Repérer les tissus correcte à chaque fois dans les blocs multi-tissus

Summary

Le but de l'échantillon Orientation Tag (spot) est de fonctionner comme un outil d'orientation pour aider à l'identification de tissus individu dans des blocs de paraffine multi-tissus. Ces protocoles démontrent comment il est construit à partir de matériaux facilement communes d'histologie à faible coût et sert de repère visuel fiable dans des blocs de paraffine et des sections.

Abstract

Blocs de paraffine multi-tissus fournissent une analyse à haut débit avec une efficacité accrue, l'uniformité expérimental, et réduit le temps et le coût. microarrays de tissu forment la majorité des blocs de paraffine multi-tissus, mais de plus en plus, les chercheurs utilisent des blocs non-revêtu contenant de grandes tissus provenant de plusieurs individus qui peuvent fournir de nombreux avantages de matrices tissulaires sans investissement important dans la planification et de l'équipement. Un élément essentiel d'une analyse multi-tissulaire est la méthode d'orientation permettant d'identifier chaque individu tissu. Bien que les méthodes existent pour maintenir l'orientation et l'identification des tissus dans des blocs multi-tissus appropriée, la plupart ne sont pas bien adaptés à des blocs non-revêtu, peuvent consommer de l'espace précieux dans un tableau et / ou sont difficiles à produire en laboratoire d'histologie standard. Le spécimen Orientation Tag (spot) est un outil d'orientation simple et peu coûteuse qui est clairement visible dans des blocs de paraffine et toutes les sections de tissus for l'identification de l'échantillon fiable dans les présentations disposés et non disposés. La tache présente des avantages par rapport aux méthodes existantes d'orientation pour les blocs non-revêtu car il ne nécessite pas de modification directe au tissu et permet une certaine souplesse dans l'arrangement des morceaux de tissu.

Introduction

La possibilité d'intégrer des échantillons de tissus provenant de plusieurs individus dans un seul bloc de paraffine permet une comparaison facile side-by-side entre les traitements et les individus, élimine la variabilité entre les diapositives, et réduit le coût et la charge de travail de la coupe et coloration de spécimens. Ces blocs multi-tissus sont généralement produites soit comme matrices tissulaires (TMA) ou des blocs de paraffine contenant des tissus à partir de plusieurs individus dans une disposition non-tableau. Maintien de l'identité de l'échantillon est critique pour le succès de toute analyse multi-tissu. Les chercheurs ont été en utilisant TMA depuis leur développement pour améliorer l'efficacité de l'analyse, de réduire les variations entre les diapositives, de conserver les ressources de tissus précieux, et de réduire le temps et le coût des expériences ^1. L'orientation correcte des TMA peut être accompli en utilisant une variété de méthodes, y compris les espaces, lignes ou colonnes entre carottes de tissu ^2-4, disposition asymétrique des groupes de base ^{3, 5} (par exemple, control vs traitement), "balise" noyaux ^6, et de noyaux d'orientation désignés situés à l'extérieur de la matrice TMA ^3. Bien que ces méthodes fonctionnent bien pour les TMA, la plupart consomment précieux espace noyau TMA et TMA avec les lacunes et les espaces comme des identificateurs peuvent devenir source de confusion comme noyaux de tissus sont épuisées au fil du temps. En outre, ces méthodes ne sont pas appropriées pour une utilisation dans des blocs multi-tissus sans un format de tableau car elles reposent sur des anomalies dans le modèle bien ordonnée de noyaux de microréseaux uniformes comme identifiants. La plupart des blocs multi-tissus non-revêtu doivent accueillir tissus non uniformes et, par définition, ne pas afficher la grille de tableau structuré qui rend ces aberrations jalonnent.

Bien qu'il existe de nombreux avantages à l'aide d'une TMA, un des plus grands inconvénients est la petite taille des noyaux qui ne sont pas toujours représentatives du tissu largement hétérogène ^1. Blocs multi-tissus non RAID fournissent la plupart des til bénéficie d'une TMA, mais contient des échantillons de tissus, grandes ou organes entiers provenant d'études animales. microarrays de tissu en utilisant des conducteurs individuels ont différentes concordance avec des sections entières de tissus basés sur la protéine d'intérêt et beaucoup nécessitera plusieurs cœurs pour accroître la concordance ^7-11. En raison de la complexité et de la nature hétérogène de certains phénotypes de biomarqueurs, TMA utilise même un grand nombre de noyaux (> 10) peut encore être insuffisante et peut nécessiter des méthodes autres que les puces à ADN pour l'analyse ^8. En outre, la construction TMA est consommatrice de temps, techniquement exigeante et nécessite le coût initial et l'investissement ou l'accès à un arrayer tissus. Blocs multi-tissus non RAID peuvent être effectués dans un laboratoire de base avec beaucoup moins de temps et d'effort et est une alternative valable pour les études qui nécessitent plus de tissu que les tableaux permettent ou comme un moyen de réduire les coûts et de simplifier l'analyse.

blocs de non RAID multi-tissus exigent de même une ou fiableientation marqueur pour suivre l'identification de l'échantillon, cependant, le développement de ces marqueurs a été limitée. Une grande partie de la littérature décrivant l'orientation de tissu met l'accent sur ​​l'orientation physiologique approprié pour l'incorporation des morceaux de tissu, comme un tatouage le tissu avec de l'encre ^12, de pré-enrobage des tissus dans de la gélose-gélatine avant le traitement ^13, et le marquage de certains tissus avec des encoches ¹⁴ ou des sutures ¹⁵ . Bien que fonctionnel, ces méthodes ne sont pas idéales comme marqueurs dans des blocs multi-tissus en raison de leurs limitations. Une suture sera sectionné par rapidement et peut ne pas être visible dans chaque section. Techniques utilisant l'agar-gélatine peut maintenir le tissu dans une orientation correcte pendant le traitement et l'incorporation de pré-enrobage, mais ne fournit pas une indication visuelle de la différence entre plusieurs échantillons dans le bloc de paraffine et diapositives. Encoches ou colorant sur le tissu peuvent compliquer l'analyse ou obstruer détails morphologiques importantes. Alternativement, l'identité de tissusdans un bloc non-revêtu multi-tissus peut être maintenue grâce à l'enrobage des morceaux de tissu dans un arrangement asymétrique, mais cela nécessite 3 ou plusieurs morceaux de tissu et peut ne pas permettre une disposition optimale des tissus pour l'analyse.

Le spécimen Orientation Tag (spot) a été développé comme une méthode facile et peu coûteux d'identifier clairement les tissus dans des blocs multi-tissus et offre de nombreux avantages par rapport aux méthodes d'orientation existants. L'endroit est un petit, coloré, noyau composé de Hydroxyéthyl gel de traitement agarose et le tissu teinture de marquage, et infiltré avec de la paraffine (figure 2C). Le noyau de Spot est intégré sur la fin prochaine d'un tissu unique dans un bloc de paraffine multi-tissus et apparaît comme un point de couleur vive dans le bloc et dans chaque section (figure 1A – D), en indiquant clairement la bonne orientation du bloc et sections pour l'identification de tissus facile.

Protocol

1. Construction de la tache Ajouter 50 mg de sérum-albumine bovine (BSA) à 1 ml tissu colorant de marquage dans un tube conique de 15 ml ou 2 ml tube de microcentrifugation et vortex pendant 1 minute ou jusqu'à dissolution complète. Remarque: Pour ce protocole, utilisez biochimique année BSA. Alors que d'autres grades et des puretés ont pas été testés, il est prévu que de qualité et de pureté ne seraient pas avoir un impact significatif sur le succès de la tache. Heat 9 m…

Representative Results

Le spot apparaît comme un tour, point de couleur vive dans le bloc de paraffine (Figure 1A et 2D), dans toutes les sections de paraffine, et reste sur la lame de verre à travers la procédure H & E ou la coloration IHC (figures 1B – 1D et 2D). Cette évidentes aides de repère visuels deux l'histotechnician et chercheur à identifier chaque pièce de tissu individuelle et simplifie la communication comme l'histotechnician …

Discussion

Préparation réussie et l'utilisation des taches nécessite le respect attentif à quelques étapes techniques. Fusion de l'agarose d'hydroxyéthyle doit se faire lentement et à basse température. Melting rapidement à haute température peut entraîner une certaine dégradation de la gélose pour moins de résultats optimaux. Lors de la coupe des bouchons de colorant chargées en morceaux destinés à la transformation, en sorte que l'épaisseur de chaque pièce est supérieure à 4,5 mm et ne dépas…

Materials

HistogelTM Specimen Processing Gel	Thermo Scientific	HG-4000-012	http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html
Tissue Marking Dye	Triangle Biomedical Sciences, Inc.	TMD-5	Any tissue marking dye would most likely be sufficient.
Arraymold Kit A 2 mm (60 core)	Arraymold	20015A	Any manual tissue arrayer would work similarly.