lipidico fuori gli elettrodi.
- Chiudere la camera premendo il coperchio slitta superiore delicatamente sul grasso, facendo attenzione a non spostare il coprioggetto fondo. Utilizzare un tessuto per rimuovere eventuali gocce di tampone ai bordi del coperchio superiore di slittamento.
NOTA: Questo è un buon momento per esaminare la camera al microscopio per confermare che il film lipidico è rimasto sui fili.
- Collegare il generatore di segnale per i cavi utilizzando due morsetti a coccodrillo. Impostare la frequenza (10 Hz / 500 Hz onda sinusoidale per il buffer di sale basso / alto) e utilizzare un multimetro per misurare e regolare la tensione attraverso i fili di 0,7 / 0,35 V radice quadrata (Vrms) per il buffer di sale bassa / alta media. Coprire la camera con un foglio di alluminio per proteggere i fluorofori dalla luce. Lascia tegli GUVs a crescere da 2 a 3 ore per il buffer di sale basso, e 12 ore o O / N per il buffer di sale.
- Scollegare la camera dal generatore e con attenzione posizionarlo su un microscopio invertito per valutare la crescita GUV. Usa movimenti lenti e costanti o il flusso di liquido nei pozzetti possono staccarsi prematuramente GUVs dai fili.
NOTA: GUVs sui bordi di filo sono di solito visibili in contrasto di fase (40X obiettivo lunga distanza di lavoro), mentre GUVs ovunque nella metà inferiore dei fili può essere visto con epifluorescenza. Se non GUVs sono visibili, provare a ruotare i fili di guardare la superficie superiore. GUVs possono essere conservati a 4 ° C in una camera di crescita per diversi giorni.
4. GUV crescita da gonfiore Gel-assistita
- Preparare 10 ml di una soluzione di agarosio 1% mescolando 100 mg di agarosio con 10 ml di acqua pura. Riscaldare fino ad ebollizione ponendolo in un forno a microonde a 480 W per ~ 20 sec. Mescolare per assicurarsi che il agarosio è completamente sciolto.
NOTA: La soluzionepuò essere conservato a 4 ° C e riscaldato quando necessario. - Plasma-pulito (plasma ad aria) una copertura scorrevole per 1 min in modo che la soluzione di agarosio si diffonda bene su di esso. Utilizzare il coperchio-diapositive entro i prossimi 15 minuti, come l'effetto di pulizia al plasma svanisce rapidamente.
- Applicare 200 microlitri di soluzione di agarosio calda per ogni 22 x 22 mm 2 scorrimento per cui la soluzione bagna l'intera superficie. Inclinare la slitta verticale e toccare il bordo inferiore di un tessuto per rimuovere il liquido in eccesso e lasciare solo uno strato liscio sottile di agarosio sul vetrino.
- Posizionare il vetrino su una piastra calda o forno a 60 ° C e lasciare asciugare per almeno 30 minuti. Il film agarosio è difficilmente visibile a occhio. Dopo i vetrini raffreddare a RT, utilizzarli immediatamente, o memorizzarli fino ad una settimana in un contenitore chiuso a 4 ° C.
- Posizionare il vetrino agarosio rivestite in un piatto di serie 3,5 centimetri Petri.
- Preparare la soluzione SUV come nella sezione 3.2 e applicare ~ 15 ml di soluzione di SUV (3 mg / ml lipidi) in~ 30 piccolissime gocce delicatamente sulla superficie agarosio. Fare attenzione a non alterare lo strato di agarosio troppo.
- Posizionare il vetrino sotto leggera corrente di azoto per circa 10-15 min e seguire l'evaporazione del buffer occhio come goccioline asciugare.
- Non appena le SUV sono asciugati, aggiungere buffer di crescita per coprire la superficie di scorrimento. Per un piccolo 3,5 centimetri Petri dish uso ~ 1 ml di tampone.
- Lasciare che il gonfiore di procedere per ~ 30 minuti, e poi esaminare la crescita del GUVs nella camera utilizzando un microscopio invertito con contrasto di fase o differenziale contrasto interferenziale (DIC).
NOTA: osservazione epifluorescenza è difficile a causa della forte background di fluorofori nel gel e l'auto-fluorescenza del agarosio.
5. Raccolta e Observing GUVs
- Passivare la camera di osservazione (ad esempio, piccola scatola di Petri o vetrino di vetro) in modo che non si attacchino GUVs, diffondere e scoppiò sul fondo della camera. Coprire il chamber fondo con soluzione di beta-caseina, incubare per 5 min, sciacquare la soluzione di caseina con acqua pura, secco con una corrente di aria o azoto, e infine aggiungere buffer di osservazione (ad esempio, ~ 5 mm di profondità in una piccola capsula di Petri).
- Raccogliere le GUVs. Tagliare la fine di un 100 puntali delle pipette microlitri modo che l'apertura è più grande (~ 2 mm di diametro), e aspirare lentamente la sollecitazione di taglio di pipettaggio può facilmente distruggere GUVs.
- Per GUVs elettro-formato, aprire la camera di crescita rimuovendo delicatamente il vetrino superiore. Posizionare la punta della pipetta direttamente sopra ogni filo e aspirare ~ 50 ml mentre si muove la punta della pipetta lungo il filo per staccare i GUVs.
NOTA: Può essere utile per ruotare il filo di raccogliere GUVs sul "dall'altra parte" del filo. - Per GUVs "gel assistita gonfiore", prima toccare il lato della capsula di Petri un paio di volte per aiutare i GUVs staccano dalla superficie coprioggetto. Posizionare il puntale appena sopra il vetrino e aspirare 50 ml mentre pulling la punta di nuovo sulla superficie. Direttamente trasferire GUVs raccolte ad una camera di osservazione, o conservare in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga a 4 ° C per 1 settimana.
- Per GUVs elettro-formato, aprire la camera di crescita rimuovendo delicatamente il vetrino superiore. Posizionare la punta della pipetta direttamente sopra ogni filo e aspirare ~ 50 ml mentre si muove la punta della pipetta lungo il filo per staccare i GUVs.
- Posizionare la camera di osservazione su un microscopio invertito, aggiungere i GUVs alla camera di osservazione, e attendere alcuni minuti per i GUVs di stabilirsi sul fondo della camera.
- Indagine la camera con contrasto di fase o DIC per individuare rapidamente lisci, sferici («difetto liberi") "candidati GUV". Esaminare ogni "GUV candidato" in epifluorescenza per escludere eventuali contenenti liposomi minori annidati dentro. Infine, verificare che l'intensità di fluorescenza lipidica è uniforme e compatibile con una sola membrana (cioè, unilamellare).
NOTA: In alcuni bilamellar (o multi-lamellari) vescicole, le membrane sono troppo vicini per essere risolti in modo che appaiono unilamellare in contrasto di fase o immagini DIC. Tuttavia, questi oggetti possono essere distinti da UNILAME realeGUVs Llar di loro fluorescenza dei lipidi, che è due volte (o più) più brillanti.
6. GUVs-Patch di serraggio
- Fai pipette di patch con un 1-2 micron punta di diametro in vetro borosilicato capillare standard utilizzando il programma consigliato per l'estrattore pipetta.
NOTA: trattamenti speciali come lucidatura fuoco non sono necessari, e pipette possono essere utilizzati per diversi giorni dopo che sono stati tirati se sono tenuti in una scatola chiusa. - Passivare la camera di incubazione con una soluzione di beta-caseina (5 mg / ml) per garantire che non aderiscono GUVs, diffondono e rottura sulle superfici della camera. Risciacquare la caseina dopo 5 min.
- Inserire l'elettrodo di terra, riempire la camera con il tampone di osservazione, trasferire 10 ml di sospensione GUV come descritto al punto 5.2 e 5.3, e attendere alcuni minuti per i GUVs di stabilirsi sul fondo.
- Riempire una pipetta di patch fresco con la soluzione (tampone di osservazione o un'altra soluzione iso-osmotica) emontarlo dell'amplificatore headstage patch-clamp.
- Ricerca attraverso la camera di individuare un GUV "senza difetti", come descritto nella sezione 5.4, e controllare che contiene la proteina fluorescente.
- Applicare una costante pressione positiva (> 100 Pa, o circa 1 cm H 2 O in un manometro) per mantenere la pipetta di patch interno pulito, e inserire la pipetta di patch nella camera. Portare la pipetta di patch nel campo di vista, applicare impulsi di prova per misurare / risarcire l'offset e la resistenza di tensione pipetta, ed esaminare la pipetta sotto illuminazione fluorescente per confermare che la punta è pulito.
- Portare la pipetta di patch verso il GUV, e se necessario, ridurre simultaneamente la pressione positiva in modo che il flusso verso l'esterno dalla pipetta di patch non rende il GUV "scappare". Quando la pipetta patch è vicino alla GUV, applicare una pressione negativa (fino a 5 cm H 2 O) per tirare la GUV contro la pipetta patch. Monitorare la resistenza come ", La lingua "della membrana GUV entra nella pipetta di patch e le forme gigaseal.
- Se un gigaseal non formano, rimuovere la pipetta di patch dalla camera e tornare al punto 6.4. Se la patch di membrana formato un gigaseal, ma il GUV rimane attaccato alla pipetta, asportare la patch tirando dalla GUV, scoppiando il GUV contro il fondo della camera, o brevemente spostare la pipetta dalla soluzione.
- Quando la patch membrana inside-out è stato asportato dal GUV e gigaseal è stabile, spegnere gli impulsi di prova e applicare un protocollo di tensione come quello mostrato in Figura 13.
NOTA: Figura 13 segue la convenzione elettrofisiologico standard per una patch inside-out in cui la corrente che scorre nel patch-elettrodo è "positivo", e bagno V = V - V pipetta. Tenendo la patch ad un potenziale negativo (ad esempio, V = -100 mV) per ~ 30 secondi posti KvAP in stato di riposo, mentre passi (100 msec a 5 sec) a potenziali più positivi (ad esempio, V = 100 mV) può quindi guidare in conduttivi (cioè, aperti) stati attivi. - Dopo misurazioni su un cerotto membrana sono finiti, rompere la patch con un impulso zapping o pressione e verificare che l'offset dell'elettrodo cerotto tensione non è spostata. Rimuovere la pipetta di patch dalla camera, e tornare al punto 6.4.
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Representative Results
La crescita di GUVs può essere rapidamente valutata esaminando la camera di crescita al microscopio. Per electroformation, i GUVs tendono a crescere in grappoli lungo i fili di platino, come mostrato in Figura 4. Durante gonfiore gel assistita, GUVs appaiono come strutture sferiche che crescono rapidamente e si fondono insieme (Figura 5).
GUVs senza difetti sono più facilmente individuati e valutati dopo il trasferimento ad una camera di osservazione. Misurazioni di calibrazione sono necessari per valutare con rigore la qualità GUV, e una quantificazione sistematica è stato pubblicato in precedenza 28. Tuttavia, come guida empirica, "buoni" GUVs devono essere isolati (cioè non in un cluster), avere un unico, liscio, membrana esterna sferica, non contengono oggetti (ad esempio, tubi, vescicole nidificate, ecc) all'interno, e avere il livello di lipidi di fluorescenza "standard" (oggetti luminosi sono tipicamente bi- o multi-lamellare). Figura 6 mostra DIC e epifluorescenza immagini di un GUV 'senza difetti' dopo il trasferimento ad una soluzione di glucosio iso-osmotica. Il contrasto DIC è dovuto alla differenza di densità ottica tra il saccarosio riempito GUV e la soluzione del bagno contenente glucosio. L'indice di rifrazione di contrasto KvAP contenenti GUVs diminuisce spesso nel tempo, anche se KvAP stesso non deve essere permeabile al saccarosio o glucosio. La proteina di fluorescenza uniforme nella membrana GUV conferma che KvAP è incorporato nella GUV (cioè, non è rimasto nel film lipidico) e non ha formato micron scala (o più) aggregati.
Le figure 7, 8 e 9 mostrano immagini confocali di lipidi e proteine fluorescenza da GUVs prodotte dal protocollo inferiore sale electroformation, fisiologico protocollo electroformation sale, e il protocollo gonfiore gel assistita. I lipidi fluorescenti (magenta) e proteine(Verde) i segnali sono stati ridimensionati per la stessa intensità media, in modo che GUVs con un basso / alto numero di proteine per unità di superficie (densità di proteine) hanno un magenta / verde ombra nelle immagini sovrapposte (colonna di destra), mentre GUVs con un densità media di proteine sono bianchi. Isolamento, GUVs senza difetti sono stati identificati e la distribuzione dimensionale GUV è mostrato in Figura 10. Tipicamente electroformation produce più GUVs privi di difetti di gonfiore gel assistita, ma i prodotti da GUVs electroformation sono più piccoli. Figura 11 mostra la distribuzione della densità proteine inferito dalla fluorescenza dei GUVs. Electroformation con tampone alto contenuto di sale produce GUVs in cui la densità di proteine varia notevolmente da GUV a Guv. La densità delle singole proteine GUVs varia molto meno per electroformation con tampone di sale basso, mentre la densità di proteine di GUVs prodotte da gonfiore gel-assistita è notevolmente uniforme.
La tecnica del patch-clamp è ampiamente usoMetodo d per lo studio della funzione dei canali ionici voltaggio-dipendenti, come KvAP. In registrazioni "inside-out", un bicchiere "patch" pipetta pulita viene utilizzato per asportare una patch di membrana da un GUV. Un elettrodo all'interno della pipetta patch viene quindi utilizzato per applicare tensione, e misurare la corrente risultante passa attraverso la patch membrana. La composizione della patch membrana può differire notevolmente dal resto della cellula / GUV 31, ma la configurazione "inside-out" è ancora molto utile per misurare la conduttanza di singolo canale, selettività ionica, e gating voltaggio-dipendenti. Queste tre proprietà sono un ottimo modo per stabilire che le correnti non sono dovute ad artefatti (ad esempio, problemi gigaseal) o contaminanti (ad esempio, il Porins batteriche dalla depurazione), e ci sono canali KvAP funzionali nel GUVs.
Conduttanza canale è più facilmente misurata in patch con solo uno o due canali attivi. Nel example mostrato nella Figura 12, aperture dei canali sono osservate quando la membrana viene mantenuta a -100 mV, mentre a +100 mV, aperture dei canali individuali possono essere chiaramente risolti. L'istogramma attuale mostra due picchi corrispondenti al chiuso e lo stato di apertura e dotandoli di una doppia funzione Gaussiana produce un singolo canale corrente di 10,9 ± 0,85 pA, corrispondente ad una conduttanza di 109,2 ± 8,5 pS (in KCl 100 mM). Si noti che la conduttanza di singolo canale dipende dalla soluzione (concentrazione di potassio in particolare) e la composizione di membrana 32,33.
Come molti altri K-canali, singoli canali KvAP mostra "chattering" esplosioni di aperture e chiusure rapide. Come dimostrato in precedenza, selettività potassio può essere testato utilizzando una diversa soluzione in pipetta patch (ad esempio, soluzione cerotto pipetta 90 mM NaCl, KCl 10 mM) 28.
Gating Voltage-dipendente è spesso studied in patch con più canali, in modo da ottenere più facilmente una media insieme. Mentre non vi è alcun meccanismo evidente favorire la fisiologica (dominio intracellulare su GUV interni) e inversa (dominio intracellulare sul GUV esterni) inserimento di KvAP in GUVs, a chiazze di membrana "inside-out" la maggior parte dei canali funzionali hanno la " fisiologica "inserimento 28. Figura 13 mostra la risposta di una patch membrana contenente multipli (> 10) canali a una serie di 5 secondi passaggi depolarizzanti. Tra ogni passo, la patch viene mantenuto a -100 mV per 30 secondi per permettere canali con l'inserimento "fisiologica" per tornare al loro stato di riposo. Quando il potenziale è sufficientemente negativo (ad esempio, V <-60 mV) la maggior parte della corrente è dovuto alla perdita gigaseal, e le aperture occasionali di uno o due canali che possono avere l'inserimento "inversa". Per la procedura di pote più positivontials, un numero crescente di canali sono osservate finché non ci sono così tanti che le singole aperture e chiusure non possono più essere risolti. Pertanto, la probabilità di apertura del canale è chiaramente voltaggio-dipendenti. La cinetica di attivazione e disattivazione KvAP differiscono notevolmente tra neri lipidi membrane (BLM) 26 e GUVs, ma questo è in linea con le precedenti relazioni che Kv gating canale può essere sensibile alla composizione della membrana e lo stato 34.
Figura 1. GUV Electroformation schematica:. Goccioline contenenti SUV sono depositati su un elettrodo disidratazione parziale della soluzione provoca SUV per fondono per formare una pila di membrane. Buffer viene quindi aggiunta e un campo elettrico AC applicata. Come le onde del cinema, i singoli membrane staccano dalla pila a formare GUVs. (Questa cifra è stata mod ified da Aimon et al. 28)
Figura 2. GUV Electroformation Camera. La camera viene fresato da un PTFE-blocco con tre pozzi (diametro 10 mm, 5 mm di profondità). Due fili di diametro 0,5 millimetri platino sono separati da 3 mm (distanza da bordo a bordo) e sono posizionati in prossimità del fondo della camera di facilitare l'imaging dei fili. Scivola copertura inferiore e superiore sono tenuti in posizione con grasso per vuoto, e pasta di tenuta impedisce eventuali perdite dai fori filo sul lato. Il generatore di corrente alternata è collegato con coccodrilli ai fili. La camera si basa su quello sviluppato da Ernesto Ambroggio e Luis Bagatolli. (Questa cifra è stata modificata da Aimon et al. 28)
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Figura 3. Gel-assistita spontaneo gonfiore schematica: Goccioline contenenti una sospensione SUV sono depositati su un gel di agarosio come la gocciolina disidrata, le SUV fondono per formare un film lipidico.. Quando viene aggiunto il buffer di crescita, il film reidrata e GUVs formano in superficie. GUVs crescono a una dimensione di circa 10 micron da gonfiore e fusione con GUVs limitrofi.
Figura 4. Immagine rappresentativa della GUVs DPhPC contenenti KvAP crescente sul filo di platino in un buffer di sale. Le GUVs assomigliano grappoli lungo il filo. Fase immagine Contrasto utilizzando un obiettivo 40X LWD. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. GUVs DPhPC contenenti KvAP gonfiore su gel di agarosio. Le GUVs sono visibili come deboli sfere con un diametro di circa 10 micron. Le macchie scure / luminosi sono aggregati agarosio / lipidi da cui le vescicole si gonfiano. Immagine a contrasto di fase con l'obiettivo 40X LWD. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Immagini di un GUV senza difetti. (Egg-PC: Egg-PA 9: 1 in massa) contenenti KvAP marcato con Alexa-488 di sinistra: DIC, destro: Alexa-488 epifluorescenza. Eccitazione: 470/50 nm, emissione: 545/75 nm. Nota la fluorescenza uniforme da KvAP senza aggregati visibili. 81fig6large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7. immagini confocale di lipidi (magenta) e proteine (verde) di fluorescenza da GUVs elettroformati coltivate in un buffer di sale bassa (Egg-PC: Egg-PA 9: 1 in massa) (A) Il marchio di frecce bianche (probabile). GUVs, mentre la freccia rossa indica una vescicola potenzialmente bi-lamellare con una maggiore fluorescenza dei lipidi. Si noti che l'intensità di fluorescenza è più luminoso nel centro di questa immagine a causa della estremamente grande campo visivo. (B) Zoom che mostra un piccolo gruppo di GUVs. Sinistra (magenta): TexasRed-DHPE di eccitazione: linea laser 543 nm, emissione: 605/70 nm. Center (verde): KvAP marcato con Alexa-488 di eccitazione: linea laser 488 nm, emissione: 515/30 nm. Destra: overlay.OAD / 52281 / 52281fig7large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 8. immagini confocale di lipidi (magenta) e proteine (verde) di fluorescenza da GUVs elettroformati coltivate in concentrazione salina fisiologica (Egg-PC: Egg-PA 9: 1 in massa). (A) I GUVs (frecce bianche indicano probabile unilamellare esempi) sono più radi rispetto al protocollo basso contenuto di sale e possono avere molto diverse concentrazioni di proteine (freccia rossa). (B) Zoom che mostra un piccolo gruppo di GUVs. Sinistra (magenta): TexasRed-DHPE di eccitazione: linea laser 543 nm, emissione: 605/70 nm centrale (verde): KvAP marcato con Alexa-488 di eccitazione: linea laser 488 nm, emissione: 515/30 nm. A destra:. Overlay prega di cleccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 9. confocale immagine di lipidi (magenta) e proteine (verde) di fluorescenza di GUVs (DPhPC) formate da gel assistita gonfiore con un buffer di concentrazione salina fisiologica. GUVs mostrano una densità di proteine più omogeneo rispetto GUVs elettroformati preparati con tampone fisiologico. Sinistra (magenta): BPTR-Cer 0,1% di eccitazione: 543 linea laser nm, emissione: 605/70 nm. Middle (verde): KvAP marcato con Alexa-488 di eccitazione: linea laser 488 nm, emissione: 515/30 nm. A destra:. Unione dei due canali Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 11. GUV istogrammi di densità di proteine: la densità di proteine (numero di proteine per unità di superficie) di GUVs elettroformato con tampone iposodica (5 mM KCl, DPhPC) varia meno con concentrazione salina fisiologica (KCl 100 mM, Egg-PC: Egg -PA 9:. 1 in massa) La densità di proteine di GUVs (DPhPC) cresciuto del gel-assistita gonfiore buffer di sale fisiologico mostra la minima variazione. Densità Protein è proporzionale KvAP-A488 intensità di fluorescenza per tali concentrazioni di 28, e in ciascun istogramma delle intensità di fluorescenza sono normalizzati per la media della distribuzione. (Il pannello centrale è stato modificatoda Aimon et al. 28)
Figura 12. Attività singolo canale GUV Membrane patch ('inside-out' convention tensione DPhPC). La GUV è stato coltivato in KCl 100 mM, 5 mM HEPES pH 7.4 su fili di platino. Singoli canali aperti dopo l'applicazione di 100 mV potenziale sulla patch. A destra del kit è un istogramma utilizzato per calcolare la conduttanza di singolo canale. La linea rossa è una misura per una doppia funzione gaussiana con massimi a 4,70 ± 0,27 pA e 15,62 ± 0,58 pA, corrispondente ad una conduttanza di 109,2 ± 8,5 pS. La traccia è stata filtrata a 10 kHz con un filtro di Bessel 4 poli e registrato a 50 kHz.
Figura 13. Tensione-dependen canali t gating nella patch membrana da un GUV formata su agarosio in un buffer di sale (DPhPC, 'inside-out' convention tensione). (A) di risposta della corrente di membrana patch per una fase transitoria in tensione. Pipetta e bagno soluzioni entrambi contenevano KCl 100 mm, e la membrana è svolto per 30 sec a -100 mV tra fasi di tensione successive. In un controllo stretto si può vedere che la traccia contiene 1 o 2 canali che sembrano aprire con tensioni negative. Inserto a) mostra un ingrandimento di apertura ritardata e inserto b) la chiusura ritardata del canale. Correnti sono stati filtrati con un filtro di Bessel 4 poli a 10 kHz e registrati a 51,3 kHz. Offline la traccia era down-campionato a 513 Hz. La capacità transitorio negativo è tagliata a -150 pA. (B) Corrente media (0,25 sec <T <5 sec) rispetto alla tensione passo. Correnti a tensioni positive sono più grandi perché la probabilità di apertura del canale è voltaggio-dipendente.iles / ftp_upload / 52281 / 52281fig13large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sistemi modello biomimetici sono uno strumento importante per lo studio delle proprietà e le interazioni delle proteine e delle membrane. Rispetto ad altri sistemi ricostituiti come BLM o membrane lipidiche supportati, GUV sistemi basati presenti diverse opportunità anche notevole controllo della composizione di membrana, la tensione e la geometria, oltre ad essere veramente senza olio. Tuttavia, incorporando proteine transmembrana, come KvAP, in GUVs richiede adeguamenti significativi di protocolli convenzionali per GUVs solo lipidi. Il protocollo electroformation presentato qui è stato precedentemente caratterizzato e utilizzata per lo studio dei principi biofisici della membrana della distribuzione e della dinamica delle proteine nelle membrane curve 2,4,35. Questo lavoro dimostra un nuovo protocollo gonfiore gel assistita, aggiungendo alla serie di metodi per la ricostituzione in GUVs proteine. Entrambi i protocolli possono produrre GUVs senza difetti contenenti alte densità di KvAP, e misure sulle zone inside-out confermano che laGUVs sé contengono, canali voltaggio-dipendenti funzionali potassio-selettivo.
I due approcci hanno diversi punti di forza e di debolezza. Quando possono essere utilizzate condizioni di scarsa di sale, electroformation offre un buon compromesso tra la resa GUV ed uniforme densità delle proteine. Electroformation dà ancora rese ragionevoli con concentrazioni saline fisiologiche, ma la densità proteina può variare notevolmente tra GUVs (vedi figure 8 e 11). Le variazioni di densità sembra essere legato alla durata di electroformation, la crescita del buffer basso contenuto di sale può anche avere variazioni di densità sostanziali se la crescita continua molto più lungo di 2 ore. Al contrario, GUVs prodotte da rigonfiamento gel assistita hanno una densità proteine notevolmente uniforme, anche per i buffer fisiologici. Tuttavia, la frazione di vescicole multi-lamellari è maggiore, e agarosio auto-fluorescenza complica quantificazione di bassa densità di 16 proteine. L'uso di alcool polivinilico in place di agarosio è stato segnalato per migliorare la resa GUV gel assistita quando i lipidi sono stati depositati da cloroformio 20, ma siamo stati in grado di produrre GUVs utilizzando alcool polivinilico soluzioni SUV. Se un rendimento inferiore GUVs esenti da difetti è accettabile, gonfiore gel assistita ha un chiaro vantaggio per gli esperimenti che richiedono una distribuzione uniforme della proteina.
Electroformation e gonfiore gel assistita hanno anche molto diverse esigenze di attrezzature. Il protocollo gonfiore gel assistita utilizza poco attrezzature specializzate eccezione del pulitore plasma, che non è essenziale in quanto ci sono molti metodi alternativi per produrre pulito, vetro idrofila. Al contrario, electroformation richiede una camera personalizzato con elettrodi a filo. Filo di platino è costoso, ma per questo protocollo GUVs cresciuto più facilmente con il platino di fili di titanio, e GUVs non crescere su ITO scorre quando si utilizzano concentrazioni saline fisiologiche. Il diametro degli elettrodi (0,5 mm) è una comprOmiše tra superficie dell'elettrodo e prezzo. La camera mostrato in Figura 2 è basato su un disegno Luis Bagatolli 15 e Ernesto Ambroggio, ed è stato lavorato da politetrafluoroetilene (PTFE) per consentire la pulizia con maggior parte dei solventi. Tuttavia, poliacetale o cloruro di polivinile (PVC) dovrebbe funzionare bene. La capacità di rimuovere i fili di platino per la pulizia aggressivo è importante, e quando la prima imparare il protocollo, è molto utile essere in grado di osservare la crescita GUV in situ attraverso il coperchio scorrevole inferiore. Il più piccolo, chiuso pozzi impediscono soluzione dalla rovesciare avanti e indietro e consentono anche prove di varie composizioni lipidiche in parallelo. Tuttavia, una speciale camera personalizzata non è indispensabile quando si inizia. Ad esempio, camere semplici, singolo pozzetti possono essere improvvisati virando due fili fino al fondo di una piccola capsula di Petri, o con ceralacca per loro a sandwich tra due vetrini, o semplicemente frugando attraverso il tappo di una piccola fiala.
Sia il electroformation e protocolli gonfiore gel assistita dovrebbero produrre un numero sufficiente di GUVs privi di difetti per micro-manipolazione e esperimenti di patch-clamp. Tuttavia, la resa GUV dipende sensibilmente sulla formazione della pila doppio strato quando la soluzione SUV è parzialmente disidratato. In caso di difficoltà si riscontrano in GUVs crescita (cioè, no o pochi GUVs sono visibili nella camera di crescita), può essere molto utile per crescere GUVs solo lipidi utilizzando una soluzione lipidica / cloroformio in luogo di SUV 15,16 (e un basso buffer di sale). Se GUVs non crescono bene da un film lipidico / cloroformio, allora qualcosa di fondamentale è sbagliato (ad esempio, soluzioni di lipidi errati o buffer, grasso o sporcizia sugli elettrodi, di tensione o di frequenza non corretta, ecc.) Tuttavia, se GUVs crescono da film lipidico / cloroformio ma non i film SUV, allora il problema è probabile che sia con la disidratazione parziale.
Il passo disidratazione parziale èpiù facilmente ottimizzata utilizzando lipidi soli SUV perché non vi è alcun rischio di "denaturazione" lipidi di eccessiva disidratazione. Per electroformation, può essere utile esaminare i fili dopo le goccioline di SUV sono state lasciate asciugare per controllare c'è luminoso lipidi fluorescenza in ogni punto in cui è stato depositato una goccia. Se la fluorescenza dei lipidi scompare dopo la camera è piena di soluzione di crescita, allora o la soluzione di crescita deve aggiungere più attentamente, o SUV bisogno per disidratare per più così il film attribuisce più saldamente al filo. Durante la crescita, accertarsi né i fili né soluzione mossa all'interno della camera (per esempio, quando mette la camera sul microscopio) per evitare di stripping GUVs fuori i fili. Quando GUVs crescono bene, di solito sono facili da vedere nelle immagini a contrasto di fase. Tuttavia, GUVs minori sono spesso più chiara utilizzando fluorescenza lipidi, che è anche utile per vedere come lo stack membrana è cambiato durante la crescita. Esaminare tutte le superfici dii fili (all'interno, all'esterno, superiore ed inferiore) in tutti i pozzetti, nonché il pavimento della camera prima di scartare la crescita, perché le rese possono variare considerevolmente da un posto all'altro.
La movimentazione e lo stoccaggio di GUVs è semplice rispetto alle cellule, ma GUVs sono molto sensibili allo stress osmotico, forze di taglio e l'adesione. Liscio, movimenti dolci sono importanti quando la raccolta o il trasferimento GUVs, ed è importante per la passivazione delle superfici per evitare GUVs di aderire e che esplodono. Tuttavia, per gli esperimenti di patch clamp la camera deve essere risciacquata dopo passivazione in modo che la soluzione di passivazione non può rivestire le pipette di patch e prevenire la formazione di gigaseal. Per passivazione, il trattamento con beta-caseina è semplice ed efficace, e rispetto ad albumina di siero bovino, che ha una funzione di trasporto dei lipidi, beta-caseina ha interazioni più limitati con doppi strati lipidici e dovrebbe essere preferito quando si lavora con GUVs 36. Variando il tempo di incubazione, èpossibile arrivare GUVs di aderire senza esplodere. Tuttavia, i GUVs non aderire alla slitta coperchio più saldamente cellule, e così la cura deve ancora essere prese durante qualsiasi procedura che può indurre il flusso nella camera (per esempio, tampone perfusione, spostando la camera).
Registrazione Patch-clamp è un metodo classico per lo studio canali ionici voltaggio-dipendenti come KvAP e questo protocollo è derivato da tecniche standard per ottenere "inside-out" patch da cellule aderenti. Una patch-clamp set-up standard in cui la pipetta di patch scende obliquamente (ad esempio, 30-60 gradi orizzontale) in una piccola scatola di Petri dovrebbe funzionare bene. Tuttavia, le immagini più chiare della pipetta di patch e regione gigaseal possono essere ottenuti utilizzando una camera in cui coperture scivola formano la parte superiore della camera e inferiore (~ 1 mm Separazione) in modo che la pipetta di patch può entrare in orizzontale dal lato. Poiché non sono necessari grandi di patch pressioni pipette, la pressione può comodamente essere controlled con una siringa e monitorato con qualsiasi misuratore di pressione semplice (ad esempio, il manometro acqua improvvisata). Può essere utile per praticare esperimenti prime patch clamp con GUVs solo lipidi coltivate utilizzando una soluzione lipidica / cloroformio e buffer di basso contenuto di sale. Poiché il rendimento di GUVs senza difetti è molto alto, ci sarà un sacco di GUVs perfetti lavorare anche se molti sono distrutti durante la raccolta e trasferimento camera sperimentale.
Con un po 'di pratica, le patch di membrana asportati con gigaseals stabili possono essere facilmente ottenute da DPhPC GUVs e KvAP-DPhPC GUVs. Per ottenere un alto tasso di successo, aiuta a selezionare con cura tutto, ma leggermente altalenante, GUVs senza difetti e verificare che la pipetta patch è pulita (in cerca di lipidi in fluorescenza) prima di tentare di formare il gigaseal. Quando una membrana "linguetta" entra nella pipetta patch, il gigaseal tipicamente forma rapidamente (<1 sec) senza necessità di forte aspirazione o specifitensione di mantenimento c. Mentre una cattiva tenuta può migliorare la membrana striscia ulteriormente nella pipetta patch, spesso la guarnizione rimane poveri perché l'interno pipetta era contaminato ed è necessario ricominciare con una pipetta di patch fresco e GUV. Forme DPhPC molto stabili di membrana (decine di minuti), con un'eccellente resistenza tenuta anche a tensioni elevate (ad esempio, ± 150 mV). SOPC: colesterolo (3: 1 in moli) possono anche formare macchie molto stabili, ma possono richiedere più elevato di aspirazione per sigillare, mentre patch-Egg PC sembrano rompere più facilmente.
Per le sessioni patch-clamp lunghi può essere necessario regolare la osmolarità della soluzione della camera. Se l'osmolarità è troppo inferiore al buffer di crescita GUV, GUVs diventano gonfio, teso e sferica e potrebbe non essere possibile aspirare membrana GUV abbastanza lontano nella pipetta patch per formare un gigaseal. Questo può spesso essere risolto semplicemente attendere 10 o 20 min come l'evaporazione dalla camera aumenta la external soluzione osmolarità fino agli GUVs sgonfiano e cominciano a fluttuare. Al contrario, se la camera viene lasciata aperta per troppo tempo l'osmolarità della soluzione esterna può aumentare fino GUVs sgonfiano, tubulate e nascere. Ciò può essere evitato bloccando l'evaporazione dalla camera (ad esempio, con olio minerale) o periodicamente aggiunta acqua distillata per sostituire l'acqua evaporata.
Poiché le proteine possono essere esclusi dalla patch di membrana asportati 31, il numero di canali attivi in una patch asportato non viene semplicemente correlato alla densità di proteine nella membrana GUV. Misure di fluorescenza suggeriscono la concentrazione di KvAP nella membrana patch è molto inferiore alla GUV 28 e può essere abbastanza facile ottenere patch contengono solo un piccolo numero di canali. Tuttavia, se le patch contengono troppi canali per la registrazione solo canale, i passi evidenti di utilizzare pipette di patch con punte piccole e / o abbassando la proteina-to-lipidi densità nel mix SUV sono efficaci. Al contrario, effettuare misurazioni d'insieme su patch contenenti molti canali, può essere utile iniziare con una densità relativamente alta proteine (ad esempio, 1:10 proteine di lipidi in peso), utilizzare proteina fluorescente per selezionare GUVs ad alta densità proteine , utilizzare grandi pipette di patch (ad esempio, da 2 a 3 micron di punta di diametro) e aspirare rapidamente per cercare di formare rapidamente la tenuta. Chiaramente, la configurazione di tipo "whole-cell" (vale a dire, 'tutto-GUV') sarebbe ideale per caratterizzare tutti i canali in una GUV, ma purtroppo il "tutto-GUV" configurazione pone diversi problemi tecnici 37.
Le soluzioni, lipidi e concentrazioni di proteine in questa esercitazione sono forniti solo come punto di partenza, e possono essere modificate per adattarsi alle esigenze di un particolare esperimento seguenti alcune considerazioni.
Tutte le soluzioni dovrebbero includere un buffer di pH, come HEPESo TRIS per garantire le proteine non sono esposti a condizioni estreme di pH. Il buffer SUV dovrebbe avere partire una concentrazione di soluti come la proteina tollera (ad esempio, sale di 5 mm o inferiore), come concentrazione del soluto aumentano durante la fase di disidratazione parziale e alte concentrazioni di sale possono denaturare le proteine o causare il film lipidico di rapida delaminate durante la fase di reidratazione. Piccole quantità di zuccheri come il trealosio (es, 1 mM a 5 mM) sono pensati per proteggere la proteina durante la disidratazione 23. Mentre trealosio è stato implicato in anidrobiosi e si crede per proteggere la membrana e proteine contro essiccazione 38, saccarosio o glucosio può funzionare altrettanto bene.
Per il buffer di crescita, la concentrazione di sale è particolarmente importante in quanto questo influenzerà i parametri di crescita GUV ottimale (per esempio, tensione electroformation, frequenza e durata). Al contrario, il vincolo primario per il buffer di osservazione è tcappello dovrebbe avere la stessa osmolarità come tampone di crescita. L'inclusione di saccarosio e / o glucosio nel "buffer di crescita" e "buffer di osservazione" può essere utile per garantire GUVs sedimenti sul fondo della camera di osservazione, mentre una differenza di indice di rifrazione tra GUV interno ed esterno aiuta con contrasto di fase o microscopia DIC. Electrophysiologists spesso includono calcio o magnesio ioni alle soluzioni da bagno e / o patch di pipetta per migliorare la formazione gigaseal con membrane cellulari, ma questi non sembrano essere essenziali per GUVs. Infatti, gli ioni bivalenti quali magnesio e calcio può indurre la separazione di fase lipidica e facilitano l'adesione, quindi se sorgono questi problemi può essere utile aggiungere 1 mM EDTA.
Chiaramente, un'attrazione chiave dei sistemi ricostituiti in confronto alle cellule è la capacità di controllare la composizione dei lipidi. DPhPC GUVs crescono bene e la forma di membrana asportati stabili, e questi protocolli hanno anche lavorato efcacemente per le miscele di lipidi contenenti fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilglicerolo (PG), acido fosfatidico (PA), fosfatidilserina (PS) e colesterolo. Tuttavia, la crescita GUV è sensibile sia composizione lipidica e buffer 15, e così i parametri di protocollo (ad esempio, la quantità di lipidi depositato, tensione electroformation / frequenza) può essere necessario un aggiustamento per le miscele di lipidi contenenti alte concentrazioni di PE, accusato lipidi (PG, PA, PS), o colesterolo. Quando si inizia, Egg-PC, DOPC o DPhPC sono una buona scelta, ed è anche molto utile per includere un lipide fluorescente per osservare la crescita GUV e distinguere GUVs da vescicole multilamellari con due o più doppi strati. Miscele lipidiche possono essere preparati combinando sospensioni SUV di soluzione madre, come i lipidi miscela durante la fase di disidratazione parziale (purché la temperatura è superiore a qualsiasi individuo temperatura di transizione di fase). Utilizzando concentrazione SUV superiore (ad esempio,10 mg / ml) soluzioni madre consente una notevole flessibilità, e questi possono poi essere diluita a 3 mg / ml prima disidratazione della sospensione.
Se si tenta di adeguare tali protocolli altre proteine trans-membrana, è molto importante essere in grado di osservare direttamente sia l'incorporazione di proteine nella funzione GUVs e proteine di prova. Mentre non è un problema con KvAP, esiste sempre la possibilità che durante la reidratazione passo proteina transmembrana rimarrà nello stack membrane che porta alla formazione di GUVs solo lipidi. Etichettatura fluorescente della proteina è molto comoda in quanto fornisce un modo rapido ed inequivocabile per osservare proteine incorporazione GUVs e controllare anche per l'aggregazione all'interno GUVs. È inoltre molto importante per testare la funzione delle proteine nelle GUVs per confermare che la proteina non è stato danneggiato durante il processo di ricostituzione. Per i canali ionici come KvAP, misurazioni patch-clamp in grado di stabilire la presenza di canali funzionali nelGUVs. Tuttavia, una fluorescenza marcata, ligando ad alta affinità (per esempio, la tossina, substrato o anti-corpo) sarebbe anche molto utile per testare lo stato di proteine in GUVs.
In sintesi, questo articolo viene illustrato come produrre Proteo-GUVs contenenti il canale del potassio voltaggio gated KvAP e caratterizzare utilizzando la microscopia a fluorescenza e elettrofisiologia. Eventualmente questi metodi possono essere adattati alle nuove classi di proteine di membrana e forniscono una base per sistemi più complessi in vitro per lo studio e costruendo materia vivente dai suoi componenti fondamentali.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
| Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
| 18:1 (Δ9-cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| Cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
| TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | labeled lipid |
| BPTR-Ceramide | Invirtogen | D-7540 | labeled lipid |
| Choloroform | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
| Acetone | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
| Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Bonaduz AG | diverse | |
| Amber vials and Teflon cups | Sigma | SU860083 and SU860076 | |
| Parafilm | VWR | 291-1214 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | diverse | |
| Agarose | Euromex | LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C) | |
| Sucrose | Sigma | 84097-1kg | |
| Glucose | Sigma | G8270-1kg | |
| Trehalose | Sigma | T9531-25G | |
| KCl | Sigma | P9333-1kg | |
| Hepes | Sigma | H3375-100G | |
| TRIS | Euromex | EU0011-A | |
| Osmometer | Wescor | Vapro | |
| pH meter | Schott instruments | Lab850 | |
| Sonicator | Elmasonic | S 180 H | |
| Syringe filter 0.2 µm | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
| Function generator | TTi | TG315 | |
| Platinum wires | Goodfellow | LS413074 | 99.99+%, d = 0.5 mm |
| Polytetrafluoroethylene | Goodfellow | ||
| Dow Corning 'high vacuum grease' | VWR | 1597418 | |
| sealing paste | Vitrex medical A/S, Denmark | REF 140014 | Sigillum Wax |
| Cover slides 22 x 40 mm No1.5 | VWR | 631-0136 | |
| Cover slides 22 x 22 mm No1.5 | VWR | 631-0125 | |
| Plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | airplasma, setting 'high' |
| Petri dishes | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cm x 1 cm |
| patch clamp amplifier | Axon instruments | Multiclamp700B | |
| DAQ Card | National Instruments | PCI-6221 | |
| Labview | National Instruments | version 8.6 | |
| Glass pipettes boro silicate OD 1 mm ID 0.58 mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
| Electrode holder | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| Pipette puller | Sutter | P-2000 | |
| Camera | ProSilica | GC1380 | |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axiovert 135 | |
| Objective | Zeiss | 40X long working distance, Phase contrast | |
| Objective | Zeiss | 100X Plan-Apochromat NA 1.3 | |
| Filterset GFP (for Alexa-488) | Horiba | XF100-3 | |
| Filterset Cy3 (for TexasRed) | Horiba | XF101-2 | |
| beta-casein | Sigma | C6905-1G | |
| Confocal microscope | Nikon Eclipse TE 2000-E | D-Eclipse C1 confocal head | |
| Objective | Nikon | Plan Fluor 100X NA 1.3 | |
| Matlab | Mathworks | for image processing and analysis of the current traces |
References
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