Spot the Correct Tissue Every Time in Multi-Gewebe-Blöcke
Summary
Der Zweck der Probenausrichtung Tag (vor Ort) soll als Orientierungshilfe, um in einzelnen Gewebeidentifikation in multi-Gewebe Paraffinblöcke unterstützen funktionieren. Diese Protokolle zeigen, wie sie ist leicht von gemeinsamen, kostengünstigen Histologie Materialien gebaut und dient als zuverlässige visuelle Marker in Paraffinblöcke und Abschnitte.
Abstract
Multi-Gewebe Paraffinblöcke bieten eine hohe Durchsatzanalyse mit erhöhter Effizienz, experimentelle Einheitlichkeit und reduziertem Zeit- und Kostenaufwand. Tissue Microarrays bilden die Mehrheit der Multi-Gewebe Paraffinblöcke, sondern zunehmend die Forscher mit nicht-angeordneten Blöcken mit größeren Gewebe von mehreren Personen, die ohne erhebliche Investitionen in die Planung und Ausstattung bieten viele der Vorteile von Tissue Microarrays können. Eine kritische Komponente jeder Mehrgewebeanalyse ist benutzt, um jedes Gewebe zu identifizieren Orientierungsverfahren. Obwohl Verfahren existieren, um die richtige Orientierung und Identifizierung von Gewebe in mehreren Gewebeblöcken zu erhalten, die meisten sind nicht gut geeignet, um nicht in einem Array besteht, kann wertvollen Raum innerhalb einer Anordnung zu verbrauchen und / oder nur schwer in der Standard histologisches Labor herzustellen. Die Probe Orientierung Tag (vor Ort) ist eine einfache, kostengünstige Orientierungshilfe, die eindeutig in die Paraffinblocks und alle Gewebeschnitte fo sichtbar istr zuverlässige Probenidentifikation in angeordnet und nicht in einem Array-Layouts. Der Fleck liefert Vorteile gegenüber bestehenden Orientierungsverfahren für Nicht-Array-Blöcke, wie es keinen direkten Modifikation des Gewebes erfordern und sorgt für Flexibilität bei der Anordnung der Gewebestücke.
Introduction
Die Fähigkeit, Gewebeproben von mehreren Personen in einem einzigen Paraffinblock einzubetten ermöglicht eine einfache Side-by-Side-Vergleich zwischen den Behandlungen und Einzelpersonen, eliminiert die Variabilität zwischen den Folien, und verringert die Kosten und Arbeitsbelastung der Schneiden und Färben von Proben. Diese Mehrgewebeblöcke werden typischerweise entweder als Gewebe-Mikroarrays (TMA) oder Paraffinblöcken, die Gewebe aus mehreren Individuen in einem nicht-Array-Layout erzeugt wird. Aufrechterhaltung der Probenidentität ist entscheidend für den Erfolg eines jeden Multigewebeanalyse. Forscher verwendet haben TMAs seit ihrer Entwicklung, um die Effizienz der Analyse zu verbessern, Variation zwischen den Folien zu reduzieren, sparen wertvolle Gewebe Ressourcen und die Zeit und die Kosten für die Experimente 1 zu reduzieren. Korrekte Orientierung TMA kann unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren erreicht werden, einschließlich Leerzeichen, Zeilen oder Spalten zwischen Gewebekerne 2-4, asymmetrische Anordnung der Kerngruppen 3, 5 (zB control vs. Behandlung), "Leuchtturm" Kerne 6 und bezeichnet Orientierung Kerne außerhalb des TMA Matrix 3 entfernt. Obwohl diese Verfahren eignen sich gut für TMAs meisten verbrauchen wertvolle TMA Kernraum und TMAs mit Lücken und Räume als Bezeichner kann verwirrend werden als Gewebekerne werden im Laufe der Zeit erschöpft. Darüber hinaus sind diese Verfahren nicht für die Verwendung in Mehrgewebeblöcke falls ohne ein Array-Format, da sie von Anomalien in der dicht geordneten Muster einheitlicher Mikroarraykerne als Bezeichner verlassen. Die meisten nicht in einem Array mit mehreren Gewebeblöcke müssen ungleichmäßige Gewebe aufnehmen und per Definition nicht die strukturierte Anordnung Raster, das diese Aberrationen stehen als Wahrzeichen macht anzuzeigen.
Obgleich es viele Vorteile bei der Verwendung eines TMA, einer der größten Nachteile ist die geringe Größe der Kerne, die nicht immer repräsentativ weitgehend heterogenes Gewebe 1. Nicht in einem Array mit mehreren Gewebeblöcke bieten viele ter profitiert von einem TMA, aber größere Gewebeproben oder ganze Organe aus Tierversuchen enthalten. Tissue Microarrays unter Verwendung von Einzeladern haben unterschiedliche Konkordanz mit ganzen Gewebeschnitte auf der Basis des Proteins von Interesse und viele erfordern mehrere Kerne für erhöhte Konkordanz 7-11. Aufgrund der Komplexität und heterogene Natur einiger Biomarker Phänotypen TMAs Verwendung auch eine große Anzahl von Kernen (> 10) kann immer noch unzureichend sein, und sie können andere als Mikroarrays für die Analyse 8 Methoden erfordern. Zusätzlich ist TMA Bau zeitaufwendig, technisch anspruchsvoll und erfordert die Anfangskosten und Investitionen in oder Zugang zu einem Gewebe Arrayer. Nicht in einem Array mit mehreren Gewebeblöcke können in jeder Grundlabor mit deutlich weniger Zeit und Mühe gemacht werden und ist eine gute Alternative für die Studien, die mehr erfordern als Gewebe-Arrays ermöglichen oder als Mittel zur Kostensenkung und Analyse zu vereinfachen.
Nicht in einem Array mit mehreren Gewebeblöcke ähnlich erfordern eine zuverlässige oderientation Marker Probenidentifikation zu verfolgen, aber die Entwicklung dieser Marker wurde begrenzt. Ein Großteil der Literatur beschreibt Gewebe Ausrichtung konzentriert sich auf die korrekte physiologische Orientierung für einzelne Gewebestücke wie Tätowieren des Gewebes mit Tinte 12 Einbetten, pre-Einbettung Gewebe in Agar-Gelatine vor der Verarbeitung 13 und Kennzeichnung bestimmter Gewebe mit Kerben 14 oder Nähte 15 . Obwohl funktionsfähig, sind diese Verfahren nicht ideal als Marker in mehreren Gewebeblöcken aufgrund ihrer Beschränkungen. Eine Naht wird durch schnell geschnitten werden und können nicht in jedem Abschnitt sichtbar sein. Pre-Einbettungstechniken Verwendung von Agar-Gelatine kann das Gewebe in der richtigen Ausrichtung während der Verarbeitung und Einbettung zu halten, aber nicht einen visuellen Hinweis, zwischen mehreren Proben in dem Paraffinblock und Folien zu unterscheiden. Kerben oder Farbstoff auf dem Gewebe Analyse erschweren oder zu verschließen wichtigen morphologischen Details. Alternativ Gewebe Identitätin einem nicht in einem Array mit mehreren Gewebeblock kann durch die Einbettung von Gewebestücke in einer asymmetrischen Anordnung gehalten werden, aber das 3 oder mehr Gewebestücke benötigt und möglicherweise nicht für eine optimale Anordnung der Gewebe für die Analyse zu ermöglichen.
Die Probe Orientierung Tag (vor Ort) wurde als ein einfaches und kostengünstiges Verfahren, um Gewebe in mehreren Gewebeblöcke eindeutig identifizieren entwickelt und bietet viele Vorteile gegenüber bestehenden Methoden Orientierung. Der Spot ist eine kleine, bunt, Kern Hydroxyethyl Agarose-Gel-Verarbeitung und Gewebemarkierungsfarbstoff, komponiert und mit Paraffin (2C) infiltriert. Der Spot Kern auf Ende eingebettet neben einem einzigen Gewebe in einem Multi-Gewebe Paraffinblock und erscheint als bunten Punkt im Block und in jedem Abschnitt (1A – D), unter Angabe des korrekten Ausrichtung des Blocks und Sektionen für die einfache Gewebeidentifikation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Erfolgreiche Vorbereitung und Nutzung der Spots erfordert eine sorgfältige Einhaltung der wenigen technischen Schritte. Schmelzen des Hydroxyethyl Agarose sollte langsam und bei schwacher Hitze durchgeführt werden. Schnell Schmelzen bei hoher Hitze kann in gewissen Zusammenbruch der Agarose weniger als optimalen Ergebnissen führen. Beim Schneiden der farbstoffbeladenen Stecker in Stücke für die Verarbeitung, dass die Dicke jedes Teils größer ist als 4,5 mm und nicht mehr als 7 mm betragen. Die abgerundeten Enden …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Brent Harris für die Bereitstellung von kritischen Durchsicht des Manuskripts danken. Diese Studien wurden an der Lombardi Comprehensive Cancer Center Histopathologie & Tissue Gemeinsame Ressource, die zum Teil von NIH / NCI Zuschuss P30-CA051008 unterstützt wird durchgeführt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des National Cancer Institute oder die National Institutes of Health.
Materials
| HistogelTM Specimen Processing Gel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html |
| Tissue Marking Dye | Triangle Biomedical Sciences, Inc. | TMD-5 | Any tissue marking dye would most likely be sufficient. |
| Arraymold Kit A 2 mm (60 core) | Arraymold | 20015A | Any manual tissue arrayer would work similarly. |
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