Summary
Elektroformation, und Gel-unterstützte Schwellung - Die Wiederherstellung der Transmembranprotein, KvAP, in riesige unilamellare Vesikel (GUVs) ist für zwei Dehydration-Rehydrierung Methoden nachgewiesen. In beiden Verfahren werden kleine unilamellare Vesikel, die das Protein enthält, zusammengeschmolzen, um GUVs die dann durch Fluoreszenzmikroskopie und Patch-Clamp-Elektrophysiologie untersucht werden können zu bilden.
Abstract
Riesigen unilamellaren Vesikeln (GUV) stellen eine populäre biomimetischen System für die Untersuchung Membran verbundenen Phänomenen. Jedoch allgemein verwendeten Protokolle zu wachsen GUVs muß, um GUVs funktionelle Transmembranproteine, die Form modifiziert werden. Dieser Artikel beschreibt zwei Dehydration-Rehydrierung Methoden - Elektroformation und Gel-unterstützte Schwellung - zu GUVs mit dem spannungsabhängigen Kaliumkanal, KvAP zu bilden. Bei beiden Verfahren ist eine Lösung von Protein enthaltenden kleinen unilamellaren Vesikeln partiell dehydratisiert, um einen Stapel von Membranen, die man dann in ein Rehydrationspuffer quellen zu bilden. Für die Elektroformation Verfahren wird der Film auf Platinelektroden abgeschieden, so dass eine AC-Feld bei der Folien Rehydratisierung angewendet werden. Im Gegensatz dazu verwendet das Gel gestützten Quellverfahren ein Agarosegel Substrat Film Rehydratisierung verbessern. Beide Methoden können GUVs in niedrigen (zB 5 mM) und physiologischen (zB 100 mM) Salzkonzentrationen zu produzieren. Die resultierenden GUVs über Fluoreszenzmikroskopie charakterisiert, und die Funktion des rekonstituierten Kanäle gemessen mit der Inside-Out-Patch-Clamp-Konfiguration. Während Schwellung in der Gegenwart eines elektrischen Wechselfeldes (Elektroformation) ergibt eine hohe Ausbeute an fehlerfreien GUVs das Gel gestützten Quellverfahren erzeugt eine homogene Proteinverteilung und erfordert keine spezielle Ausrüstung.
Introduction
Bei der Untersuchung der physikalischen Prinzipien, die lebende Systeme regeln, Bottom-up-Ansätze ermöglichen ein Experimentator die Systemzusammensetzung und andere Parameter, die nicht leicht in der zellbasierten Systemen 1 manipuliert werden, zu steuern. Für membranbasierte Prozesse, Giant unilamellare Vesikel (GUVs, Durchmesser ~ 1-100 um) haben sich als sehr nützlich biomimetischen Systems 2 sein - 10 - 7, wie sie für die Mikroskopie Studien und Mikromanipulation 8 geeignet sind. Zwar gibt es viele verschiedene Protokolle zur GUVs produzieren, die meisten fallen in zwei Kategorien - Emulsion nähert 11,12 und Techniken, die auf eine rückfettenden Lipidfilm 13-16. In Emulsion basierenden Verfahren werden die inneren und äußeren Blättchen der GUV Membranen nacheinander von Lipid-Monoschichten auf Wasser / Öl-Grenzflächen zusammengefügt. Diese Vorgehensweise eignet sich zur Verkapselung lösliche Proteine mitin den GUVs und zur Bildung GUVs mit asymmetrischer Broschüre Lipidzusammensetzung. Allerdings kann GUVs von Emulsionen gebildet Spuren des Lösungsmittels, die der Membran mechanische Eigenschaften 17 ändern zu behalten, und der Ansatz ist nicht besonders gut geeignet, um Transmembranprotein Rekonstitution.
Film Rehydratisierung Verfahren beruhen auf der Tatsache, daß die Trocknung (Entwässerung) verursacht viele Lipidgemische einen multilamellare Membranstapel zu bilden. Wenn dieser Stapel wird dann in Kontakt mit einem wässrigen Puffer platziert werden Membranen in dem Stapel auseinander als Lösungsmittel fließt zwischen ihnen und an der Oberfläche des Stapels bewegen können einzelne Membranen lösen zu GUVs 13,18 (und einen regelrechten Zoo bilden anderen lipidischen Objekte). Auch für eine optimale Puffer und Lipidzusammensetzungen, hat diese klassische "spontane Schwellung" Verfahren jedoch eine relativ geringe Ausbeute an fehlerfreie GUVs. Eine weit verbreitete Methode, um die Ausbeute an fehlerfreie GUVs steigern ist "Elektroformation221 ;, in dem ein Wechselstrom (AC) -Feld wird während der Film Rehydratisierung aufgebracht. Während der Mechanismus bleibt kaum verstanden ", Elektroformation" kann spektakuläre GUV Ausbeuten (> 90% unter günstigen Bedingungen) für niedrige Salzkonzentration Puffer (<5 mm) 14,19, und kann sogar in physiologischen Puffern zu arbeiten (~ 100 mM) mit eine höhere Frequenz (500 Hz gegenüber 10 Hz) Wechselstromfeld und Platinelektroden 15. Ein alternativer Ansatz, um die Ausbeute an fehlerfreien GUVs BOOST "Gel-unterstützte Schwellung", in dem die Lipidlösung wird auf ein polymeres Gel Substrat anstelle des passiven abgeschieden (zB Glas, PTFE) Substrate in der klassischen "spontane Quellung verwendete ". Wenn die resultierende Lipid / Gelfilm rehydriert kann GUVs schnell bilden auch für physiologische Puffer 16,20.
Alle diese Methoden können lipid nur GUVs die benutzt werden können, um Membran-assoziierten Phänomene wie die Studie zu produzierenInteraktion zwischen löslichen Proteinen und Membranen. Um jedoch ein Transmembranprotein in GUVs einzubauen, sind wesentliche Änderungen erforderlich, um sicherzustellen, dass das Protein bleibt in einem Funktionszustand in der gesamten Aufbereitungsvorgang. Während Lösungen von Lipiden in organischen Lösungsmitteln (beispielsweise Chloroform, Cyclohexan) sind ideal für die Herstellung von Lipidfilmen, sind Transmembranproteine in der Regel nur dann stabil, wenn die hydrophobe Transmembrandomäne in einer Lipiddoppelschicht eingebettet ist, oder durch ein Detergens Mizelle umgeben ( beispielsweise bei der Proteinreinigung). Somit ist das Ausgangsmaterial für eine Rekonstitution typischerweise nativen Membranen, gereinigtes Protein in einer Reinigungslösung oder kleinen unilamellaren proteinhaltigen Vesikel (Proteo SUVs) und / oder multilamellare Vesikel (MLVs Proteopolysaccharide) durch Entfernung des Detergens in das gebildete Gegenwart von Lipiden. Die meisten Methoden, diese Membranproteine in GUVs integrieren sich in drei Kategorien.
Direkter Insertion: Transmembranprotein in Waschmittel suspendiert ist mit vorgeformten, lipid nur mild solubilisiertem GUVs vermischt und das Waschmittel dann mit Bio-Beads 21 entfernt. Obwohl vom Konzept her einfach, erfordert dieses Verfahren eine genaue Steuerung der Waschmittelkonzentration, da ein zu hoher Waschmittelkonzentration die GUVs während eine zu geringe Konzentration kann bewirken, dass das Protein zu entfalten oder Aggregat aufzulösen.
GUV / Proteo-SUV Fusion: Protein in Proteo-SUVs mit vorgeformten, lipid nur GUVs Kombination und Verschmelzung wird mit speziellen fusogenen Peptide 22 oder Reinigungsmittel 21 erleichtert. Typischerweise ist das Ausmaß der Fusion ist begrenzt, was zu GUVs mit niedrigen Proteindichte.
Dehydratisierung / Rehydratisierung: Ein Protein enthaltenden Lipidfilm wird durch partielle Dehydratisierung einer Proteopolysaccharide SUV (oder Proteo MLV) -Lösung und GUVs gebildet werden dann wie bei einem reinen Lipid-Film aufgewachsen. Die offensichtliche Herausforderung besteht darin, das Protein während der partiellen dehydrati schützenam Schritt 23, aber das Verfahren wurde erfolgreich verwendet, um Transmembranproteine wie Bakteriorhodopsin, Calcium-ATPase, Integrin und VDAC in GUVs 7,23 rekonstituieren - 25.
Dieser Artikel beschreibt die Dehydratisierung / Rehydratisierung Protokolle GUVs welche die spannungsabhängigen Kaliumkanals, KvAP aus der hyperthermophilen Archaea, Aeropyrum pernix machen. KvAP hat einen hohen Grad an Homologie zu eukaryotischen spannungsabhängige Kaliumkanäle 26 und eine bekannte Kristallstruktur 27 , so dass es ein gutes Modell für die Untersuchung des Mechanismus der Spannung Gating. Die Produktion der Proteo-SUV wurde im Detail beschrieben worden und ist nicht Teil dieses Tutorials 26,28,29. Wichtig ist, dass KvAP Proteopolysaccharide SUVs nicht für jeden GUV Zubereitung hergestellt werden, wie sie in kleinen (beispielsweise 10 ul) Aliquots bei -80 ° C für längere Zeit (> 1 Jahr) gelagert werden. Elektroformationoder Gel-unterstützte Schwellung kann dann verwendet werden, um aus den GUVs KvAP Proteopolysaccharide SUVs wachsen (oder Proteo MLVs).
Die Schlüsselschritte für die Elektroformation Protokolls sind in Abbildung 1 dargestellt. Tröpfchen einer Lösung von SUVs, die das Protein enthalten, werden auf Platindrähten (in 2 gezeigt) abgeschieden. Partielle Dehydratisierung der SUV-Suspension zur Bildung eines Lipidproteinfilm durch Fusion des SUVs. Während der Rehydratisierung wird ein Wechselstromfeld an die Elektroden, um die Lipidschichten unterstützen delaminieren und bilden GUVs aufgebracht. Ein Feld 10 Hz funktioniert gut bei der Verwendung von "salzarme" (<5 mM) Rehydrationspuffer 28 und GUVs mehrere Stunden dauern, um zu wachsen. Im Gegensatz dazu physiologische Puffer (mit ~ 100 mM Salz) arbeiten gut mit einer niedrigeren Spannung, 500 Hz Wechselfeld, sondern erfordern einen längeren (~ 12 h) Schwellungen Zeitraum 15. Dieses Verfahren basiert auf einem früheren Protokoll mit ITO-Folien 24 basiert, aber einen benutzerdefinierten Kammer Fortsetzungaining zwei Platindrähte wie in Abbildung 2 dargestellt (siehe die Diskussion für Design-Details und Anregungen für einfachere, improvisierte Kammern).
Abbildung 3 zeigt die Gel-unterstützte Schwellung Methode. Das Protokoll funktioniert gut mit Puffern mit physiologischer Kochsalzkonzentrationen, ist schnell, und produziert GUVs mit homogener Proteinverteilung. Die Ausbeute an isoliertem offenbar mangelfreien GUVs (dh der GUV Membran Uniform bei optischen Längenskalen und keine Objekte umschließen) jedoch geringer ist, auch wenn es eine ausreichende Anzahl für Patch-Clamp-und Mikromanipulationsexperimente . Diese Methode wurde auf einem Protokoll mit Agarose-Gel, um lipid nur GUVs 16 zu produzieren und weniger spezialisierte Ausrüstung als die Elektroformation Methode.
Die Charakterisierung GUVs Fluoreszenzmikroskopie beschrieben, sowie Verfahren unter Verwendung eines Standard-Patch-Clamp-Set-up, ummessen KvAP Aktivität in "inside-out" herausgeschnitten Membranflecken.
Wachsende proteinhaltigen GUVs kann schwieriger als lipid nur GUVs sein. Insbesondere kann die endgültige GUV Ausbeute empfindlich von genau, wie der SUV-Lösung aufgebracht und entwässert, um den Membranstapel bilden, hängen. Für jemanden ohne Vorkenntnisse mit GUVs, kann es hilfreich sein, zuerst wachsen lipid nur GUVs nach einem herkömmlichen Protokoll 15,16 in dem der Membranfilm wird durch Abscheiden von Lipiden aus einem organischen Lösungsmittel gebildet werden. Sobald der herkömmlichen Protokoll gut funktioniert, kann SUV Abscheidung und teilweise Wasser entzogen dann mit lipid nur Geländewagen, die auch bei der Einstellung des Protokolls für eine neue Lipidzusammensetzung sind sehr hilfreich, gemeistert werden. Wenn GUVs wachsen zuverlässig von lipid nur Geländewagen, dann ist es nur ein kleiner Schritt, um proteinhaltige GUVs von Proteo-SUV zu produzieren.
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Protocol
1. Herstellung der Lösung
- Bereiten 5 ml "SUV Puffer", der 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) oder Tris (pH 7,5) und 2 mM Trehalose. Filtern des Puffers mit einer 0,2 & mgr; m-Spritzenfilter und teilen sich in 1 ml Aliquots, die bei -20 ° C gelagert werden kann.
HINWEIS: Weitere Einzelheiten für Reagenzien und Instrumente werden in der Liste Materialien. - Bereiten Sie 40 ml GUV "Wachstum Buffer ', die die GUV Innenraum während der Film Rehydrierung füllen wird. Für eine "Niedrigsalz" Wachstums kombinieren 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) oder 1 mM TRIS (pH 7,5), und ~ 400 mM Saccharose. Für eine "physiologische Salzwachstums kombinieren 100 mM KCl, 5 mM HEPES (pH 7,4) oder 5 mM TRIS (pH 7,5), und ~ 200 mM Saccharose.
- Vorbereitung 40 ml "Observation Buffer 'für die externe Lösung im Versuchsraum durch die Kombination von 100 mM KCl, 5 mM HEPES (pH 7,4) oder 5 mM TRIS (pH 7,5), und ~ 200 mM Glucose.
HINWEIS: Diese Puffer sind nur examples. Siehe die Diskussion um die Puffer für andere Experimente anpassen. - Messen Sie die Osmolarität der Wachstum und Beobachtung Puffer mit einem Osmometer. Fügen Granulat von Saccharose oder Glucose, um ihnen zu entsprechen weniger als 1%, so dass GUVs nicht aufzulösen oder zusammenbrechen, wenn es von der Wachstumskammer zu der Beobachtungskammer übertragen.
HINWEIS: In diesem Konzentrationsbereich, Zugabe von 1 mM an Saccharose (13,7 mg pro 40 ml) oder Glucose (7,2 mg pro 40 ml) erhöht Osmolarität von ~ 1 mOsm. - Filtern der Wachstum und Beobachtungs Puffer mit einem 0,2 um Filter und im Kühlschrank bei 4 ° C, um das Bakterienwachstum zu hemmen.
- Man löst 50 mg von Beta-Casein in 10 ml 20 mM TRIS (pH 7,5) Puffer, einen notwendig, um die Oberflächen der Versuchskammern zu passivieren, so daß GUVs kleben nicht, die Ausbreitung und Burst 5 mg / ml beta-Casein-Lösung zu bilden. Sobald das beta-Casein vollständig (bei 4 ° C bis zu mehreren Stunden), Filter (0,2 um) darin gelöst in 0,5 ml Aliquote, die schockgefroren und gelagert werden können,bei -20 ° C für eine spätere Verwendung (aufgetauten Aliquots bei 4 ° C gelagert kann typischerweise bis zu einer 1 Woche verwendet werden).
2. SUV Vorbereitung
- Vorbereiten und einfrieren Aliquots der Proteo-SUVs im Anschluss an die bisher veröffentlichten detaillierten Protokoll 28. Verwenden KvAP fluoreszenz Alexa-488 Maleimid in DPhPC SUVs rekonstituiert (10 mg / ml) zu Lipid-Verhältnis von 1:10 (Masse) beziffert mit einem Protein.
HINWEIS: Wildtyp KvAP enthält ein Cystein pro Monomer in der Nähe der intrazellulären C-Terminus (Aminosäure 247) befindet. - Leuchtstoff, Lipid-only SUVs:
HINWEIS: Die beim Umgang Chloroform unter einer Abzugshaube tragen Nitril Handschuhe und Schutzbrille. Vermeiden Sie die Verwendung eines Kunststoff wie Chloroform sie aufzulösen. Chloroform-Lösungen können in Braunglasflaschen mit Teflon-Kappen gespeichert und übertragen mit Glasspritzen werden. Achten Sie darauf, alle Glaswaren mindestens 5 bis 10 mal mit Chloroform vor und nach dem Pipettieren Lipide spülen.- Bereiten 100 ul10 mg / ml DPhPC SUVs, die 0,5 Mol-% des roten fluoreszierenden Lipids, Texas Red-DHPE, indem 100 ul DPhPC Lösung (10 mg / ml in Chloroform) mit 8,2 & mgr; l von Texas Red-DHPE Lösung (1 mg / ml in Methanol) in einem 1,5-ml-Braunglasfläschchen.
- Trocknen Sie die Lipide unter einem Stickstoffstrom in einem Chemieabzug während der Drehung der Flasche. Wenn der Film trocken zu sein scheint, legen die Lipide unter einem Vakuum für 3 h, um restliches Lösungsmittel zu entfernen.
- 100 l SUV Puffer in die Lipide und kräftig vortexen bis kein Lipid bleibt an den Wänden des Röhrchens und die Lösung gleichmäßig milchig.
- Beschallen die Lipid-Lösung für SUVs zu bilden. Stellen Sie die Flasche, bis es der Ultraschall bewirkt, dass die meisten Bewegung und fließen in das Fläschchen, und kümmern uns nicht um die Lösung unnötig erhitzen. Weiter Beschallung, bis die Lösung durchscheinend oder, wenn möglich, transparent (2-5 min zur Spitze Beschallung, ~ 20 Minuten für die Behandlung in einem Ultraschallbad).
- Aliquot SUVs (beispielsweise 10 ul oder 20 ul) und Kühlschrank (-20 ° C) für eine spätere Verwendung.
HINWEIS: Lipide, insbesondere ungesättigten Lipiden, kann leicht Zusammenbruch. Shop Lipidlösungen bei 20 ° C (oder 80 ° C) unter Argon und innerhalb von 6 Monaten. Lipidabbauprodukte mit Dünnschichtchromatographie nachgewiesen werden.
3. GUV Wachstum von Elektroformation
- Bereiten Sie die Elektroformation Kammer.
- Wenn die Kammer nicht gereinigt wurde, entfernen Sie die Fenster, wischen Sie alle Dichtungsmasse und Fett, extrahieren Sie die Kabel, und spülen Sie und reiben Sie die Kammer mit mit Wasser und Ethanol (≥70%) abwechselnd ein Gewebe.
- Reiben Sie die Drähte gut, tauchen die Drähte und Kammer in Aceton und beschallen für 5 min. Wischen Sie alles mit einem Gewebe wieder mit Aceton. Setzen Sie die Kammer in Ethanol und beschallen für 5 min.
- Setzen Sie die Kammer, indem Sie die Kabel durch die Löcher und drehen, und wischen Sie die Kabel, um sicherzustellen, sie ARe sauber. Setzen Sie die Kammer mit destilliertem Wasser, beschallen für 5 min und die Kammer mit einem Strom von Stickstoff oder Luft trocknen.
- Vorbereitung 30 ul 3 mg / ml SUV-Suspension in SUV-Puffer. Zur Bildung proteinhaltigen GUVs kombinieren 8 ul Proteopolysaccharide SUVs (DPhPC 10 mg / ml KvAP 1:10), 2 ul von fluoreszierenden SUVs (10 mg / ml DPhPC, 0,5 mol% TexasRed-DHPE) und 20 ul SUV Puffer in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für eine abschließende Protein zu Lipid (Masse) Verhältnis von 1: 12,5 und 0,1 Mol-% TexasRed-DHPE. Mischen Sie die Lösung kräftig.
- Alternativ kann, um das Protokoll mit lipid nur SUVs Praxis einfach kombinieren 10 ul Fluoreszenz SUVs (10 mg / ml DPhPC und 0,5 mol% TexasRed-DHPE) mit 20 ul SUV Puffer.
- Zahlen Sie den SUV-Lösung.
- Verwenden Sie ein 2 ul Pipette oder 5 ul Glasspritze zu klein (<0,2 ul) Tröpfchen der SUV-Lösung auf den Drähten zu hinterlegen. Etwa 1 ul der Lösung benötigt wird, um eine Reihe von Tropfen entlang bilden1 cm Draht. Achten Sie darauf, die Tropfen sind klein genug, und mit Abstand weit genug voneinander entfernt, dass sie sich nicht berühren oder die Sicherung.
- Lassen Sie die abgeschiedenen SUVs trocknen für ca. 30 Minuten im Freien. Wenn alle Tropfen angesiedelt haben, drehen Sie den Draht, so dass die Lipidablagerungen lassen sich leichter mit dem Mikroskop beobachten.
HINWEIS: Wenn die SUVs nicht ausreichend trocknen, sie einfach zu waschen können von den Leitungen, wenn die Wachstumspuffer wird zugegeben, während der Trocknung zu viel kann das Protein beschädigen. Da die Luftfeuchtigkeit beeinflußt die Trocknungsgeschwindigkeit, der Trocknungszeit und / oder Luftfeuchte kann für optimale Ergebnisse 30 eingestellt werden. Der Lipidfilm auf den Drähten sollte unter dem Mikroskop sichtbar.
- Setzen Sie die Kammer.
- Verschließen Sie die Kammer unten: mit einer Spritze Vakuumfett auf den Boden der Kammer um die drei Brunnen gelten, und drücken Sie eine 40 mm x 22 mm Deckglas sanft gegen sie den Kammerboden zu versiegeln, so dass es ohne eine Lücke haftet. Dichten Sie die Seiten der Kammer (wo die Drähte Ausgang) mitDichtpaste. Bewerben Vakuumfett auf der Oberseite der Kammer umreißt die drei Brunnen.
- Langsam Wachstums Puffer, bis jeder Vertiefung nach oben befüllt. Vermeiden Sie schnelle Bewegung der Lösung in den Vertiefungen, da dies den Lipidfilm aus den Elektroden zu strippen.
- Die Kammer, indem Sie die obere Abdeckung Schieber vorsichtig auf das Fett, kümmert sich nicht um die untere Deckglas entfernen. Verwenden Sie eine Gewebe irgendwelche Tropfen Puffer an den Rändern der oberen Deckglas entfernen.
Hinweis: Dies ist ein guter Zeitpunkt, um die Kammer unter dem Mikroskop untersucht, um zu bestätigen, dass die Lipidfilm wurde auf die Drähte geblieben.
- Verbinden Sie den Signalgenerator an die Drähte mit zwei Krokodilklemmen. Stellen Sie die Frequenz (10 Hz / 500 Hz Sinuswelle für hohen / niedrigen Salzpuffer) und mit einem Multimeter messen und die Spannung an den Leitungen von 0,7 / 0,35 V quadratischer Mittelwert (V effektiv) für den hohen / niedrigen Salzpuffer. Decken Sie die Kammer mit einer Aluminiumfolie, um die Fluorophore vor Licht zu schützen. Lassen ter GUVs für 2 bis 3 h bei der niedrigen Salzpuffer und 12 h oder O / N für die Hochsalzpuffer wachsen.
- Trennen Sie die Kammer aus dem Generator und sorgfältig legen Sie sie auf einem inversen Mikroskop GUV Wachstum zu bewerten. Verwenden langsame, stetige Bewegungen oder Flüssigkeitsströmung in den Vertiefungen kann vorzeitig abzulösen GUVs von den Drähten.
HINWEIS: GUVs an den Drahtkanten sind in der Regel im Phasenkontrast (40X großen Arbeitsabstand Ziel) sichtbar, während GUVs überall auf der unteren Hälfte der Drähte mit Epifluoreszenz ersichtlich. Wenn keine GUVs sichtbar sind, drehen Sie die Kabel an der oberen Fläche zu suchen. GUVs können bei 4 ° C in einer Wachstumskammer für mehrere Tage gelagert werden.
4. GUV Wachstum durch Gel-unterstützte Schwellung
- Herstellung von 10 ml einer 1% igen Lösung, die durch Mischen von 100 mg Agarose mit 10 ml reinem Wasser. Erhitzen Sie es, bis es, indem Sie es in der Mikrowelle bei 480 W für ~ 20 Sekunden kocht. Rühren Sie um sicherzustellen, dass die Agarose vollständig gelöst ist.
HINWEIS: Die Lösungkönnen bei 4 ° C gelagert und bei Bedarf wieder aufgeheizt werden. - Plasma-sauber (Luft-Plasma) eine Abdeckung Rutsche für 1 Minute, so dass das Agarose-Lösung wird gut darauf verteilen. Verwenden Sie die Cover-Folien in den nächsten 15 Minuten, wie die Wirkung der Plasmareinigung nachlässt schnell.
- Anwenden 200 ul warmes Agaroselösung zu jedem 22 x 22 mm 2 Schieber so der Lösung benetzt die gesamte Fläche. Neigen Sie den Schiebe vertikal und berühren Sie die Unterkante auf ein Gewebe, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und nur eine dünne glatte Schicht aus Agarose auf der Folie.
- Legen Sie die Folie auf einer Heizplatte oder Ofen bei 60 ° C und lassen Sie es für mindestens 30 Minuten trocknen lassen. Die Agarose Films mit dem Auge kaum sichtbar. Nachdem die Objektträger zu kühlen RT, verwenden Sie sie sofort, oder speichern Sie sie für bis zu einer Woche in einem geschlossenen Behälter bei 4 ° C.
- Legen Sie die Agarose-beschichtete Deckglas in einem Standard 3,5 cm Petrischale.
- Bereiten Sie das SUV-Lösung, wie in Abschnitt 3.2 und gelten ~ 15 ul der SUV-Lösung (3 mg / ml Lipid) in~ 30 kleinster Tropfen vorsichtig auf die Agarose-Oberfläche. Achten Sie darauf, die Agarose-Schicht zu stark verzerren.
- Legen Sie die Objektträger unter einem leichten Stickstoffstrom für ca. 10-15 min und folgen Sie dem Verdampfen des Puffers mit dem Auge als die Tröpfchen trocknen.
- Sobald die SUVs getrocknet sind, fügen Wachstum Puffer, um die Gleitfläche zu decken. Für eine kleine 3,5 cm Petrischale Gebrauch ~ 1 ml Puffer.
- Lassen Sie die Schwellung für ~ 30 min gehen, und überprüfen Sie das Wachstum von GUVs in der Kammer mit einem inversen Mikroskop mit Phasenkontrast oder Differentialinterferenzkontrast (DIC).
HINWEIS: Epifluoreszenz Beobachtung ist schwierig aufgrund der starken Hintergrund der Fluorophore in dem Gel und der Autofluoreszenz der Agarose.
5. Ernte und Observing GUVs
- Passivieren des Beobachtungskammer (zB kleine Petrischale oder Deckglas), so dass GUVs kleben nicht, zu verbreiten und brach auf dem Kammerboden. Decken Sie die Chamber Boden mit Beta-Casein-Lösung, Inkubation für 5 min, spülen Sie den Casein-Lösung mit reinem Wasser, trocken mit einem Strom von Luft oder Stickstoff, und schließlich fügen Beobachtung Puffer (zB ~ 5 mm Tiefe für eine kleine Petrischale).
- Ernten Sie die GUVs. Schneiden Sie das Ende eines 100 ul Pipettenspitzen, so dass die Öffnung größer (~ 2 mm Durchmesser) und streben langsamer als die Schubspannung von Pipettieren kann leicht zerstört GUVs.
- Für elektro gebildet GUVs, öffnen Sie die Wachstumskammer durch leichtes Entfernen der oberen Deckglas. Legen Sie die Pipettenspitze direkt über jeden Draht und saugen ~ 50 & mgr; l, während Sie die Pipettenspitze entlang des Drahtes, um die GUVs lösen.
HINWEIS: Es kann helfen, um den Draht zu GUVs auf der "anderen Seite" des Drahtes sammeln drehen. - Für "Gel-unterstützte Schwellung" GUVs, tippen Sie auf die erste Seite der Petrischale ein paar Mal zu helfen, die GUVs lösen sich von der Deckfläche. Positionieren Sie die Pipettenspitze knapp über dem Deckglas und saugen, während 50 & mgr; pulling die Spitze über die Oberfläche zurück. Direkt an eine Beobachtungskammer, oder speichern zu übertragen geerntet GUVs in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen bei 4 ° C für bis zu 1 Woche.
- Für elektro gebildet GUVs, öffnen Sie die Wachstumskammer durch leichtes Entfernen der oberen Deckglas. Legen Sie die Pipettenspitze direkt über jeden Draht und saugen ~ 50 & mgr; l, während Sie die Pipettenspitze entlang des Drahtes, um die GUVs lösen.
- Legen Sie die Beobachtungskammer auf einem inversen Mikroskop, fügen Sie die GUVs zu der Beobachtungskammer, und ein paar Minuten warten, bis die GUVs am Kammerboden absetzen.
- Umfrage der Kammer mit Phasenkontrast oder DIC, um schnell glatt, kugelförmig ("fehlerfrei") "GUV-Kandidaten". Untersuchen Sie jeden "GUV Kandidat" in Epifluoreszenz, alle, die kleiner Liposomen innerhalb verschachtelt auszuschließen. Schließlich prüfen, ob die Lipidfluoreszenzintensität ist einheitlich und kompatibel mit einer einzigen Membran (dh unilamellaren).
HINWEIS: In einigen bilamellare (oder multilamellare) Vesikel sind die Membranen zu dicht beieinander, um gelöst werden, so dass sie in unilamellare Phasenkontrast oder DIC Bilder werden angezeigt. Jedoch können diese Gegenstände aus tatsächlichen unilame unterscheidenllar GUVs durch ihre Lipid Fluoreszenz, die zwei Mal (oder mehr) heller ist.
6. Patch-Klemm GUVs
- Stellen Sie Patch-Pipetten mit einer 1-2 um Spitzendurchmesser von Standard-Borosilikat-Glas-Kapillare mit Hilfe des Programms für die Pipette Abzieher empfohlen.
HINWEIS: Nur spezielle Behandlungen wie Feuerpolitur sind nicht erforderlich, und Pipetten können für mehrere Tage, nachdem sie zuvor gezogen, wenn sie in einer geschlossenen Box aufbewahrt werden. - Passivieren der Kammer durch Inkubation mit einem Beta-Casein-Lösung (5 mg / ml), um sicherzustellen, dass GUVs nicht anhaften, die Ausbreitung und Bruch an Kammeroberflächen. Spülen Sie das Kasein nach 5 min.
- Legen Sie die Masseelektrode, füllen Sie die Kammer mit Beobachtung Puffer übertragen 10 ul der GUV-Suspension, wie in Schritt 5.2 und 5.3 beschrieben, und ein paar Minuten warten, bis die GUVs am Boden absetzen.
- Füllen Sie einen frischen Patch-Pipette mit Lösung (Beobachtung Puffer oder anderen isoosmotisch Lösung) undbringen Sie es am Patch-Clamp-Verstärker heads.
- Suche durch die Kammer, um einen "fehlerfreie" GUV finden wie in Kapitel 5.4 beschrieben, und prüfen Sie ihn fluoreszierendes Protein enthält.
- Tragen Sie einen konstanten Überdruck (> 100 Pa oder ungefähr 1 cm H 2 O in einem Manometer), um die Patch-Pipette Innenraum sauber zu halten, und legen Sie die Patch-Pipette in die Kammer. Bringen Sie die Patch-Pipette in das Sichtfeld, gelten Testimpulse zur Messung / Kompensation der Pipette Spannungsoffset und Widerstand, und untersuchen Sie die Pipette unter Fluoreszenzbeleuchtung, um zu bestätigen, dass die Spitze sauber ist.
- Bringen Sie die Patch-Pipette auf die GUV und, falls erforderlich, den Überdruck gleichzeitig zu reduzieren, so das Ausströmen aus der Patch-Pipette macht nicht den GUV "Durchgehen". Wenn der Patch-Pipette in der Nähe des GUV gelten einen Unterdruck (bis zu 5 cm H 2 O), um das GUV gegen die Patch-Pipette zu ziehen. Überwachen Sie den Widerstand als "; Zunge "der GUV-Membran in die Patch-Pipette und die Gigaseal Formen.
- Wenn ein Gigaseal nicht gebildet hat, ziehen Sie den Patch-Pipette aus der Kammer und wieder mit Schritt 6.4. Wenn der Membranfleck bildeten eine undurchlässige, aber der GUV bleibt an der Pipette befestigt, herausschneiden den Patch, indem Sie von der GUV, platzt die GUV gegen den Kammerboden oder kurz Bewegen der Pipette aus der Lösung aus.
- Wenn der inside-out Membranfleck aus der GUV herausgeschnitten worden und die Gigaseal stabil ist, schalten Sie die Testimpulse und eine Spannung Protokoll wie die in Abbildung 13 dargestellt.
HINWEIS: Abbildung 13 folgt dem Standard elektroKonvention für eine Inside-Out-Patches, in der Strom in den Patch-Elektrode fließt, ist "positiv" und V = V-Bad - V Pipette. Halten Sie den Patch auf einem negativen Potential (zB V = -100 mV) für ~ 30 sec Stellen KvAP im Ruhezustand, während Schritte (100 ms bis 5 s) zu positiveren Potentialen (zB kann V = 100 mV), dann fahren sie in die Durchführung (dh offen) aktiv Staaten. - Nach Messungen an einer Membran-Patch fertig sind, brechen Sie den Patch mit zap oder Druckimpuls und prüfen, ob der Spannungsoffset des Patch-Elektrode nicht getrieben. Entfernen Sie die Patch-Pipette aus der Kammer, und kehren Sie zu Schritt 6.4.
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Representative Results
Das Wachstum GUVs schnell durch Untersuchen der Wachstumskammer unter dem Mikroskop ausgewertet werden. Für Elektroformation neigen die GUVs in Bündeln längs der Platindrähte wachsen, wie in Figur 4 gezeigt ist. Während Gel gestützten Schwellung, erscheinen GUVs als sphärische Strukturen, die schnell wachsen und miteinander verschmelzen (Abbildung 5).
Mangelfreien GUVs leichter identifiziert und nach der Übertragung auf eine Beobachtungskammer ausgewertet. Kalibrierungsmessungen erforderlich sind, rigoros auszuwerten GUV Qualität und eines systematischen Quantifizierung wurde zuvor 28 veröffentlicht worden. Doch als empirische Führer, "gut" GUVs sollten isoliert werden (dh nicht in einem Cluster), haben eine einzelne, glatte, sphärische äußere Membran, enthalten keine Gegenstände (zB Rohre, verschachtelt Vesikel, etc.) im Inneren, und haben die "Standard" Lipid Fluoreszenzniveau (heller Objekte in der Regel zwei- oder mehr sindLamellen). Abbildung 6 zeigt DIC und Epifluoreszenz Bilder eines "fehlerfreie" GUV nach dem Transfer auf ein isoosmotisch Glukoselösung. Der Kontrast in DIC ist aufgrund des Unterschieds in der optischen Dichte zwischen der Saccharose gefüllt GUV und Glucose enthaltenden Badlösung. Der Brechungsindexkontrast KvAP haltigen GUVs oft im Laufe der Zeit abnimmt, obwohl KvAP selbst sollte nicht durchlässig für Saccharose oder Glukose sein. Die gleichmäßige Proteinfluoreszenz in der GUV Membran bestätigt, dass KvAP in der GUV integriert (dh, es nicht in der Lipidfilm bleiben) und nicht im Mikrometermaßstab (oder größer) Aggregate gebildet.
Figuren 7, 8 und 9 zeigen konfokale Bilder der Lipid- und Proteinfluoreszenz von GUVs von der unteren Salzelektroformation Protokoll, physiologische Salzelektroformation Protokoll und Gel-unterstützte Quellprotokoll erzeugt. Die fluoreszierenden Lipids (magenta) und Protein(Grün) Signale auf den gleichen Durchschnittsintensität skaliert, so dass GUVs mit einer niedrigen / hohen Anzahl von Proteinen pro Flächeneinheit (Proteindichte) einen Magenta / Grün Schatten in den Overlay-Bilder (rechte Spalte), während GUVs mit ein durchschnittliche Proteindichte sind weiß. Isoliert, mangelfreien GUVs wurden identifiziert und die GUV Größenverteilung ist in 10 gezeigt. In der Regel Elektroformation produziert mehr fehlerfreie GUVs als Gel-unterstützte Schwellung, aber die durch Elektroformation produziert GUVs kleiner sind. Abbildung 11 zeigt die Proteindichteverteilung abgeleiteten aus der Fluoreszenz der GUVs. Elektroformation mit Hochsalzpuffer erzeugt GUVs wobei die Proteindichte variiert stark von GUV GUV. Die Proteindichte einzelner GUVs variiert viel weniger für Elektroformation mit Niedrigsalzpuffer, während die Proteindichte GUVs durch Gel-unterstützte Schwellung hergestellt ist bemerkenswert einheitlich.
Das Patch-Clamp-Technik ist eine weit verbreitete Verwendungd Verfahren zur Untersuchung der Funktion von spannungsabhängigen Ionenkanälen, wie KvAP. In "inside-out" Aufnahmen wird ein sauberes Glas "Patch" Pipette verwendet werden, um ein Stück Membran aus einer GUV herauszuschneiden. Eine Elektrode in der Patch-Pipette wird dann verwendet, um die Spannung über die Membran Patch anwenden, und messen die resultierende Strom fließt. Die Zusammensetzung der Membranfleck kann stark von dem Rest der Zelle / GUV 31 unterscheiden, aber die "inside-out" Konfiguration ist immer noch sehr nützlich für die Messung der Einzelkanalleitfähigkeit, die Ionenselektivität und spannungsabhängigen Steuerung. Diese drei Eigenschaften sind eine hervorragende Möglichkeit, festzustellen, dass Ströme nicht durch Artefakte (z Gigaseal Ausgaben) oder Verunreinigungen (zB bakterielle Porine von der Reinigung), und es Funktions KvAP Kanäle in den GUVs.
Kanalleitfähigkeit erfolgt am einfachsten in Flecken mit nur einem oder zwei aktiven Kanälen gemessen. Im example in 12 gezeigt ist, werden keine Kanalöffnungen beobachtet, wenn die Membran bei -100 mV gehalten wird, wohingegen bei +100 mV, können einzelne Kanalöffnungen deutlich aufgelöst werden. Die aktuelle Histogramm zeigt zwei Peaks, die den geschlossenen und den offenen Zuständen und Ausstattung mit einem doppelten Gauß-Funktion ergibt einen einzigen Kanalstrom von 10,9 ± 0,85 pA, entsprechend einer Leitfähigkeit von 109,2 ± 8,5 pS (in 100 mM KCl). Beachten Sie, dass die Einzelkanalleitfähigkeit ist abhängig von der Lösung (vor allem Kalium-Konzentration) und Membranzusammensetzung 32,33.
Wie viele andere K-Kanäle, individuelle KvAP Kanäle Ausstellung "klappern" Ausbrüche von schnellen Öffnen und Schließen. Wie zuvor gezeigt, kann Kaliumselektivität, indem eine andere Lösung in der Patch-Pipette getestet werden (zB Patch-Pipette Lösung 90 mM NaCl, 10 mM KCl) 28.
Spannungsabhängige Gating ist oft sin Flecken mit mehreren Kanälen tudied, um so ein Ensemble-Mittelwert leichter erhalten. Zwar gibt es keine offensichtliche Mechanismus begünstigt die physiologische (intrazelluläre Domäne auf GUV innen) und inverse (intrazelluläre Domäne auf der GUV Aussen) Einfügung KvAP in GUVs, in "inside-out" Membranflecken die Mehrheit der Funktionskanäle haben die " physiologische "insertion 28, Fig. 13 zeigt die Reaktion eines Membranpatch mehrere enthaltend (> 10) Kanäle mit einer Reihe von 5-Sekunden-depolarisierenden Stufen. Zwischen jedem Schritt wird der Patch bei -100 mV für 30 Sekunden gehalten, um Kanäle mit der "physiologischen" Einfügen in ihre Ruhezustand zurückzukehren. Wenn das Potential ausreichend negativ ist (zB V <60 mV) der meiste Strom ist aufgrund der Gigaseal Leck, und die gelegentliche Öffnungen von einem oder zwei Kanälen, die geeignet sind, die "inverse" Einfügen haben sind. Für Schritte, um weitere positive potentials immer mehr Kanäle beobachtet, bis es so viele, dass die einzelnen Öffnungen und Schließungen nicht mehr aufgelöst werden. Somit ist die Öffnungswahrscheinlichkeit des Kanals deutlich spannungsabhängig. Die Kinetik der KvAP Aktivierung und Inaktivierung unterscheiden sich erheblich zwischen Schwarzlipidmembranen (BLMs) 26 und GUVs, aber dies steht im Einklang mit früheren Berichten, dass Kv-Kanal-Gating kann empfindlich auf die Membranzusammensetzung und Zustand 34 ist.
Abbildung 1 Schematische GUV Elektroformation. Tröpfchen, die SUVs auf eine Elektrode abgeschieden partiellen Dehydratisierung der Lösung bewirkt, daß die SUVs zu verschmelzen, um einen Stapel von Membranen zu bilden. Der Puffer wird dann zugegeben, und ein elektrisches Wechselfeld angelegt wird. Da die Film schwillt an, lösen einzelnen Membranen aus dem Stapel zu GUVs zu bilden. (Diese Zahl wurde mod ified von Aimon et al. 28)
Abbildung 2. GUV Elektroformation Kammer. Die Kammer ist aus einem PTFE-Block mit drei Bohrungen (10 mm Durchmesser, 5 mm tief) eingefräst. Zwei 0,5 mm dicke Platin-Drähte werden um 3 mm (Kante an Kante entfernt) getrennt und nahe dem Boden der Kammer, um die Abbildung der Drähte zu erleichtern. Untere und obere Deckgläser werden anstelle mit Vakuumfett gehalten und Dichtpaste verhindert Leckagen aus den Drahtlöcher auf der Seite. Der Wechselstromgenerator wird mit Krokodilklemmen mit den Drähten verbunden. Die Kammer wird auf einer von Ernesto Ambroggio und Luis Bagatolli entwickelt wurde. (Diese Zahl ist von Aimon et al geändert worden 28.)
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Abbildung 3. Gel-unterstützte spontane Quellung Schema: Tröpfchen, die ein SUV-Suspension wird auf ein Agarosegel aufgebracht, wie das Tröpfchen trocknet die SUVs zu verschmelzen, um einen Lipidfilm zu bilden.. Wenn die Wachstums Puffer rührt die Folie rehydriert und GUVs bilden an der Oberfläche. GUVs wachsen bis zu einer Größe von ~ 10 & mgr; m durch das Anschwellen und Verschmelzen mit benachbarten GUVs.
Abbildung 4. Repräsentatives Bild DPhPC GUVs enthält KvAP wachsen auf dem Platindraht in einem Hochsalzpuffer. Die GUVs ähneln Trauben entlang des Drahtes. Phasenbild Kontrast mit einem 40X LWD Ziel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 5. DPhPC GUVs enthält KvAP Schwellung an Agarose-Gel. Die GUVs sind mit einem Durchmesser von ~ 10 & mgr; m als schwache Bereiche sichtbar. Die dunklen / hellen Flecken sind Lipid / Agarose-Aggregate, aus denen die Vesikel anschwellen. Phasenkontrast-Bild mit 40X LWD Ziel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 6. Bilder eines mangelfreien GUV. (Ei-PC: Egg-PA 9: 1 auf die Masse) KvAP mit Alexa-488 bezeichnet, die links: DIC, rechts: Alexa-488 Epifluoreszenz. Anregung: 470/50 nm, Emission: 545/75 nm. Beachten Sie die gleichmäßige Fluoreszenz von KvAP ohne sichtbare Aggregate. 81fig6large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 7. Die konfokale Bilder von Lipid (magenta) und Protein (grün) Fluoreszenz von elektro GUVs in einem Niedrigsalzpuffer gewachsen (Ei-PC: Egg-PA 9: 1 auf die Masse) (A) Die weißen Pfeile markieren (wahrscheinlich). GUVs, während der rote Pfeil markiert eine potenziell bi-Lamellen Vesikel mit höheren Lipid Fluoreszenz. Man beachte, dass die Fluoreszenzintensität in der Mitte heller dieses Bild wegen des extrem großen Sichtfeld. (B) Zoom zeigt eine kleine Gruppe von GUVs. Left (magenta): TexasRed-DHPE Anregung: 543 nm Laserlinie, Emission: 605/70 nm. Center (grün): KvAP mit Alexa-488-Anregung gekennzeichnet: 488 nm Laserlinie, Emission: 515/30 nm. Rechts: Überlagerung.oad / 52.281 / 52281fig7large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 8. Die konfokale Bilder von Lipid (magenta) und Protein (grün) Fluoreszenz von elektro GUVs in physiologischer Salzkonzentration gewachsen (Ei-PC: Egg-PA 9: 1 auf die Masse). (A) Die GUVs (weiße Pfeile zeigen wahrscheinlich unilamellare Beispiele) sind spärlicher im Vergleich zum geringen Salz Protokoll und kann sehr unterschiedliche Proteinkonzentrationen (roter Pfeil) zu haben. (B) Zoom zeigt eine kleine Gruppe von GUVs. Left (magenta): TexasRed-DHPE Anregung: 543 nm Laserlinie, Emissionen: 605/70 nm mittleren (grün): KvAP mit Alexa-488-Anregung gekennzeichnet: 488 nm Laserlinie, Emission: 515/30 nm. Rechts:. Overlay Bitte clecken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 9. Die konfokale Bild von Lipid (magenta) und Protein (grün) Fluoreszenz GUVs (DPhPC) durch Gel-unterstützte Schwellung mit einer physiologischen Salzkonzentration Puffer gebildet. GUVs zeigen eine homogenere Proteindichte als elektro GUVs mit physiologischer Puffer hergestellt. Left (magenta): BPTR-Cer 0,1% Anregung: 543 nm Laserlinie, Emission: 605/70 nm. Middle (grün): KvAP mit Alexa-488-Anregung gekennzeichnet: 488 nm Laserlinie, Emission: 515/30 nm. Rechts:. Zusammenführen der beiden Kanäle Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 11. GUV Protein Dichtehistogramme: Die Proteindichte (Anzahl von Proteinen pro Flächeneinheit) von GUVs galvanoplastisch mit Niedrigsalzpuffer (5 mM KCl, DPhPC) weniger variiert als bei physiologischer Salzkonzentration (100 mM KCl, Ei-PC: Ei -PA. 9: 1 auf die Masse) Der Proteindichte GUVs (DPhPC) durch Gel-unterstützte Schwellungen in physiologischer Kochsalzpuffer gewachsen zeigt die geringste Abweichung. Proteindichte proportional KvAP-A488 Fluoreszenzintensität für diesen Konzentrationen 28 und in jedem Histogramm die Fluoreszenzintensitäten werden durch den Mittelwert der Verteilung normalisiert. (Die Mitteltafel ist geändert worden,aus Aimon et al. 28)
Abbildung 12. Einzelkanalaktivität GUV Membran Patches (DPhPC "inside-out" Spannungs Konvention). Der GUV wurde in 100 mM KCl, 5 mM HEPES pH 7,4 auf Platindrähte gewachsen. Einzelkanäle nach dem Auftragen 100mV Potential auf der Patch geöffnet. Auf der rechten Seite des Einschub zeigt ein Histogramm verwendet, um die Einzelkanalleitfähigkeit zu berechnen. Die rote Linie ist eine Anpassung an eine Doppel Gaußfunktion mit Maxima bei 4,70 ± 0,27 pA und 15,62 ± 0,58 pA, entsprechend einer Leitfähigkeit von 109,2 ± 8,5 pS. Der Trace wurde bei 10 kHz mit einem 4-poligen Bessel-Filter gefiltert und bei 50 kHz erfasst.
Abbildung 13. Spannungs dependen t Gating-Kanäle in der Membran-Patch aus einer GUV auf Agarose in einem Puffer mit hohem Salz gebildet (DPhPC "inside-out" Spannungs Konvention). (A) Verhalten der Patch Membranstrom zu einer vorübergehenden Schritt in Spannung. Pipette und Badlösungen beide enthielt 100 mM KCl, und die Membran wurde für 30 Sekunden bei -100 mV zwischen aufeinanderfolgenden Spannungsschritten statt. Auf einer genauen Untersuchung kann man sehen, dass die Spur enthält 1 oder 2 Kanäle, die mit negativen Spannungen zu öffnen scheinen. Kleines Bild a) zeigt ein Zoom der verspäteten Öffnung und Einsatz b) der Schließverzögerung des Kanals. Die Ströme wurden mit einem 4-Pol-Bessel-Filter bei 10 kHz gefiltert und bei 51,3 kHz aufgezeichnet. Offline die Spur wurde auf 513 Hz abwärts abgetastet. Der negative Kapazität transiente wird bei -150 pA geschnitten. (B) Durchschnittsstrom (0,25 s <t <5 s) gegenüber der Stufenspannung. Ströme bei positiven Spannungen größer sind, da die Kanalöffnungswahrscheinlichkeit spannungsabhängig ist.iles / ftp_upload / 52.281 / 52281fig13large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Biomimetische Modellsysteme sind ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung der Eigenschaften und Wechselwirkungen von Proteinen und Membranen. Im Vergleich zu anderen wiederhergestellten Systeme wie BLMs oder unterstützte Lipidmembranen, GUV-basierte Systeme weisen mehrere Möglichkeiten, wie zB erhebliche Kontrolle über die Zusammensetzung der Membran, Spannung und Geometrie, sowie als wahrhaft ölfrei. Einbeziehung Transmembranproteine, wie KvAP in GUVs Jedoch erfordert erhebliche Anpassungen herkömmlicher Protokolle für lipid nur GUVs. Die hier vorgestellte Elektroformation Protokoll wurde bisher gekennzeichnet und für die Untersuchung der biophysikalischen Prinzipien der Membranprotein Verteilung und Dynamik in gebogenen Membranen 2,4,35 verwendet. Diese Arbeit zeigt, ein neues Gel gestützten Schwellung Protokoll, zusätzlich zu der Menge von Methoden zur Protein Rekonstitution in GUVs. Beide Protokolle können fehlerfreie GUVs mit hohen Dichten von KvAP und Messungen an Inside-Out-Patches erzeugen bestätigen, dass diese GUVs funktionelle Kalium-selektiven, spannungsabhängigen Kanälen.
Beide Ansätze haben unterschiedliche Stärken und Schwächen. Bei Niedrigsalzbedingungen eingesetzt werden können, bietet Elektroformation einen guten Kompromiss zwischen GUV Ausbeute und gleichmäßige Proteindichte. Elektroformation gibt noch vernünftige Ausbeuten mit physiologischer Salzkonzentration, aber die Proteindichte kann stark zwischen GUVs variieren (siehe 8 und 11). Die Dichteschwankungen scheinen auf die Dauer der Elektroformation verbunden werden, wie Niedrigsalzpuffers Wachstum kann auch wesentliche Dichteschwankungen, wenn das Wachstum fort viel länger als 2 Stunden. Im Gegensatz dazu GUVs durch Gel-unterstützte Schwellung erzeugt haben eine bemerkenswert gleichmäßige Proteindichte, auch für physiologische Puffer. Jedoch ist der Anteil von multilamellaren Vesikeln grßer und Agarose Autofluoreszens verkompliziert Quantifizierung niedriger Proteindichten 16. Verwendung von Polyvinylalkohol in place Agarose wurde berichtet, dass das Gel-unterstützte GUV Ausbeute zu verbessern, wenn Lipide wurden aus Chloroform 20 abgeschieden, jedoch konnte das GUVs Verwendung von Polyvinylalkohol mit SUV Lösungen. Wenn eine geringere Ausbeute an fehlerfreie GUVs akzeptabel ist, hat Gel-unterstützte Schwellung einen klaren Vorteil für Experimente, die eine einheitliche Proteinverteilung erfordern.
Elektroformation und Gel-unterstützte Schwellung haben auch ganz andere Anforderungen an die Ausrüstung. Das Gel-unterstützte Schwellung Protokoll nutzt wenig spezialisierte Ausrüstung außer dem Plasma-Reiniger, die nicht wesentlich ist, da es viele alternative Methoden, um saubere, hydrophilen Glas herzustellen. Im Gegensatz dazu benötigt ein eigenes Elektroformation Kammer mit Drahtelektroden. Platindraht ist teuer, aber für dieses Protokoll GUVs wuchs leichter mit Platin als Titandrähten und GUVs nicht auf ITO wachsen bei Verwendung physiologischer Salzkonzentrationen gleitet. Der Durchmesser der Elektroden (0,5 mm) ist ein comprOmiše zwischen Elektrodenoberfläche und Preis. Die in Abbildung 2 dargestellt Kammer nach einem Entwurf von Luis Bagatolli 15 und Ernesto Ambroggio basieren, und wurde aus Polytetrafluorethylen (PTFE) bearbeitet, damit die Reinigung mit den meisten Lösungsmitteln. Jedoch sollte Polyacetal oder Polyvinylchlorid (PVC) auch gut funktionieren. Die Fähigkeit, die Platindrähte für aggressive Reinigungs entfernen ist wichtig, und wenn erst zu lernen, das Protokoll, ist es sehr hilfreich, GUV Wachstum in situ durch die untere Deckglas beobachten. Die kleineren, geschlossenen Brunnen verhindern Lösung von schwappt hin und her und auch Tests von mehreren Lipidzusammensetzungen parallel zu erlauben. Allerdings ist eine spezielle kundenspezifische Kammer nicht notwendig, wenn ausgehend. Beispielsweise können einfache, einzelne Vertiefungen Kammern durch Heften zwei Drähte bis auf den Boden einer kleinen Petrischale oder mit Siegellack auf Sandwich sie zwischen zwei Glasobjektträger oder einfach Stossen sie durch den Deckel eines kleinen Fläschchen improvisiert werden.
Sowohl der Elektroformation und Gel-unterstützte Schwellungen Protokolle sollten eine ausreichende Anzahl von mangelfreien GUVs für die Mikromanipulation und Patch-Clamp-Experimente erzeugen. Jedoch hängt die GUV Ausbeute empfindlich auf die Bildung der Doppelschicht, wenn der Stapel SUV-Lösung wird teilweise dehydriert. Wenn Schwierigkeiten bei wachsenden GUVs aufgetreten (dh keine oder nur wenige GUVs in der Wachstumskammer sichtbar sind), kann es sehr hilfreich sein, lipid nur GUVs mit einem Lipid / Chloroform-Lösung anstelle von SUVs 15,16 wachsen (und eine niedrige Salzpuffer). Wenn GUVs nicht gut aus einer Lipid / Chloroform-Film wachsen dann etwas Grundlegendes falsch ist (zB falsche Lipidlösungen oder Puffern, Fett oder Schmutz auf den Elektroden, falsche Spannung oder Frequenz, etc.). Wenn GUVs wachsen von Lipid / Chloroform-Filmen, aber nicht den SUV-Filme, ist wahrscheinlich mit dem teilweise Wasser entzogen werden jedoch die Frage.
Die teilweise Entwässerungsschritt istVerwendung lipid nur SUVs, weil es keine Gefahr des "Denaturierung" Lipide durch exzessive Dehydrierung am einfachsten optimiert. Für Elektroformation, kann es hilfreich sein, um die Drähte zu untersuchen, nachdem die SUV Tröpfchen wurden trocknen gelassen, um zu überprüfen gibt es helle Lipid Fluoreszenz an jedem Ort, an dem ein Tröpfchen abgeschieden. Wenn die Lipid Fluoreszenz verschwindet nach der Kammer mit Wachstumslösung gefüllt, so ist entweder die Wachstumslösung muss mehr vorsichtig zugegeben werden, oder die SUVs benötigen länger, so dass die Folie misst mehr fest mit dem Draht zu entwässern. Während des Wachstums, stellen Sie sicher, weder die Drähte noch Lösung bewegen sich innerhalb der Kammer (zB bei Inbetriebnahme der Kammer am Mikroskop) zu vermeiden Strippen GUVs aus den Drähten. Wenn GUVs gut wachsen, sind sie in der Regel leicht zu Phasenkontrast-Bilder zu sehen. Jedoch sind kleinere GUVs oft klarer mit Lipid Fluoreszenz, die auch nützlich für das Sehen, wie der Membranstapel während des Wachstums verändert. Überprüfen Sie alle Oberflächendie Drähte (innen, außen, oben und unten) in alle Vertiefungen sowie der Kammerboden vor der Entsorgung das Wachstum, weil die Renditen wesentlich von einem Ort zum anderen variieren.
Die Handhabung und Lagerung von GUVs ist einfach im Vergleich zu Zellen, sondern GUVs sind sehr empfindlich auf osmotischen Stress, Scherkräfte und Haftung. Glatte, sanfte Bewegungen sind wichtig bei der Ernte oder die Übertragung GUVs, und es ist wichtig, um Oberflächen zu GUVs von anhaftenden und explodier verhindern zu passivieren. Jedoch für Patch-Clamp-Experimenten die Kammer gründlich nach der Passivierung gespült werden, so dass der Passivierungslösung nicht Mantel auf die Patch-Pipetten und verhindern Gigaseal Bildung. Zur Passivierung, einfach und effektiv, und im Vergleich zu Rinder-Serumalbumin, das eine Lipidtransportfunktion hat, ist das beta-Casein Behandlung hat begrenzte Interaktion mit Lipiddoppelschichten und sollte dann bevorzugt, wenn die Arbeit mit GUVs 36 werden Beta-Casein. Durch Variation der Inkubationszeit ist esmöglich, zu erhalten, um ohne zu explodieren GUVs haften. Jedoch werden die GUVs nicht dem Abdeckschieber so fest wie Zellen anhaften, und deshalb ist Sorgfalt bei jeder Prozedur, die Strömung in der Kammer zu induzieren können (beispielsweise Puffer Perfusion Bewegen der Kammer) noch entnommen werden.
Patch-Clamp-Aufzeichnung ist eine klassische Methode zur Untersuchung von spannungsabhängigen Ionenkanälen wie KvAP und das Protokoll wird von Standard-Techniken zur Herstellung von "inside-out" Patches von anhaftenden Zellen. Ein Standard-Patch-Clamp-Aufbau, in dem der Patch-Pipette steigt schräg (beispielsweise 30-60 Grad von der Horizontalen) in eine kleine Petrischale sollte gut funktionieren. Allerdings können klarere Bilder von der Patch-Pipette und Gigaseal Region mit einer Kammer, in der Deckgläschen bilden die Kammer oben und unten (~ 1 mm Abstand), so die Patch-Pipette von der Seite horizontal geben erhältlich. Da große Patch-Pipette Druck nicht benötigt werden, kann die Druck bequem c seinmit einer Spritze und feuere mit jedem einfachen Druckmessgerät (zB improvisierte Wassermanometer) überwacht. Es kann hilfreich sein erstes Training Patch-Clamp-Experimente mit lipid nur GUVs gewachsen mit einem Lipid / Chloroform-Lösung und Niedrigsalzpuffers sein. Da die Ausbeute an fehlerfreie GUVs sehr hoch ist, wird es viel perfekte GUVs sein, mit, auch wenn viele während der Ernte und Transfer zum Experimentierkammer zerstört zu arbeiten.
Mit ein wenig Übung können herausgeschnitten Membranflecken mit stabilen Gigaseals leicht aus DPhPC GUVs und KvAP-DPhPC GUVs erhalten. Um eine hohe Erfolgsquote zu erzielen, ist es hilfreich, sorgfältig auszuwählen, rund, sondern leicht-schwankenden, fehlerfreie GUVs und überprüfen, ob der Patch-Pipette ist sauber (auf der Suche nach Lipide in Fluoreszenz), bevor Sie den Gigaseal zu bilden. Wenn eine Membran "Zunge" in die Patch-Pipette bildet der Gigaseal normalerweise schnell (<1 s) ohne Notwendigkeit einer starken Saug- oder spezific Haltespannung. Während eine schlechte Dichtung zu verbessern, wie die Membran kriecht weiter in die Patch-Pipette, die oft die Dichtung bleibt arm, weil die Pipette Innen verunreinigt war und es notwendig ist, wieder mit einem neuen Patch-Pipette und GUV zu starten. DPhPC Formen sehr stabile Membran-Patches (zehn Minuten) mit einer ausgezeichneten Dichtung Beständigkeit auch bei hohen Spannungen (zB ± 150 mV). SOPC: Cholesterol (3: 1 bezogen auf Mol) können auch sehr stabile Pflaster bilden, jedoch können höhere Saugwirkung erforderlich zu versiegeln, während Ei-PC Flecken scheinen leichter brechen.
Für längere patch-clamp-Sitzungen kann es notwendig sein, die Osmolarität der Kammer-Lösung anzupassen. Wenn die Osmolarität zu viel niedriger als der GUV Wachstumspuffer, GUVs geschwollen, gespannt und kugelförmig und kann es nicht möglich sein, die GUV Membran weit genug in die Patch-Pipette absaugen, um eine undurchlässige bilden. Dies kann oft durch einfaches warten 10 oder 20 min nach Verdunstung aus der Kammer befestigt werden erhöht die extern Lösung Osmolarität, bis die GUVs entleeren und beginnen zu schwanken. Umgekehrt, wenn die Kammer zu lange offen gelassen die Osmolarität der externen Lösung zu erhöhen, bis GUVs entleeren, tubulate und Knospe. Dies kann durch Blockierung Verdampfung aus der Kammer (beispielsweise mit Mineralöl) oder periodisch Zugabe von destilliertem Wasser, um das Wasser, das verdampft ist, ersetzen zu vermeiden.
Da Proteine können aus abgetrennten Membranflecken 31 ausgeschlossen werden, die Anzahl aktiver Kanäle in einem ausgeschnittenen Flecken ist nicht nur auf die Dichte des Proteins in der GUV Membran bezogen. Fluoreszenz-Messungen deuten darauf hin, die Konzentration KvAP im Patch-Membran ist wesentlich geringer als der GUV 28 und kann es ziemlich einfach, Patches enthalten nur eine geringe Anzahl von Kanälen zu erhalten. Wenn jedoch Pflaster enthalten zu viele Kanäle für Einzelkanalaufzeichnung, die offensichtlichen Schritte Patchpipetten mit kleineren Spitzen und / oder Senken des Proteins zu Lipid dichte im SUV-Mix sind wirksam. Im Gegensatz zu Ensemblemessungen auf Patches, die viele Kanäle durchzuführen, kann es hilfreich sein, mit einem relativ hohen Proteindichte zu starten (zB 1:10, Protein-Lipid-Gewichtsprozent), verwenden Sie Protein Fluoreszenz GUVs mit einem hohen Proteindichte wählen Verwenden Sie größere Patch-Pipetten (zB 2 bis 3 Mikrometer Spitzendurchmesser) und saugen Sie schnell, um zu versuchen, um die Dichtung rasch zu bilden. Offensichtlich ist die "whole-cell" -Typ-Konfiguration (dh 'Voll GUV) wäre ideal, um alle Kanäle in einer GUV zu charakterisieren, aber leider ist die "Voll GUV" Konfiguration stellt einige technische Probleme 37.
Die Lösungen, Lipide und Protein-Konzentrationen in dieser Anleitung dienen lediglich als Ausgangspunkt zur Verfügung gestellt und kann geändert werden, um die Bedürfnisse einer bestimmten Experiment nach einigen Überlegungen zu entsprechen.
Alle Lösungen sollten einen pH-Puffer, wie HEPES umfassenoder TRIS sicherzustellen Proteine nicht zu extremen pH-Werten ausgesetzt wird. Die SUV Puffer sollte eine möglichst geringe Konzentration an gelösten Stoffen wie das Protein haben tolerieren (zB 5 mM Salz oder weniger), da Konzentrationen an gelösten Stoffen erhöhen während der partiellen Dehydratisierungsschritt und hohe Salzkonzentrationen, kann das Protein denaturieren oder bewirken, daß die Lipid-Film schnell Delaminieren während der Rehydratisierungsschritt. Geringe Mengen an Zucker, wie Trehalose (beispielsweise 1 mm bis 5 mm), wird angenommen, dass das Protein während der Dehydratisierung 23 zu schützen. Während Trehalose in Anhydrobiose gebracht worden und es wird angenommen, Membranproteine und gegen Austrocknung 38 zu schützen, kann Saccharose oder Glucose gleichermaßen gut funktionieren.
Für das Wachstum Puffer, die Salzkonzentration besonders wichtig, da dies die Parameter für eine optimale Wachstums GUV (zB Elektroformation Spannung, Frequenz und Dauer) zu beeinflussen. Im Gegensatz dazu ist die primäre Einschränkung für die Beobachtung Puffer tHat es sollte die gleiche Osmolarität als Wachstums Puffer. Die Aufnahme von Saccharose und / oder Glucose in der "Wachstums Puffer" und "Beobachtungs Puffer" kann nützlich sein, GUVs Sediment am Boden der Beobachtungskammer zu gewährleisten, während eine Differenz im Brechungsindex zwischen GUV Innen- und Außen hilft mit Phasenkontrast oder DIC-Mikroskopie. Elektrophysiologen enthalten oft Calcium- oder Magnesiumionen in die Badewanne und / oder Patch-Pipette Lösungen Gigaseal Bildung mit Zellmembranen zu erhöhen, aber diese werden nicht angezeigt, die für GUVs sein. Tatsächlich können zweiwertige Ionen wie Magnesium und Calcium Lipidphasentrennung zu induzieren und die Adhäsion zu erleichtern, so dass, wenn diese Probleme auftreten kann es hilfreich sein 1 mM EDTA zuzusetzen.
Offensichtlich ist ein Schlüssel Anziehung des rekonstituierten Systemen im Vergleich zu Zellen die Fähigkeit, Lipid-Zusammensetzung zu steuern. DPhPC GUVs gut zu wachsen und bilden stabile geschnitten Membranflecken, und diese Protokolle habe auch effektiv zur Lipidmischungen, die Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylglycerin (PG), Phosphatidsäure (PA), Phosphatidylserin (PS) und Cholesterin. Jedoch ist GUV Wachstum empfindlich sowohl Lipidzusammensetzung und puffert 15 und so Protokollparameter (zB Lipidmenge abgeschieden Elektroformation Spannung / Frequenz) eventuell auf Lipidmischungen mit hohen Konzentrationen an PE eingestellt werden, geladene Lipide (PG, PA, PS), oder Cholesterin. Beim Anfahren aus, Ei-PC, DOPC oder DPhPC sind eine gute erste Wahl, und es ist auch sehr hilfreich, um ein fluoreszierendes Lipid umfassen GUV Wachstum zu beobachten und GUVs aus multilamellaren Vesikeln mit zwei oder mehr Doppelschichten unterscheiden. Lipidgemische können durch Kombinieren SUV-Suspensionen von Stammlösungen hergestellt werden, wie die Lipide während der partiellen Dehydratisierungsschritt (vorausgesetzt die Temperatur höher ist als jede einzelne Phasenübergangstemperatur) zu mischen. Mit höheren SUV-Konzentration (zB10 mg / ml), Stammlösungen ermöglicht beträchtliche Flexibilität, und diese können dann zu 3 mg / ml vor der Dehydratisierung der Suspension zu verdünnen.
Wenn versucht wird, diese Protokolle auf andere Transmembranproteine anzupassen, ist es sehr wichtig, in der Lage sein, sowohl direkt in den GUVs und Testproteinfunktion zu beobachten die Inkorporation des Proteins. Obwohl es kein Problem mit KvAP, besteht immer die Möglichkeit, dass während der Rehydratisierung Schritt die Transmembranprotein wird in den Membranstapel, die zur Bildung von Lipid-only GUVs bleiben. Fluoreszenzmarkierung des Proteins ist sehr praktisch, da es eine schnelle und eindeutige Art und Weise, um Protein Einarbeitung in GUVs beobachten und auch für die Aggregation zu überprüfen innerhalb GUVs. Es ist auch sehr wichtig, um die Proteinfunktion, GUVs testen, um zu bestätigen, dass das Protein während der Rekonstitution beschädigt. Für Ionenkanäle wie KvAP können Patch-Clamp-Messungen das Vorhandensein von funktionellen Kanälen in die zu etablierenGUVs. Jedoch kann ein fluoreszierend markierten, hochaffine Liganden (zB Toxin Substrat oder Antikörpers) wäre auch sehr nützlich für das Testen des Zustandes von Proteinen in GUVs.
Zusammenfassend diesem Artikel veranschaulicht Proteo GUVs mit dem spannungsgesteuerten Kaliumkanal KvAP herzustellen und zu charakterisieren, sie mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie und Elektrophysiologie. Hoffentlich werden diese Methoden können neue Klassen von Membranproteinen angepasst werden und bieten eine Grundlage für komplexere In-vitro-Systeme für das Studium und den Aufbau lebender Materie aus ihrer Grundkomponenten.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
| Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
| 18:1 (Δ9-cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| Cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
| TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | labeled lipid |
| BPTR-Ceramide | Invirtogen | D-7540 | labeled lipid |
| Choloroform | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
| Acetone | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
| Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Bonaduz AG | diverse | |
| Amber vials and Teflon cups | Sigma | SU860083 and SU860076 | |
| Parafilm | VWR | 291-1214 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | diverse | |
| Agarose | Euromex | LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C) | |
| Sucrose | Sigma | 84097-1kg | |
| Glucose | Sigma | G8270-1kg | |
| Trehalose | Sigma | T9531-25G | |
| KCl | Sigma | P9333-1kg | |
| Hepes | Sigma | H3375-100G | |
| TRIS | Euromex | EU0011-A | |
| Osmometer | Wescor | Vapro | |
| pH meter | Schott instruments | Lab850 | |
| Sonicator | Elmasonic | S 180 H | |
| Syringe filter 0.2 µm | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
| Function generator | TTi | TG315 | |
| Platinum wires | Goodfellow | LS413074 | 99.99+%, d = 0.5 mm |
| Polytetrafluoroethylene | Goodfellow | ||
| Dow Corning 'high vacuum grease' | VWR | 1597418 | |
| sealing paste | Vitrex medical A/S, Denmark | REF 140014 | Sigillum Wax |
| Cover slides 22 x 40 mm No1.5 | VWR | 631-0136 | |
| Cover slides 22 x 22 mm No1.5 | VWR | 631-0125 | |
| Plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | airplasma, setting 'high' |
| Petri dishes | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cm x 1 cm |
| patch clamp amplifier | Axon instruments | Multiclamp700B | |
| DAQ Card | National Instruments | PCI-6221 | |
| Labview | National Instruments | version 8.6 | |
| Glass pipettes boro silicate OD 1 mm ID 0.58 mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
| Electrode holder | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| Pipette puller | Sutter | P-2000 | |
| Camera | ProSilica | GC1380 | |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axiovert 135 | |
| Objective | Zeiss | 40X long working distance, Phase contrast | |
| Objective | Zeiss | 100X Plan-Apochromat NA 1.3 | |
| Filterset GFP (for Alexa-488) | Horiba | XF100-3 | |
| Filterset Cy3 (for TexasRed) | Horiba | XF101-2 | |
| beta-casein | Sigma | C6905-1G | |
| Confocal microscope | Nikon Eclipse TE 2000-E | D-Eclipse C1 confocal head | |
| Objective | Nikon | Plan Fluor 100X NA 1.3 | |
| Matlab | Mathworks | for image processing and analysis of the current traces |
References
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