Manchar o tecido correto Every Time nos Blocos Multi-tecidos

Summary

O objectivo da orientação da etiqueta de amostra (SPOT) é para funcionar como uma ferramenta de orientação para auxiliar na identificação de manipulação de tecidos em blocos de parafina multi-tecido. Estes protocolos demonstrar como ela é construída facilmente de histologia, materiais de baixo custo comuns e serve como um marcador visual confiável em blocos de parafina e secções.

Abstract

Blocos de parafina do tecido multi-proporcionar análise de alto rendimento com o aumento da eficiência, uniformidade experimental, e redução do tempo e custo. Tissue microarrays compõem a maioria dos blocos de parafina multi-tecido, mas cada vez mais, os pesquisadores estão usando blocos não vestiu contendo tecidos maiores a partir de vários indivíduos que podem fornecer muitas das vantagens de microarrays de tecido sem investimento substancial no planejamento e equipamentos. Um componente crítico de qualquer análise multi-tecido é o método de orientação utilizados para identificar todos os tecidos. Embora existam métodos para manter a orientação e a identificação de tecidos em blocos multi-tecido adequado, mais não são adequados para os blocos não formado, pode consumir espaço valioso dentro de uma matriz e / ou são difíceis de produzir em laboratório histologia padrão. A Orientação Tag Specimen (spot) é uma ferramenta de baixo simples, orientação para os custos que é claramente visível em todos os blocos de parafina e cortes de tecidos for identificação espécime confiável em layouts dispostos e não dispostos. O local proporciona vantagens sobre os métodos existentes de orientação para blocos não-vestida, uma vez que não exige qualquer modificação directa ao tecido e permite flexibilidade na disposição dos pedaços de tecido.

Introduction

A capacidade de incorporar amostras de tecido de várias pessoas em um único bloco de parafina permite fácil comparação lado a lado entre os tratamentos e indivíduos, elimina a variabilidade entre os slides, e reduz o custo ea carga de trabalho de corte e coloração espécimes. Estes blocos multi-tecidos são tipicamente produzidos quer como micromatrizes de tecidos (TMA) ou blocos de parafina contendo tecido de vários indivíduos num esquema não-matriz. Manutenção de identidade amostra é crítica para o sucesso de qualquer análise multi-tecido. Os investigadores têm vindo a utilizar TMAs desde o seu desenvolvimento para melhorar a eficiência da análise, reduzir a variação entre os slides, conservar os recursos de tecidos valiosos, e reduzir o tempo eo custo de experimentos ^1. A orientação correcta de TMA pode ser conseguida utilizando uma variedade de métodos, incluindo os espaços em branco, linhas ou colunas entre núcleos dos tecidos, ^2-4 disposição assimétrica dos grupos principais ^{3, 5} (por exemplo, control vs. tratamento), "baliza" núcleos ^6, e núcleos de orientação designados situados fora da matriz TMA ^3. Embora estes métodos funcionam bem para TMAs, mais consomem valioso espaço TMA núcleo e TMAs com lacunas e espaços como identificadores pode tornar-se confuso para enchimento de tecido estão esgotados ao longo do tempo. Além disso, estes métodos não são apropriados para uso em blocos multi-tecido sem um formato de matriz porque dependem de anomalias no padrão bem ordenada de núcleos de microarray uniformes como identificadores. A maioria dos blocos não vestiu multi-tecido deve acomodar tecidos não uniformes e, por definição, não exibir a grade de matriz estruturada que faz com que essas aberrações destacam-se como pontos de referência.

Embora existam muitas vantagens em usar uma TMA, uma das maiores desvantagens é o tamanho pequeno dos núcleos o que nem sempre é representativa de tecido ^1, em grande parte heterogénea. Blocos multi-tecido não-dispostas fornecer muitas das tele se beneficia de um TMA, mas contêm amostras de tecidos maiores, ou órgãos inteiros a partir de estudos com animais. Tissue microarrays utilizando núcleos individuais têm diferentes concordância com seções inteiras de tecidos com base na proteína de interesse e muitos exigem múltiplos núcleos para maior concordância ^7-11. Devido à complexidade e heterogeneidade de alguns fenótipos de biomarcadores, TMAs usando até mesmo um grande número de núcleos (> 10) podem ainda ser insuficiente e pode exigir que não sejam microarrays para a análise de ^oito métodos. Além disso, TMA construção é demorado, tecnicamente exigente, e exige que o custo inicial eo investimento em ou acesso a um arrayer tecido. Blocos multi-tecido não dispostas pode ser feita em qualquer laboratório de base com significativamente menos tempo e esforço e é uma alternativa válida para os estudos que exigem mais do que matrizes de tecido permitir ou como um meio para reduzir custos e simplificar a análise.

Blocos não-vestida multi-tecido semelhante requerem um ou fiávelientation marcador para monitorar a identificação da amostra, no entanto, o desenvolvimento desses marcadores tem sido limitada. Muita da literatura que descreve a orientação se concentra na orientação do tecido fisiológico correcto para a incorporação de peças de tecidos individuais, tais como o tecido de tatuagem com ¹² de tinta, pré-incorporação de tecidos em meio de ágar-gelatina antes de processamento ^13, e marcação certos tecidos com entalhes ¹⁴ ou ¹⁵ Suturas . Embora funcionais, estes métodos não são ideais como marcadores em blocos multi-tecido, devido às suas limitações. A sutura será seccionada por meio rápido e talvez não sejam visíveis em cada seção. Usando técnicas de ágar-gelatina pode manter o tecido na orientação adequada durante o processamento e incorporação pré-incorporação, mas não fornece uma indicação visual para diferenciar entre múltiplas amostras no bloco de parafina e lâminas. Entalhes ou corante no tecido pode complicar a análise ou ocluir importantes detalhes morfológicos. Alternativamente, a identidade dos tecidosem um bloco não-vestida multi-tecido pode ser mantida através da incorporação de peças de tecido numa disposição assimétrica, mas isto requer três ou mais peças de tecido e pode não permitir a disposição óptima dos tecidos para análise.

A Orientação Tag Specimen (spot) foi desenvolvido como um método fácil e barato para identificar claramente tecidos em blocos multi-tecidos e oferece muitas vantagens sobre os métodos de orientação existentes. O local é um pequeno, colorido, núcleo composto por Hydroxyethyl gel de agarose e processamento de corante marcação de tecidos, e infiltrado com parafina (Figura 2C). O núcleo local é incorporado na extremidade próxima de um único tecido num bloco de parafina de multi-tecido e aparece como um ponto brilhantemente colorido no bloco e em cada secção (Figura 1A – D), indicando claramente a orientação correcta do bloco e secções para a identificação de tecidos fácil.

Protocol

1. Construção do local Adicionar 50 mg de Albumina de Soro Bovino (BSA) a 1 ml de tecido corante de marcação num tubo de 15 ml ou 2 ml tubo de microcentrífuga e vortex durante 1 minuto ou até estar completamente dissolvido. Nota: Para este protocolo, utilize bioquímica Grade BSA. Enquanto outros graus e purezas não foram testados, espera-se que o grau ea pureza não teria um impacto significativo sobre o sucesso do local. De calor 9 ml hidroxietil gel de agarose de processamento em um…

Representative Results

O local aparece como um círculo, ponto brilhantemente colorido no bloco de parafina (Figura 1A e 2D), em todas as secções de parafina, e mantém-se na lâmina de vidro por meio do procedimento de H & E ou IHC coloração (Figuras 1B – 1D e 2D). Este óbvias auxiliares de sinalização visuais tanto o histotechnician e pesquisador na identificação de cada peça de tecido individuais e simplifica a comunicação como o histotechn…

Discussion

Preparação bem sucedida e utilização dos pontos exige a adesão cuidado para algumas etapas técnicas. Fusão do agarose hidroxietil deve ser feito lentamente e em fogo baixo. Derretendo rapidamente no calor elevado pode resultar em alguma repartição do agarose por menos de ótimos resultados. Ao cortar as fichas de corantes de carga em partes para processamento, assegurar que a espessura de cada peça é superior a 4,5 mm e não superior a 7 mm. As extremidades arredondadas são removidas como desperdício uma ve…

Materials

HistogelTM Specimen Processing Gel	Thermo Scientific	HG-4000-012	http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html
Tissue Marking Dye	Triangle Biomedical Sciences, Inc.	TMD-5	Any tissue marking dye would most likely be sufficient.
Arraymold Kit A 2 mm (60 core)	Arraymold	20015A	Any manual tissue arrayer would work similarly.