Summary
Rekonstituering av trans protein, KvAP, i gigantiske unilamellære blemmer (GUVs) er vist for to dehydrering-rehydrering metoder - electroformation og gel-assistert hevelse. I begge fremgangsmåter, er små unilamellære vesikler som inneholder proteinet smeltet sammen for å danne GUVs som kan deretter bli undersøkt ved fluorescens mikroskopi og patch-clamp elektrofysiologi.
Abstract
Giant unilamellær Blemmer (GUVs) er en populær biomimetisk system for å studere membranassosiert fenomener. Imidlertid, som vanligvis brukes protokoller til å vokse GUVs må modifiseres for å danne GUVs som inneholder funksjonelle transmembranproteiner. Denne artikkelen beskriver to dehydrering-rehydrering metoder - electroformation og gel-assistert hevelse - å danne GUVs inneholder spennings gated kalium kanal, KvAP. I begge fremgangsmåter, er en oppløsning av protein-inneholdende små unilamellære vesikler delvis dehydratisert for å danne en stabel av membraner, som deretter tillatt å svelle i en rehydrering buffer. For electroformation fremgangsmåte blir filmen avsettes på platinaelektroder, slik at en vekselfelt kan brukes under film rehydrering. I motsetning til dette, benytter den gel-assistert svellende fremgangsmåte en agarosegel substrat for å forbedre film rehydrering. Begge metoder kan produsere GUVs i lave (f.eks, 5 mm) og fysiologiske (f.eks 100 mm) saltkonsentrasjoner. De resulterende GUVs er preget via fluorescens mikroskopi, og funksjonen av rekonstituert kanaler målt med innsiden ut patch-clamp konfigurasjon. Mens svelling i nærvær av et vekslende elektrisk felt (electroformation) gir et høyt utbytte av feilfrie GUVs, produserer den gel-assistert svellende fremgangsmåte en mer homogen proteinfordeling, og krever ikke noe spesielt utstyr.
Introduction
Når studere de fysiske prinsippene som styrer levende systemer, bottom-up tilnærminger tillate en experimentalist å kontrollere systemet sammensetning og andre parametere som ikke er lett manipulert i cellebaserte systemer 1. For membranbaserte prosesser, har Giant unilamellær Blemmer (GUVs, diameter ~ 1-100 mikrometer) vist seg å være et svært nyttig biomimetisk system 2 - 7 som de er godt egnet for mikroskopi studier og micromanipulation 8-10. Mens det er mange forskjellige protokoller for å produsere GUVs, de fleste faller inn i to kategorier - emulsjon basert nærmer 11,12 og teknikker basert på rehydrere et lipid film 13-16. I emulsjonsbaserte fremgangsmåter, er de indre og ytre brosjyrer av Guv membraner sammen i rekkefølge fra lipid monolag ved vann / oljegrenseflater. Denne tilnærmingen er ideell for innkapsling av vannløselige proteiner medi GUVs, og for dannelse av GUVs med asymmetrisk paknings lipid sammensetning. Imidlertid kan GUVs dannet fra emulsjonene beholder spor av løsningsmiddel som endrer membranens mekaniske egenskaper for 17, og tilnærmingen er ikke særlig godt egnet til trans-membranprotein rekonstituering.
Film rehydrering metoder er avhengige av det faktum at tørking (dehydrering) forårsaker mange lipid-blandinger til å danne et multi-lamellære stabel av membraner. Dersom denne stabel blir deretter plassert i kontakt med en vandig buffer, blir membranene i stabelen beveger seg fra hverandre som oppløsningsmiddel flyter mellom dem, og på overflaten av stabelen, kan individuelle membraner løsner å danne GUVs 13,18 (samt en veritabel zoo andre lipidic objekter). Men selv for optimale buffer og lipid komposisjoner, har denne klassiske "spontan hevelse" metode en relativt lav avkastning av feilfrie GUVs. En mye brukt metode for å øke utbyttet av feilfrie GUVs er "electroformation221 ;, i hvilken en vekselstrøm (AC) felt påføres på film rehydrering. Mens mekanismen forblir dårlig forstått, "electroformation" kan gi fantastisk Guv utbytter (> 90% under gunstige forhold) for lav saltkonsentrasjon buffere (<5 mM) 14,19, og kan også arbeide i fysiologiske buffere (~ 100 mM) under anvendelse av en høyere frekvens (500 Hz versus 10 Hz) AC-feltet og platina elektroder 15. En alternativ tilnærming for å øke utbyttet av feilfrie GUVs er "gel-assistert svelling", der lipidoppløsningen er avsatt på en polymer gel substrat i stedet for den passive (for eksempel glass, PTFE) substrater anvendt i klassiske "spontan svelling ". Når den resulterende lipid / gel-filmen er rehydrert, kan GUVs raskt danner selv for fysiologiske buffere 16,20.
Alle disse metoder kan produsere lipid-bare GUVs som kan brukes til å studere membran forbundet fenomener sominteraksjon mellom løselige proteiner og membraner. Imidlertid, for å innlemme et trans-membranprotein i GUVs, er betydelige modifikasjoner for å sikre at proteinet forblir i en funksjonell tilstand gjennom omdanningsprosedyren. Mens oppløsninger av lipider i organiske løsningsmidler (f.eks, kloroform, cykloheksan) er ideelle for fremstilling av lipid-film, trans-membranproteiner er typisk bare stabile når deres hydrofobe transmembrandomenet er innleiret i et lipid-dobbeltlag, eller omgitt av en detergent micelle ( for eksempel i løpet av protein rensing). Således er utgangsmaterialet for en rekonstituering typisk innfødte membraner, renset protein i en detergentoppløsning, eller små unilamellære proteinholdige vesikler (Proteo-SUVer) og / eller multi-lamellære vesikler (proteo-MLV) ble dannet ved fjerning av detergent i tilstedeværelse av lipider. De fleste metoder for å innlemme disse membran proteiner i GUVs faller inn i tre kategorier.
Direkte Insertion: Trans-membran protein suspendert i vaskemiddel er blandet med pre-formet, lipid-bare, mildt vaskemiddel solubiliserte GUVs, og vaskemiddel deretter fjernes ved hjelp biobeads 21. Mens konseptuelt enkel, denne metoden krever nøyaktig kontroll av konsentrasjonen vaskemiddel, som for høy konsentrasjon vaskemiddel kan oppløse GUVs mens for lav konsentrasjon kan føre til proteinet for å brette eller aggregat.
GUV / Proteo-SUV Fusion: Protein i Proteo-SUVer er kombinert med pre-formet, lipid-bare GUVs og fusjon er tilrettelagt med spesielle fusogene peptider 22 eller vaskemiddel 21. Vanligvis omfanget av fusjon er begrenset fører til GUVs med lavt proteintetthet.
Dehydrering / Rehydrering: Et protein inneholdende lipid film blir dannet ved delvis dehydratisering av en proteo-SUV (eller proteo-MLV) løsning og GUVs dyrkes så som for en ren lipidfilm. Den åpenbare utfordringen er å beskytte protein under den delvise dehydratipå trinn 23, men metoden har blitt brukt til å rekonstituere trans-membran proteiner som Bakteriorodopsin, kalsium-ATPase, Inte og VDAC inn GUVs 7,23 - 25.
Denne artikkelen beskriver dehydrering / rehydrering protokoller for å gjøre GUVs inneholder spennings gated kalium kanal, KvAP, fra den hyper-varmekrevende Archaea, Aeropyrum pernix. KvAP har en høy grad av homologi til eukaryote spenningsavhengige kaliumkanaler 26 og en kjent krystallstruktur 27 , noe som gjør det en god modell for å studere mekanismen av spennings gating. Produksjonen av de Proteo-SUVer har blitt beskrevet i detalj tidligere, og er ikke en del av denne opplæringen 26,28,29. Viktigst, KvAP Proteo-SUVer ikke å bli produsert for hver GUV preparat, som de kan lagres i små (for eksempel 10 mikroliter) alikvoter ved -80 ° C i lengre tidsperioder (> 1 år). Electroformationeller gel-assistert hevelse kan deretter brukes til å vokse GUVs fra KvAP Proteo-SUVer (eller proteo-MLV).
De viktigste fremgangsmåten for electroformation protokollen er vist i figur 1. Dråper av en oppløsning av SUV inneholdende proteinet avsettes på platinatråder (vist i figur 2). Delvis dehydrering av SUV-suspensjonen fører til dannelse av en lipid proteinfilm ved fusjon av SUVer. Under rehydratisering, er en AC-feltet påtrykkes elektrodene for å bistå lipid lagene å delaminere og danner GUVs. Et felt 10 Hz fungerer godt når du bruker "low-salt" (<5 mm) rehydrering buffer 28 og GUVs ta flere timer å vokse. I motsetning til dette, fysiologiske buffere (inneholdende ~ 100 mM salt) fungere godt med en lavere spenning, 500 Hz AC-feltet, men krever en langvarig (~ 12 timer) svellende periode 15. Denne metoden er basert på en tidligere protokollen med ITO glir 24, men bruker en tilpasset kammer fortsinnelukker to platinatråder som vist i figur 2 (se diskusjonen for designdetaljer og forslag til enklere, improvisert kamre).
Figur 3 illustrerer den gel-assistert svelling metode. Protokollen fungerer godt med buffere med fysiologiske saltkonsentrasjoner, er hurtig, og produserer GUVs med en mer homogen proteinfordeling. Men (det vil si, er at GUV membran uniform på optiske lengde-skalaer og ikke vedlegge gjenstander) utbyttet av isolerte, tilsynelatende feilfrie GUVs er lavere, selv om det gir et tilstrekkelig antall for patch-clamp og mikro-manipulasjon eksperimenter . Metoden var basert på en protokoll ved hjelp av agarosegel for å produsere lipid-bare GUVs 16 og krever mindre spesialisert utstyr enn electroformation metoden.
Karakteriseringen av GUVs med fluorescensmikroskopi er beskrevet, samt fremgangsmåter ved bruk av en standard patch-clamp set-up tomåle KvAP aktivitet i "inside-out" utskåret membran patcher.
Voksende proteinholdig GUVs kan være vanskeligere enn lipid-bare GUVs. Spesielt kan den endelige GUV utbytte avhenger følsomt av nøyaktig hvordan SUV oppløsningen avsettes og dehydratiseres for å danne membranstabelen. For noen uten noen tidligere erfaring med GUVs, kan det være nyttig først å vokse lipid-bare GUVs etter en konvensjonell protokoll 15,16 hvori membranfilmen dannes ved avsetning av lipider i et organisk oppløsningsmiddel. Når den konvensjonelle protokollen fungerer godt, kan SUV deponering og delvis dehydrering da bli mestret ved hjelp av lipid-bare SUVer, som også er veldig nyttig når du justerer protokollen for en ny fettsammensetning. Når GUVs vokse pålitelig fra lipid-bare SUVer, er det da bare et lite skritt for å produsere proteinholdig GUVs fra Proteo-SUVer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Løsning Forberedelse
- Forbered 5 ml "buffer SUV 'inneholdende 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) eller TRIS (pH 7,5), og 2 mM trehalose. Filtrere buffer med en 0,2 mikrometer sprøyte filter og dele inn i en ml porsjoner som kan lagres ved -20 ° C.
MERK: Ytterligere detaljer for reagenser og instrumenter er gitt i listen over materialer. - Forbered 40 ml GUV 'Vekst Buffer' som vil fylle GUV interiøret under film rehydrering. For en "lite salt 'vekst, kombiner 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) og 1 mM TRIS (pH 7,5), og ~ 400 mM sukrose. For en "fysiologisk salt 'vekst, kombiner 100 mM KCl, 5 mM HEPES (pH 7,4) og 5 mM TRIS (pH 7,5), og ~ 200 mM sukrose.
- Forbered 40 ml "Observation Buffer 'for den eksterne løsningen i forsøkskammeret ved å kombinere 100 mM KCl, 5 mM HEPES (pH 7,4) og 5 mM TRIS (pH 7,5), og ~ 200 mM glukose.
MERK: Disse buffere er bare examples. Se diskusjonen å tilpasse buffere for andre eksperimenter. - Mål osmolarities av veksten og observasjons buffere med en osmometer. Legg granuler av sukrose eller glukose for å sammenstille dem er minst 1%, slik at GUVs ikke vil lysere eller kollapse når de overføres fra vekstkammeret til observasjonskammeret.
MERK: I denne konsentrasjonsområdet, og legger en mM av sukrose (13,7 mg per 40 ml) eller glukose (7,2 mg per 40 ml) øker osmolariteten av ~ 1 mOsm. - Filtrere vekst og observasjons buffere med en 0,2 mikrometer filter og lagre dem ved 4 ° C for å hemme bakterievekst.
- Oppløs 50 mg av beta-kasein i 10 ml 20 mM TRIS (pH 7,5) buffer for å danne en 5 mg / ml beta-kasein-løsning er nødvendig for å passivere overflaten av eksperiment-kammeret, slik at GUVs ikke kleber, spre seg og sprekker. Når beta-kasein er fullstendig oppløst (opp til flere timer ved 4 ° C), filter (0,2 um) den i 0,5 ml aliquoter, som kan flash-frosset og lagretved -20 ° C for senere bruk (tinte alikvotene lagret ved 4 ° C kan vanligvis benyttes for opp til en 1 uke).
2. SUV Forberedelse
- Forberede og fryse porsjoner av Proteo-SUVer etter den tidligere utgitt detaljert protokoll 28. Bruk KvAP fluorescensmerket med Alexa 488-maleimid, rekonstituert i DPhPC SUVer (10 mg / ml) på et protein til lipid-forhold på 01:10 (etter vekt).
MERK: Wild-type KvAP inneholder en cystein per monomer ligger nær intracellulært C-terminalen (aminosyre 247). - Fluorescerende, Lipid-bare SUVer:
MERK: Handle kloroform under en avtrekkshette på seg nitril hansker og vernebriller. Unngå bruk av plast som kloroform kan oppløse dem. Kloroformoppløsninger kan lagres i rav glassflasker med teflon caps og overføres ved hjelp av sprøyter av glass. Vær nøye med å skylle all glass minst 5 til 10 ganger med kloroform før og etter pipettering lipider.- Forbered 100 mL av10 mg / ml DPhPC SUV inneholdende 0,5 mol% av den røde fluorescerende lipid, Texas Rødt-DHPE, ved å blande 100 ul av DPhPC-oppløsning (10 mg / ml i kloroform) med 8,2 ul av Texas Rødt-DHPE-oppløsning (1 mg / ml i metanol) i et 1,5 ml ravfarget glassflaske.
- Tørk lipidene ned under en strøm av nitrogen i en kjemisk hette mens rotasjon av ampullen. Når filmen synes å være tørr, plasserer lipidene under et vakuum i 3 timer for å fjerne eventuelt resterende oppløsningsmiddel.
- Tilsett 100 mL av SUV buffer til lipider, og virvle kraftig til ingen lipid som kleber seg til veggene i hetteglass og løsningen er jevnt melkeaktig.
- Sonikere lipidoppløsningen til å danne SUV. Juster hette stilling til ultralyd forårsaker mest bevegelse og flyt på innsiden av hetteglasset, og ta vare ikke å varme løsningen unødvendig. Fortsett sonikasjon til løsningen blir gjennomskinnelig, eller når det er mulig, gjennomsiktig (2-5 min for tips lydbehandling, ~ 20 min for bad sonikasjon).
- Aliquot SUVer (f.eks 10 mL eller 20 mL) og fryse (-20 ° C) for senere bruk.
MERK: Lipids, spesielt umettede lipider, kan lett sammenbrudd. Butikk lipid oppløsninger ved 20 ° C (eller 80 ° C) under argon og bruk innen 6 måneder. Lipid nedbrytningsprodukter kan påvises ved tynnsjiktskromatografi.
3. GUV Vekst av Electroformation
- Forberede electroformation kammeret.
- Dersom kammeret ikke har blitt renset, fjerne vinduer, tørke av all fugemasse og fett, trekke ut ledninger, og skyll og skrubb kammeret med en vev ved hjelp av vann og etanol (≥70%) vekselvis.
- Gni ledningene godt, senk ledningene og kammeret i aceton, og sonikere i 5 min. Tørk alt med en vev igjen ved hjelp av aceton. Sette kammeret i etanol og sonikere i 5 min.
- Montere kammeret ved å sette inn ledningene gjennom hullene, og roter og tørk ledningene å sørge for at de are ren. Sette kammeret i destillert vann, sonikere i 5 minutter og tørkes i kammeret med en strøm av nitrogen eller luft.
- Forbered 30 pl av 3 mg / ml SUV suspensjon i SUV-buffer. For å danne proteinholdige GUVs, kombinere 8 pl av Proteo-SUVer (DPhPC 10 mg / ml KvAP 01:10), 2 ul av fluorescerende SUVer (10 mg / ml DPhPC, 0,5 mol% TexasRed-DHPE) og 20 pl av SUV buffer i et 1,5 ml mikrosentrifuge-rør for en endelig protein til lipid (masse) forhold på 1: 12,5 og 0,1 mol% TexasRed-DHPE. Bland løsningen kraftig.
- Alternativt, for å praktisere den protokoll med lipid-bare SUVer, ganske enkelt kombinere 10 ul av fluorescerende SUVer (10 mg / ml DPhPC og 0,5 mol% TexasRed-DHPE) med 20 ul SUV-buffer.
- Deponere SUV Solution.
- Bruk en 2 ul pipette eller 5 ul glassprøyte for å avsette små (<0,2 ul) dråper av SUV løsning på ledningene. Ca. 1 ul av oppløsningen som er nødvendig for å danne en serie av dråper langs1 cm av wire. Sørg for at dråpene er små nok og spredte nok at de ikke berører eller sikring.
- La de deponerte SUVer tørke i ~ 30 min i friluft. Når alle dråpene har avgjort, rotere ledningen slik lipid innskudd er lettere å observere med mikroskopet.
MERK: Dersom SUVer ikke tørke tilstrekkelig, kan de bare vaske av ledningene når veksten buffer er lagt til, mens tørking for mye kan skade protein. Fordi luftfuktigheten påvirker frekvensen av tørking, tørketiden og / eller luftfuktighet kan justeres for optimale resultater 30. Lipidfilmen på ledningene skal være synlig under et mikroskop.
- Montere kammeret.
- Forsegle kammeret Bunn: Bruk av en sprøyte å anvende vakuumfett til bunnen av kammeret rundt de tre brønner og trykk på en 40 mm x 22 mm dekkglass forsiktig mot det å tette kammerets bunn, slik at den fester seg uten et gap. Forsegle sidene av kammeret (der ledninger exit) medtetningspasta. Påfør vakuum fett på toppen av kammeret som beskriver de tre brønnene.
- Tilsett sakte vekst buffer inntil hver brønn er fylt til toppen. Unngå enhver hurtig bevegelse av løsningen i brønnene, da dette kan stripe lipidfilm av elektrodene.
- Lukk kammeret ved å trykke på toppdekselet lysbilde forsiktig ned på fett, tar seg ikke å løsne bunndekkglass. Bruk en vev for å fjerne eventuelle dråper buffer ved kantene av toppdekkglass.
MERK: Dette er en god tid til å undersøke kammeret under mikroskop for å bekrefte at lipidfilmen har holdt på ledninger.
- Koble signalgenerator til ledningene ved hjelp av to krokodilleklemmer. Sett frekvensen (10 Hz / 500 Hz sinusbølge for lav / høy saltbuffer) og bruke et multimeter for å måle og justere spenningen over ledningene til 0,7 / 0,35 V rotmiddelkvadrat (Vrms) for lav / høy saltbuffer. Dekk kammer med aluminiumsfolie for å beskytte mot lys fluoroforer. La the GUVs å vokse i 2 til 3 timer for lav saltbuffer, og 12 timer, eller O / N for høy saltbuffer.
- Koble kammeret fra generatoren og forsiktig plassere den på en invertert mikroskop for å evaluere GUV vekst. Bruke langsom, jevn bevegelser eller væskestrømmen i brønnene kan tidlig løsne GUVs fra ledningene.
MERK: GUVs på ledningen kantene er vanligvis synlig i fase kontrast (40X lang arbeidsavstand objektiv), mens GUVs hvor som helst på den nedre halvdelen av ledningene kan sees med epifluorescence. Hvis ingen GUVs er synlige prøve å rotere ledningene for å se på den øvre overflaten. GUVs kan lagres ved 4 ° C i et vekstkammer i flere dager.
4. GUV Vekst av Gel-assistert Hevelse
- Forbered 10 ml av en 1% agarose-løsning ved å blande 100 mg av agarose med 10 ml rent vann. Varme den til det koker ved å plassere den i en mikrobølgeovn på 480 W for ~ 20 sek. Røre å sørge agarosen er helt oppløst.
MERK: Løsningenkan lagres ved 4 ° C og gjenoppvarmet ved behov. - Plasma-ren (luft plasma) en cover-lysbilde for 1 min slik at agarose løsning vil spre pent på den. Bruk cover-lysbilder i løpet av neste 15 min som effekten av plasma rengjøring slites av fort.
- Anvende 200 ul varm agarose løsning til hver 22 x 22 mm 2 lysbilde slik at oppløsningen fukter hele overflaten. Vipp lysbildet vertikalt og berøre den nedre kanten til en vev for å fjerne overflødig væske og la bare en tynn glatt lag av agarose på lysbildet.
- Plasser lysbilde på en varm plate eller ovn ved 60 ° C og la det tørke i minst 30 min. Agarose film er neppe synlig ved øyet. Etter lysbildene avkjøles til romtemperatur, bruke dem umiddelbart, eller lagre dem i opptil en uke i en lukket beholder ved 4 ° C.
- Plasser agarose-belagt dekkglass i en standard 3,5 cm petriskål.
- Klargjør SUV-løsning som beskrevet i Seksjon 3.2 og anvende ~ 15 ul av SUV-løsning (3 mg / ml lipid) i~ 30 svært små dråper forsiktig ned på agarose overflaten. Pass på ikke å forvrenge agarose lag for mye.
- Legg objektglasset under en forsiktig strøm av nitrogen i ca. 10-15 min, og følg fordampning av bufferen ved øyet som dråpene tørker.
- Så snart SUVer har tørket, tilsett vekst-buffer for å dekke glideflate. For en liten 3,5 cm petriskål bruk ~ 1 ml buffer.
- Tillate hevelse å fortsette for ~ 30 min, og deretter undersøke veksten av GUVs i kammeret ved hjelp av en invertert mikroskop med fase-kontrast eller Differential Interference Kontrast (DIC).
MERK: epifluorescens observasjon er vanskelig på grunn av sterk bakgrunn av fluoroforene i gel og auto-fluorescens av agarose.
5. Høsting og Observing GUVs
- Passivere observasjonskammeret (f.eks liten petriskål eller glass dekkglass), slik at GUVs ikke kleber, spre og brast på kammeret bunnen. Dekk til chamber bunnen med beta-kasein-løsning, inkuber i 5 minutter, skylles i kaseinløsning med rent vann, tørr med en strøm av luft eller nitrogen, og til slutt legge observasjon buffer (for eksempel ~ 5 mm dybde i en liten petriskål).
- Høste GUVs. Skjær enden av en 100 mL pipette tips slik at åpningen er større (~ 2 mm diameter), og håpe sakte som skjærspenningen av pipettering kan lett ødelegge GUVs.
- For elektro dannet GUVs, åpner vekstkammeret ved å forsiktig fjerne den øverste dekkglass. Sett pipettespissen rett over hver ledning og aspirer ~ 50 fil mens du beveger pipettespissen langs ledningen å løsne GUVs.
MERK: Det kan hjelpe å rotere ledningen for å samle GUVs på den "andre siden" av wire. - For "gel-assistert hevelse" GUVs, trykker du først på den siden av petriskålen noen ganger for å hjelpe de GUVs løsne fra dekkoverflaten. Plasser pipettespissen like over dekkglass og aspirer 50 pl mens pulling spissen tilbake over overflaten. Direkte overføre høstet GUVs til en observasjon kammer, eller oppbevar i en 1,5 ml mikro rør ved 4 ° C i opptil en uke.
- For elektro dannet GUVs, åpner vekstkammeret ved å forsiktig fjerne den øverste dekkglass. Sett pipettespissen rett over hver ledning og aspirer ~ 50 fil mens du beveger pipettespissen langs ledningen å løsne GUVs.
- Plasser observasjonskammeret på en invertert mikroskop, legger GUVs til observasjon kammeret, og vent noen minutter før GUVs å bosette på kammeret bunnen.
- Kartlegge kammeret med fasekontrast eller DIC å raskt finne glatte, sfæriske ('defekt gratis ")" GUV kandidater ". Undersøke hver "GUV kandidat" i epifluorescence å utelukke eventuelle inneholder mindre liposomer nestet inne. Til slutt, sjekk at lipid fluorescens intensitet er ensartet og kompatibel med en enkelt membran (dvs. unilamellær).
MERK: I noen bilamellar (eller multi-lamellære) vesikler, membraner er for nær hverandre skal løses slik at de vises unilamellær i fase kontrast eller DIC bilder. Imidlertid kan disse objektene skilles fra selve unilameLlar GUVs av deres lipid fluorescens, som er to ganger (eller mer) lysere.
6. Patch-klem GUVs
- Gjør patch pipetter med en 1-2 mikrometer tip diameter fra standard borosilikat kapillær glass bruker programmet anbefales for pipetten avtrekker.
MERK: Spesielle behandlinger som brann polering er ikke nødvendig, og pipetter kan brukes i flere dager etter at de har blitt dratt hvis de holdes i en lukket boks. - Passivere kammeret ved inkubering med en beta-kasein-oppløsning (5 mg / ml) for å sikre at GUVs ikke holder seg, spre og brudd på kammerflater. Skyll kasein av etter 5 min.
- Sett jordelektroden, fylle kammeret med observasjon buffer, overføre 10 mL av GUV suspensjon som beskrevet i trinn 5.2 og 5.3, og vent noen minutter før GUVs å bosette nederst.
- Fyll en fersk lapp pipette med løsning (observasjon buffer eller en annen iso-osmotisk løsning) ogmontere den på patch-clamp forsterker heads.
- Gjennom kammeret Søk for å finne en "feilfrie" GUV som beskrevet i kapittel 5.4, og kontroller at den inneholder fluorescerende protein.
- Påfør et konstant overtrykk (> 100 Pa, eller omtrent 1 cm H 2 O i et manometer) for å beholde lappen pipette interiør ren, og sett lappen pipetten inn i kammeret. Ta lappen pipetten inn i synsfeltet, gjelder test pulser for å måle / kompensere pipetten spenning offset og motstand, og undersøke pipetten under fluorescerende belysning for å bekrefte at spissen er ren.
- Ta lappen pipette mot GUV, og om nødvendig, samtidig redusere overtrykk så utover flyten fra lappen pipette gjør ikke GUV "run away". Når lappen pipetten er nær GUV, anvende et negativt trykk (opp til 5 cm H2O) for å trekke GUV mot lappen pipette. Overvåke motstanden som "; Tunge "av GUV membran entrer patch pipette og gigaseal former.
- Hvis en gigaseal ikke danne, fjerne oppdateringen pipette fra kammeret og gå tilbake til trinn 6.4. Hvis membranen patch dannet en gigaseal, men GUV forblir festet til pipette, eksisere lappen ved å trekke bort fra GUV, fullstappet av GUV mot kammeret bunnen, eller kort flytte pipette ut av løsningen.
- Når innsiden ut membran patch har blitt fjernet fra GUV og gigaseal er stabil, slå av testimpulsene og bruke en spenningsprotokoll slik som den som er vist i Figur 13.
MERK: Figur 13 følger standarden elektrofysiologisk konvensjonen for en inside-out lapp der straumen i lappen-elektroden er "positiv", og V = V bad - V pipette. Holder lappen på en negativ potensial (f.eks, V = -100 mV) for ~ 30 sek steder KvAP i hviletilstand, mens trinn (100 msek til 5 sek) til mer positive potensialer (f.eks, kan V = 100 mV) så kjører den inn gjennomfører (dvs. åpne) aktive stater. - Etter målinger på en membran patch er ferdig, bryte lapp med en zap eller trykkpuls og sjekk at spenningen oppveid av plasteret elektroden ikke har drev. Fjern lappen pipette fra kammeret, og gå tilbake til trinn 6.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Veksten av GUVs raskt kan evalueres ved å undersøke vekstkammeret under mikroskopet. For electroformation de GUVs har en tendens til å vokse i bunter langs platinatråder, som vist i figur 4. Under gel-assistert hevelse, vises GUVs som sfæriske strukturer som hurtig vokser og smelte sammen (figur 5).
Feilfrie GUVs er lettere identifiseres og evalueres etter overføring til en observasjon kammeret. Kalibreringsmålinger for å nøye vurdere GUV kvalitet, og en systematisk tallfesting er tidligere publisert 28. Men som en empirisk guide, "gode" GUVs bør isoleres (dvs. ikke i en klynge), har en enkel, glatt, sfærisk ytre membran, inneholder ingen objekter (dvs. rør, nestet blemmer, osv) inne, og har "standard" lipid fluorescens nivå (lysere objekter er vanligvis bi- eller multi-lamellær). Figur 6 viser DIC og epifluorescence bilder av en "feilfrie" GUV etter overføring til en iso-osmotisk glukoseoppløsning. Kontrasten i DIC er på grunn av forskjellen i optisk tetthet mellom sukrose fylt GUV og glukoseholdige bad løsning. Brytningsindeksen kontrasten KvAP holdige GUVs ofte avtar over tid, selv om KvAP seg ikke bør være permeabel for sukrose eller glukose. Den uniform protein fluorescens i GUV membran bekrefter at KvAP er innlemmet i GUV (dvs., det gjorde ikke forbli i lipidfilmen) og har ikke dannet mikron-skala (eller større) aggregater.
Figurene 7, 8 og 9 viser konfokale bilder av lipid og protein fluorescens fra GUVs fremstilt ved den nedre-salt electroformation protokollen, fysiologisk salt electroformation protokollen, og gel-assistert svellende protokoll. Den fluorescerende lipid (magenta) og protein(Grønn) signaler har blitt skalert til samme middels intensitet, slik at GUVs med et lavt / høyt antall proteiner per arealenhet (protein tetthet) har en magenta / grønn skygge i overlay-bilder (høyre kolonne), mens GUVs med en gjennomsnittlig protein tetthet er hvite. Isolerte, feilfrie GUVs ble identifisert og GUV størrelsesfordelingen er vist i figur 10. Typisk electroformation produserer mer feilfrie GUVs enn gel-assistert hevelse, men GUVs produsert av electroformation er mindre. Figur 11 viser proteintetthetsfordeling utledes fra fluorescensen av de GUVs. Electroformation med høy salt buffer produserer GUVs hvor proteinet tetthet varierer sterkt fra GUV til GUV. Proteinet tettheten av individuelle GUVs varierer mye mindre for electroformation med lav saltbuffer, mens proteinet tettheten av GUVs fremstilt ved gel-assistert svelling er bemerkelsesverdig jevn.
Den patch-clamp teknikken er en allment brukd metode for å studere funksjonen av spenningsstyrte ionekanaler, som KvAP. I "inside-out" innspillinger, er et rent glass "patch" pipette brukes til å skjære en oppdatering av membran fra en GUV. En elektrode inne i plasteret pipette blir så brukt til å søke spenning, og måle den resulterende strømmen som flyter gjennom membranen plasteret. Sammensetningen av membranen lapp kan være svært forskjellig fra resten av cellen / GUV 31, men "innside-ut" konfigurasjon er fremdeles meget nyttig for måling av enkeltkanal konduktans, ionisk selektivitet, og spenningsavhengige gating. Disse tre egenskapene er en utmerket måte å fastslå at strøm er ikke på grunn av artefakter (f.eks gigaseal utgaver) eller forurensninger (f.eks bakterielle poriner fra rensing), og det er funksjonelle KvAP kanaler i GUVs.
Kanal ledningsevne er lettest måles i patcher med bare én eller to aktive kanaler. I example vist i figur 12, er ingen kanalåpninger observert når membranen blir holdt på -100 mV, mens ved 100 mV, individuelle kanalåpningene kan tydelig løst. Den aktuelle histogram viser to topper svarende til den lukkede og åpne tilstander, og fester dem med en dobbel gaussisk funksjon gir en enkelt kanal strøm på 10,9 ± 0.85 pA, svarende til en ledningsevne på 109,2 ± 8,5 pS (i 100 mM KCl). Legg merke til at den enkelt kanal ledningsevne avhenger av oppløsningen (spesielt kaliumkonsentrasjon) og membran preparat 32,33.
Som mange andre K-kanaler, individuell KvAP kanaler utstillingen "chattering" bursts av raske åpninger og lukkinger. Som vist tidligere, kan kalium selektivitet testes ved å bruke en annen løsning i patch pipette (f.eks patch pipette løsning 90 mM NaCl, 10 mM KCl) 28.
Spenningsavhengige gating er ofte studied i patcher med flere kanaler, slik som å lettere få et ensemble gjennomsnitt. Mens det er ingen åpenbare mekanisme favoriserer den fysiologiske (intracellulære domenet på GUV interiør) og inverse (intracellulær domene på GUV utvendig) innsetting av KvAP i GUVs, i "inside-out" membranplastere flertallet av funksjonelle kanaler har " fysiologisk "innsetting 28. Figur 13 viser responsen av et membran plaster inneholdende multiple (> 10) kanaler til en serie av 5-depolariserende andre trinn. Mellom hvert trinn, blir lappen holdt på -100 mV i 30 sekunder for å tillate kanaler med "fysiologisk" innsetting til å vende tilbake til sin hviletilstand. Når potensialet er tilstrekkelig negativt (f.eks V <-60 mV) det meste av strømmen er på grunn av gigaseal lekkasje, og de sporadiske åpninger på en eller to kanaler som er sannsynlig å ha den "inverse" innsetting. For trinn til mer positiv potentials, blir stadig flere kanaler observert inntil det er så mange at enkelte åpninger og lukkinger kan ikke lenger løses. Således er sannsynligheten for åpne kanalen tydelig spenningsavhengig. Kinetikken KvAP aktivering og inaktive varierer betydelig mellom Svart lipidmembraner (BLMs) 26 og GUVs, men dette er i samsvar med tidligere rapporter som Kv kanal gating kan være følsomme for membranen sammensetning og tilstand 34.
Figur 1. Skjematisk GUV Electroformation:. Dråper inneholdende SUV avsettes på en elektrode som delvis dehydrering av løsningen forårsaker at SUV til å smelte for å danne en stabel av membraner. Buffer blir så tilsatt, og en AC elektrisk felt påført. Som film stigninger, individuelle membraner løsner fra bunken for å danne GUVs. (Dette tallet har blitt mod ifisert fra Aimon et al. 28)
Figur 2. GUV Electroformation kammeret. Kammeret er frest ut av en PTFE-blokk med tre brønner (10 mm diameter, 5 mm dybde). To 0,5 mm diameter platinatråder er atskilt med 3 mm (kant-til-kant-avstand), og er plassert nær bunnen av kammeret for å lette avbildning av trådene. Bunn og topp dekkglass holdes på plass med vakuum fett, og tetningspasta hindrer eventuelle lekkasjer fra tråd hullene på siden. AC generator er forbundet med krokodilleklemmer til ledningene. Kammeret er basert på en utviklet av Ernesto Ambroggio og Luis Bagatolli. (Dette tallet har blitt forandret fra Aimon et al. 28)
"/>
Figur 3. Gel-assistert Spontan Hevelse Skjematisk: Dråper inneholdende en SUV suspensjonen avsettes på en agarosegel Ettersom dråpene tørker, SUV sikring for å danne en lipid film.. Når veksten buffer blir tilsatt, rehydrerer filmen og GUVs dannes på overflaten. GUVs vokse til en størrelse på ~ 10 mikrometer ved hevelse og fusjonere med nabo GUVs.
Figur 4. Representant bilde av DPhPC GUVs inneholder KvAP vokser på platinatråd i en høysaltbuffer. De GUVs ligne drueklaser langs wire. Fase kontrast bilde ved hjelp av en 40X LWD objektiv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. DPhPC GUVs inneholder KvAP hevelse på agarosegel. Det GUVs er synlige som svake kuler med en diameter på ~ 10 pm. De mørke / lyse flekker er lipid / agarose aggregater hvorfra vesikler svelle. Fase kontrast bilde med 40X LWD objektiv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Bilder av et feilfritt GUV. (Egg-PC: Egg-PA 9: 1 av masse) som inneholder KvAP merket med Alexa-488 venstre: DIC, høyre: Alexa-488 epifluorescence. Eksitasjon: 470/50 nm, emisjon: 545/75 nm. Legg merke til uniform fluorescens fra KvAP uten synlige aggregater. 81fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Confocal bilder av lipid (magenta) og protein (grønn) fluorescens fra elektroformes GUVs dyrket i en lav salt buffer (Egg-PC: Egg-PA 9: 1 av masse) (A) Den hvite piler mark (sannsynlig). GUVs, mens den røde pilen markerer et potensielt bi-lamellar vesikkel med høyere lipid fluorescens. Merk at fluorescens intensitet er lysere i midten av dette bildet på grunn av ekstremt stort synsfelt. (B) Zoom viser en liten gruppe av GUVs. Venstre (magenta): TexasRed-DHPE eksitasjon: 543 nm laser linje, utslipp: 605/70 nm. Center (grønn): KvAP merket med Alexa-488 eksitasjon: 488 nm laser linje, utslipp: 515/30 nm. Høyre: overlegg.oad / 52281 / 52281fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8. konfokale bilder av lipid (magenta) og protein (grønn) fluorescens fra elektroformes GUVs dyrket i fysiologisk saltkonsentrasjon (egg-PC: egg-PA 9: 1 etter vekt). (A) GUVs (hvite piler viser sannsynlig unilamellære eksempler) er mer sparsom i forhold til den lave salt protokollen og kan ha svært forskjellige proteinkonsentrasjoner (rød pil). (B) Zoom viser en liten gruppe av GUVs. Venstre (magenta): TexasRed-DHPE eksitasjon: 543 nm laser linje, utslipp: 605/70 nm midten (grønn): KvAP merket med Alexa-488 eksitasjon: 488 nm laser linje, utslipp: 515/30 nm. Høyre:. Overlay Vennligst cslikke her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9. Confocal bilde av lipid (magenta) og protein (grønn) fluorescens av GUVs (DPhPC) dannet av gel-assistert hevelse med en fysiologisk saltkonsentrasjon buffer. GUVs viser et mer homogent protein tetthet enn elektroformes GUVs tilberedt med fysiologisk buffer. Venstre (magenta): BPTR-Cer 0,1% eksitasjon: 543 nm laser linje, utslipp: 605/70 nm. Midten (grønn): KvAP merket med Alexa-488 eksitasjon: 488 nm laser linje, utslipp: 515/30 nm. Høyre:. Flettingen av de to kanalene Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 11. GUV protein tetthet histogrammer: Protein tetthet (antall proteiner per arealenhet) av GUVs av elektro med lav salt buffer (5 mM KCl, DPhPC) varierer mindre enn med fysiologisk saltkonsentrasjon (100 mM KCl, Egg-PC: Egg -PA. 9: 1 av masse) Protein tetthet av GUVs (DPhPC) vokst med gel-assistert hevelse i fysiologisk salt buffer viser minst variasjon. Protein tetthet er proporsjonal med KvAP-A488 fluorescensintensitet for disse konsentrasjonene 28, og i hvert histogram fluorescensstyrkene blir normalisert ved middelverdien av fordelingen. (Den midterste panelet har blitt endretfra Aimon et al. 28)
Figur 12. Enkanal aktivitet av GUV Membran Patches (DPhPC 'inside-out' spenning konvensjonen). Den GUV ble dyrket i 100 mM KCl, 5 mM HEPES pH 7,4 på platinatråder. Enkelt kanaler åpne etter påføring 100 mV potensial på lappen. Til høyre for det innfelte er et histogram som brukes til å beregne enkelt kanal konduktans. Den røde linjen er en tilpasning til en dobbel Gaussisk funksjon med maxima på 4,70 ± 0,27 pA og 15.62 ± 0.58 pA, tilsvarende en ledningsevne på 109,2 ± 8.5 pS. Sporingen ble filtrert ved 10 kHz med en 4-pol Bessel filter og innspilt på 50 kHz.
Figur 13. Spennings dependen t gating kanaler i membranen patch fra en GUV dannet på agarose i en høysaltbuffer (DPhPC, 'inside-out' spenning konvensjonen). (A) Response av patch membran strøm til en forbigående skritt i spenning. Pipett- og badeløsninger både inneholdt 100 mM KCl, og membranen ble holdt i 30 sekunder ved -100 mV mellom påfølgende spenningstrinn. På et nært inspeksjon kan man se at det spor inneholder en eller to kanaler som synes å åpne med negative spenninger. Nedfelling a) viser en zoom av den forsinkede åpningen og innfelt b) forsinket lukking av kanalen. Strømninger ble filtrert med en 4-pol Bessel filter ved 10 kHz og innspilt på 51,3 kHz. Offline sporingen ble ned-samplet til 513 Hz. Den negative kapasitans forbigående er avskåret på -150 pA. (B) Gjennomsnittlig strøm (0,25 sek <t <5 sek) versus skritt spenning. Strømninger i positive spenninger er større fordi kanalen åpen sannsynligheten er spenningsavhengig.iles / ftp_upload / 52281 / 52281fig13large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biomimetic modellsystemer er et viktig verktøy for å studere egenskapene og interaksjoner av proteiner og membraner. Sammenlignet med andre rekonstituert systemer som BLMs eller støttes lipidmembraner, GUV baserte systemer presentere flere muligheter, inkludert en betydelig styring av membran sammensetning, spenning og geometri, samt å være virkelig oljefri. Imidlertid, som omfatter transmembranproteiner, så som KvAP, inn GUVs krever betydelige tilpasninger av konvensjonelle protokoller for lipid-bare GUVs. Den electroformation protokollen presenteres her tidligere preget og brukes for å studere de biofysiske prinsipper for membranprotein fordeling og dynamikk i buede membraner 2,4,35. Dette arbeidet viser en ny gel-assistert hevelse protokollen, og legger til settet av metoder for protein rekonstituering i GUVs. Begge protokollene kan produsere feilfrie GUVs inneholder høye tettheter av KvAP, og målinger på innsiden ut patcher bekrefte atSE GUVs inneholde funksjonelle kalium selektiv, spenningsavhengige kanaler.
Disse metodene har forskjellige styrker og svakheter. Når lave saltforhold kan brukes, electroformation tilbyr et godt kompromiss mellom GUV yield og uniform protein tetthet. Electroformation gir fortsatt rimelige utbytter med fysiologiske saltkonsentrasjoner, men proteintetthet kan variere sterkt mellom GUVs (se figur 8 og 11). Tetthetsvariasjoner synes å være knyttet til varigheten av electroformation, som lav-salt-buffer vekst kan også ha betydelige variasjoner i tettheten dersom veksten fortsetter mye lenger enn 2 timer. I motsetning til dette, GUVs fremstilt ved gel-assistert svellingen har et svært ensartet og protein tetthet, selv for fysiologiske buffere. Imidlertid er andelen av multi-lamellære vesikler større, og agarose auto-fluorescens kompliserer kvantifisering av lavt protein tettheter 16. Ved hjelp av polyvinylalkohol i place av agarose har blitt rapportert å forbedre gel-assistert GUV avkastning når lipider ble avsatt fra kloroform 20, men vi klarte ikke å produsere GUVs hjelp polyvinylalkohol med SUV-løsninger. Hvis en lavere yield på feilfrie GUVs er akseptabelt, har gel-assistert hevelse en klar fordel for eksperimenter som krever en uniform protein fordeling.
Electroformation og gel-assistert hevelse har også helt andre krav til utstyr. Den gel-assistert svelling protokollen bruker lite spesialutstyr bortsett fra plasmarenser, som er ikke nødvendig da det er mange alternative fremgangsmåter for å fremstille rent, hydrofil glass. I motsetning til dette, electroformation krever et tilpasset kammer med trådelektroder. Platinatråd er dyrt, men for denne protokollen GUVs vokste lettere med platina enn titan ledninger, og GUVs ikke vokser på ITO glir når du bruker fysiologiske saltkonsentrasjoner. Diameteren av elektrodene (0,5 mm) er en kompressor mOmiše mellom elektrodeoverflaten og pris. Kammeret er vist på figur 2 er basert på en utforming av Luis Bagatolli 15 og Ernesto Ambroggio, og ble maskinert fra polytetrafluoretylen (PTFE) for å tillate rensing med de fleste oppløsningsmidler. Imidlertid bør polyacetal eller polyvinylklorid (PVC) også fungere godt. Muligheten til å fjerne de platinatråder for aggressiv renhold er viktig, og når den først lære protokollen, er det svært nyttig å kunne observere GUV vekst in situ gjennom bunndekselet lysbilde. Den mindre, lukket brønner hindre løsning fra sloshing bakover og forover, og også tillate testing av flere lipid sammensetninger i parallell. Imidlertid er en spesiell custom kammer ikke avgjørende når du starter opp. For eksempel kan enkle, enkeltbrønnkamre være improvisert ved å overvinne to ledninger ned til bunnen av en liten petriskål, eller ved hjelp av forsegling av voks til sandwich-dem mellom to glassplater, eller ganske enkelt å stikke dem gjennom lokket av en liten ampulle.
Både electroformation og gel-assistert hevelse protokoller skal produsere et tilstrekkelig antall feilfrie GUVs for mikro-manipulasjon og patch-clamp eksperimenter. Imidlertid GUV kapasitet avhenger følsomt på dannelsen av den to-lags stabel når SUV løsning er delvis dehydrert. Dersom problemer oppstår i voksende GUVs (dvs. ingen eller få GUVs er synlige i vekstkammer), kan det være svært nyttig å vokse lipid-bare GUVs hjelp av en lipid / kloroform løsning i stedet for SUVer 15,16 (og en lav salt buffer). Hvis GUVs ikke vokser godt fra en lipid / kloroform film da noe fundamentalt er feil (f.eks feil lipidoppløsningene eller buffere, fett eller skitt på elektrodene, feil spenning eller frekvens, osv). Men hvis GUVs vokse fra lipid / kloroform-filmer, men ikke de SUV filmer, så problemet er sannsynlig å være sammen med den delvise dehydratisering.
Den delvis dehydrering trinnet erlettest optimalisert ved hjelp av lipid-SUVer bare fordi det ikke er noen fare for "denaturering" lipider ved overdreven uttørking. For electroformation, kan det være nyttig å undersøke ledningene etter at SUV dråpene har fått lov til å tørke for å sjekke at det er lys lipid fluorescens på hvert sted hvor en dråpe ble avsatt. Hvis lipid fluorescensen forsvinner etter at kammeret er fylt med vekstløsning, deretter enten vekstløsning må tilsettes mer forsiktig, eller SUVer trenger å dehydrere lenger slik filmen festes mer fast til ledningen. Under veksten, sørg for verken ledninger eller løsning flytte innen kammeret (f.eks når man setter kammeret på mikroskopet) for å unngå stripping GUVs av ledningene. Når GUVs vokser godt, de er som regel lett å se i fase bilder kontrast. Men mindre GUVs er ofte klarere ved hjelp av lipid fluorescens, som også er nyttig for å se hvordan membranstabelen har endret seg i løpet av veksten. Undersøke alle overflater avledningene (innvendig, utvendig, topp og bunn) i alle brønner samt kammeret gulvet før du kaster vekst, fordi avkastning kan variere betydelig fra ett sted til et annet.
Håndtering og lagring av GUVs er enkel sammenlignet med celler, men GUVs er ganske følsomme for osmotisk stress, skjærkrefter og heft. Glatte, myke bevegelser er viktig når høsting eller overføring GUVs, og det er viktig å passivere flater for å hindre GUVs fester seg og eksploderer. Men for patch clamp eksperimenter kammeret må skylles grundig etter passivisering slik at passivisering løsning kan ikke belegge lappen pipetter og forhindre gigaseal formasjon. For passivering, er beta-kasein behandling enkel og effektiv, og sammenlignet med bovint serum albumin, som har en lipid-transportfunksjon, har mer begrensede interaksjoner med lipidbilag, og bør være foretrukket når det arbeides med GUVs 36 beta-kasein. Ved å variere inkubasjonstiden, er detmulig å få GUVs å følge uten å eksplodere. Imidlertid vil GUVs ikke holder seg til dekselet lysbilde så godt som celler, og så bryr må likevel tas under enhver prosedyre som kan indusere strøm i kammeret (f.eks buffer perfusjon, flytting kammeret).
Patch-clamp opptak er en klassisk metode for å studere spenningsstyrte ionekanaler som KvAP og denne protokollen er avledet fra standard teknikker for å skaffe "inside-out" patcher fra heftende celler. En standard patch-clamp set-up der lappen pipette stammer skrått (f.eks 30-60 grader fra horisontal) i en liten petriskål skal fungere godt. Imidlertid kan klarere bilder av plasteret pipette og gigaseal område oppnås ved hjelp av et kammer i hvilket dekkglass danner kammerets topp og bunn (~ 1 mm separasjon) slik at lappen pipette kan komme inn horisontalt fra siden. Fordi store patch pipettes trykk ikke er nødvendig, kan trykket hensiktsmessig være controlled med en sprøyte og overvåkes med noen enkel trykkmåler (f.eks, improvisert vannmanometer). Det kan være nyttig å første praksis patch clamp eksperimenter med lipid-bare GUVs dyrket ved hjelp av en lipid / kloroform løsning og lav-salt buffer. Fordi utbyttet av feilfrie GUVs er svært høy, vil det være nok av perfekte GUVs å jobbe med, selv om mange er ødelagt under høsting og overføring til den eksperimentelle kammer.
Med litt øvelse kan skåret membranplastere med stabile gigaseals lett skaffes fra DPhPC GUVs og KvAP-DPhPC GUVs. For å oppnå en høy suksessrate, hjelper det å velge nøye runde, men litt-varierende, feilfrie GUVs og sjekk at lappen pipette er ren (ser på lipider i fluorescens) før du forsøker å danne gigaseal. Når en membran "tunge" entrer patch pipette, den gigaseal danner vanligvis raskt (<1 sek) uten behov for sterk suge eller spesific holding spenning. Mens en dårlig forsegling kan forbedre som membranen kryper lenger inn lappen pipette, ofte forseglingen forblir fattige fordi pipetten interiøret var forurenset, og det er nødvendig å starte på nytt med en ny patch pipette og GUV. DPhPC skjemaer svært stabile membran patcher (titalls minutter) med en utmerket tetning motstand selv ved høye spenninger (f.eks, ± 150 mV). SOPC: kolesterol (3: 1 mol) kan også danne meget stabile plaster, men kan kreve større sugekraft for å forsegle, mens egg-PC lapper synes å brekke lettere.
For lengre patch-clamp-sesjoner kan det være nødvendig å justere osmolariteten av kammeret løsning. Hvis osmolariteten er for mye lavere enn den GUV vekst buffer, GUVs blir hovne, anspent og sfærisk og det kan ikke være mulig å suge GUV membran langt nok inn lappen pipette for å danne en gigaseal. Dette kan ofte bli løst ved ganske enkelt å vente 10 eller 20 minutter som fordampning fra kammeret øker external løsning osmolaritet inntil GUVs slippe ut luften og begynner å svinge. Derimot, hvis kammeret er igjen åpen for lenge osmolariteten av den eksterne løsningen kan øke inntil GUVs deflate, tubulate og knopp. Dette kan unngås ved å blokkere fordampning fra kammeret (for eksempel med mineralolje) eller periodisk tilsetning av destillert vann for å erstatte det vann som har fordampet.
Fordi proteiner kan bli ekskludert fra skåret membran lapper 31, er antallet aktive kanaler i et utskåret plasteret ikke bare relatert til tettheten av protein i GUV membranen. Fluorescensmålingene foreslår konsentrasjonen av KvAP i plasteret membranen er mye lavere enn den GUV 28 og det kan være ganske lett å få tak flekker som bare inneholder et lite antall kanaler. Men hvis patcher inneholde for mange kanaler for enkelt kanal opptak, de åpenbare skritt for å bruke patch pipetter med mindre tips og / eller senke protein-til-lipid density i SUV mix er effektive. I motsetning til dette, for å utføre målinger på ensemble plastre inneholder flere kanaler, kan det være nyttig å begynne med et forholdsvis høyt protein densitet (f.eks, 01:10, protein til lipid på vektbasis) ved å bruke protein fluorescens for å velge GUVs med et høyt proteintetthet Bruk større lapp pipetter (f.eks, 2 til 3 mikron spiss diameter) og aspireres raskt for å prøve å danne tetningen raskt. Klart, ville det "hel-celle" -type konfigurasjon (dvs. 'hel-GUV') være ideelt å karakterisere alle kanalene i en GUV, men dessverre "hel-GUV" konfigurasjon utgjør flere tekniske problemer 37.
Løsningene, lipider og proteinkonsentrasjonen i denne opplæringen er bare ment som et utgangspunkt, og kan endres for å dekke behovene til en bestemt eksperiment følgende noen betraktninger.
Alle løsninger bør inneholde en pH buffer som HEPESeller TRIS å sikre proteiner er ikke utsatt for ekstrem pH. SUV-buffer bør ha en så lav konsentrasjon av oppløste stoffer som proteinet vil tolerere (f.eks, 5 mM salt eller lavere), som oppløst stoff konsentrasjoner øker under den delvise dehydratiseringstrinnet og høye saltkonsentrasjoner kan denaturere proteinet eller forårsake lipidfilmen hurtig delaminere under rehydrering trinn. Små mengder av sukkere slik som trehalose (f.eks, 1 mM til 5 mM) blir antatt å beskytte proteinet i dehydrering 23. Mens trehalose har vært implisert i anhydrobiose og antas å beskytte membranen og proteiner mot koagulasjon 38, kan sukrose eller glukose fungere like bra.
For veksten buffer, er saltkonsentrasjonen særlig viktig, da dette vil påvirke parametrene for optimal vekst GUV (f.eks electroformation spenning, frekvens og varighet). I motsetning til dette, den primære begrensning for observasjon bufferen er that den bør ha den samme osmolaritet som veksten buffer. Inkluderingen av sukrose og / eller glukose i "vekst buffer" og "observasjons buffer" kan være nyttig for å sikre GUVs sediment på bunnen av observasjonskammeret, mens en forskjell i brytningsindeks mellom GUV indre og ytre hjelper til med fasekontrast eller DIC mikroskopi. Elektrofysiologer ofte omfatte kalsium eller magnesiumioner til bad og / eller patch pipette løsninger for å forbedre gigaseal formasjon med cellemembraner, men disse ser ikke ut til å være avgjørende for GUVs. Faktisk kan divalente ioner slik som magnesium og kalsium indusere lipid faseseparasjon og lette adhesjon, slik at hvis disse problemene oppstår, kan det være nyttig å legge til 1 mM EDTA.
Åpenbart er en nøkkel tiltrekning av rekonstituert systemer sammenlignet med cellene evnen til å kontrollere lipid sammensetning. DPhPC GUVs vokse godt og danne stabile skåret membran patcher, og disse protokollene har også jobbet effectively for lipid-blandinger inneholdende fosfatidylcholin (PC), fosfatidyletanolamin (PE), fosfatidylglycerol (PG), fosfatidinsyre (PA), fosfatidylserin (PS) og kolesterol. Imidlertid er GUV vekst følsomme for både lipid sammensetning og buffere 15, og så protokollparametere (f.eks mengden av lipid deponert, electroformation spenning / frekvens), kan være nødvendig å justere for lipid-blandinger som inneholder høye konsentrasjoner av PE, ladet lipider (PG, PA, PS), eller kolesterol. Når du starter opp, Egg-PC, DOPC eller DPhPC er et godt førstevalg, og det er også svært nyttig å inkludere en fluorescerende lipid å observere GUV vekst og å skille GUVs fra multilamellære vesikler med to eller flere bilag. Lipid-blandinger kan fremstilles ved å kombinere SUV-suspensjoner av stamløsninger, som lipidene blandes under delvis dehydrering trinn (forutsatt at temperaturen er høyere enn en hvilken som helst individuell faseovergangstemperatur). Bruke høyere SUV konsentrasjon (f.eks10 mg / ml) stamløsninger tillater betydelig fleksibilitet, og disse kan så fortynnes til 3 mg / ml før dehydratisering av suspensjonen.
Ved forsøk på å tilpasse disse protokollene til andre transmembranproteiner, er det meget viktig å være i stand til både å direkte observere inkorporering av protein inn i GUVs og testproteinfunksjon. Selv om ikke et problem med KvAP, er det alltid en mulighet for at det under rehydratisering trinn trans-membranprotein vil forbli i membranstabelen som fører til dannelsen av lipid-bare GUVs. Fluorescerende merking av proteinet er veldig praktisk som det gir en rask og utvetydig måte å observere protein innlemmelse i GUVs og også sjekke for aggregering innenfor GUVs. Det er også meget viktig å teste proteinfunksjon i GUVs å bekrefte at proteinet ikke ble ødelagt i løpet av rekonstitusjon prosessen. For ionekanaler som KvAP, kan patch-clamp målinger påvise funksjonelle kanaler iGUVs. Men en fluoresceinmerkede høy affinitetsligand (f.eks toksin, substrat eller anti-body) ville også være svært nyttig for å teste tilstanden av proteiner i GUVs.
Oppsummert viser denne artikkelen hvordan å produsere Proteo-GUVs inneholder spenningen gated kalium kanal KvAP og karakterisere dem ved hjelp av fluorescens mikroskopi og elektrofysiologi. Forhåpentligvis disse metodene kan tilpasses til nye klasser av membranproteiner og gi et grunnlag for mer komplekse in vitro-systemer for å studere og å bygge opp levende materie fra dens grunnleggende komponenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
| Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
| 18:1 (Δ9-cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| Cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
| TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | labeled lipid |
| BPTR-Ceramide | Invirtogen | D-7540 | labeled lipid |
| Choloroform | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
| Acetone | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
| Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Bonaduz AG | diverse | |
| Amber vials and Teflon cups | Sigma | SU860083 and SU860076 | |
| Parafilm | VWR | 291-1214 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | diverse | |
| Agarose | Euromex | LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C) | |
| Sucrose | Sigma | 84097-1kg | |
| Glucose | Sigma | G8270-1kg | |
| Trehalose | Sigma | T9531-25G | |
| KCl | Sigma | P9333-1kg | |
| Hepes | Sigma | H3375-100G | |
| TRIS | Euromex | EU0011-A | |
| Osmometer | Wescor | Vapro | |
| pH meter | Schott instruments | Lab850 | |
| Sonicator | Elmasonic | S 180 H | |
| Syringe filter 0.2 µm | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
| Function generator | TTi | TG315 | |
| Platinum wires | Goodfellow | LS413074 | 99.99+%, d = 0.5 mm |
| Polytetrafluoroethylene | Goodfellow | ||
| Dow Corning 'high vacuum grease' | VWR | 1597418 | |
| sealing paste | Vitrex medical A/S, Denmark | REF 140014 | Sigillum Wax |
| Cover slides 22 x 40 mm No1.5 | VWR | 631-0136 | |
| Cover slides 22 x 22 mm No1.5 | VWR | 631-0125 | |
| Plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | airplasma, setting 'high' |
| Petri dishes | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cm x 1 cm |
| patch clamp amplifier | Axon instruments | Multiclamp700B | |
| DAQ Card | National Instruments | PCI-6221 | |
| Labview | National Instruments | version 8.6 | |
| Glass pipettes boro silicate OD 1 mm ID 0.58 mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
| Electrode holder | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| Pipette puller | Sutter | P-2000 | |
| Camera | ProSilica | GC1380 | |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axiovert 135 | |
| Objective | Zeiss | 40X long working distance, Phase contrast | |
| Objective | Zeiss | 100X Plan-Apochromat NA 1.3 | |
| Filterset GFP (for Alexa-488) | Horiba | XF100-3 | |
| Filterset Cy3 (for TexasRed) | Horiba | XF101-2 | |
| beta-casein | Sigma | C6905-1G | |
| Confocal microscope | Nikon Eclipse TE 2000-E | D-Eclipse C1 confocal head | |
| Objective | Nikon | Plan Fluor 100X NA 1.3 | |
| Matlab | Mathworks | for image processing and analysis of the current traces |
References
- Schwille, P. Bottom-Up Synthetic Biology: Engineering in a Tinkerer’s World. Science. 333 (6047), 1252-1254 (2011).
- Aimon, S., et al. Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution. Developmental Cell. 28 (2), 212-218 (2014).
- Roux, A., et al.
- Domanov, Y. A., et al.
- Sorre, B., et al. Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5622-5626 (2009).
- Faris, M. D. E. A., et al. Membrane Tension Lowering Induced by Protein Activity. Physical Review Letters. 102 (3), 038102 (2009).
- Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
- Sens, P., Johannes, L., Bassereau, P. Biophysical approaches to protein-induced membrane deformations in trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 20 (4), 476-482 (2008).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
- Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Trends in Colloid and Interface Science VI. 89, 161-176 (1992).
- Bagatolli, L. A., Pott, T.
- Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in. Solutions of Physiologic Ionic Strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
- Campillo, C., et al. Unexpected Membrane Dynamics Unveiled by Membrane Nanotube Extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
- Kwok, R., Evans, E.
- Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field. Biophysical Journal. 70 (3), 1112-1121 (1996).
- Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Kahya, N., Pecheur, E. I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
- Doeven, M. K., et al. Distribution, lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
- Girard, P., Prost, J., Bassereau, P. Passive or Active Fluctuations in Membranes Containing Proteins. Physical Review Letters. 94 (8), 088102 (2005).
- Betaneli, V., Petrov, E. P., Schwille, P. The Role of Lipids in VDAC Oligomerization. Biophysical Journal. 102 (3), 523-531 (2012).
- Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
- Jiang, Y., et al. X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel. Nature. 423 (6935), 33-41 (2003).
- Aimon, S., et al. Functional Reconstitution of a Voltage-Gated Potassium Channel in Giant Unilamellar Vesicles. PLoS ONE. 6 (10), e25529 (2011).
- Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. -X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. Journal of Visualized Experiments. (77), (2013).
- Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
- Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal. Biophysical Journal. 97 (3), 738-747 (2009).
- Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. , Sinauer Associates, Inc. (2001).
- Finol-Urdaneta, R. K., McArthur, J. R., Juranka, P. F., French, R. J., Morris, C. E. Modulation of KvAP unitary conductance and gating by 1-alkanols and other surface active agents. Biophysical journal. 98 (5), 762-772 (2010).
- Schmidt, D., MacKinnon, R. Voltage-dependent K+ channel gating and voltage sensor toxin sensitivity depend on the mechanical state of the lipid membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (49), 19276-19281 (2008).
- Quemeneur, F., et al.
- Parc, A. L., Leonil, J., Chanat, E. αS1-casein, which is essential for efficient ER-to-Golgi casein transport, is also present in a tightly membrane-associated form. BMC Cell Biology. 11 (1), 1-15 (2010).
- Garten, M., Toombes, G. E. S., Aimon, S., Bassereau, P. Studying Voltage Dependent Proteins with Giant Unilamellar Vesicles in a “Whole Cell” Configuration. Biophysical Journal. 104 (2), 466a (2013).
- Crowe, L. M., Reid, D. S., Crowe, J. H. Is trehalose special for preserving dry biomaterials. Biophysical Journal. 71 (4), 2087-2093 (1996).
