נקודת רקמות נכונות בכל זמן בלוקים רב-רקמה
Summary
המטרה של תג אוריינטציה הדגימה (SPOT) היא לתפקד ככלי נטייה לסייע בזיהוי רקמה בודד בלוקים פרפין רב-רקמה. פרוטוקולים אלה מדגימים כיצד הוא נבנה בקלות מחומרי היסטולוגיה משותפות, עלות נמוכה ומשמש כסמן חזותי אמין בלוקים פרפין וחתכים.
Abstract
בלוקים פרפין רב-רקמה לספק ניתוח תפוקה גבוה עם התייעלות, אחידות ניסיונית, וזמן מופחת ועלות. microarrays רקמות מרכיבים את רוב לוקי פרפין רב-רקמה, אבל יותר ויותר, חוקרים משתמשים בלוקים-ערוך שאינם מכילים רקמות גדולות יותר מאנשים רבים אשר יכול לספק רב של היתרונות של microarrays רקמות ללא השקעה משמעותית בתכנון ובציוד. מרכיב קריטי בכל ניתוח רב-רקמה הוא שיטת הנטייה משמשת לזיהוי כל רקמה בודדת. למרות ששיטות קיימות כדי לשמור על התמצאות וזיהוי של רקמות בלוקים רב-רקמה תקינה, רובם לא מתאימים היטב ללוקים-ערוך עישון, עשוי לצרוך שטח יקר בתוך מערך ו / או קשים לייצר במעבדה היסטולוגיה סטנדרטית. תג אוריינטציה הדגימה (SPOT) הוא כלי פשוט, נמוך נטייה עלות שנראית בבירור בלוקים פרפין וכל סעיפי הרקמות FOr זיהוי דגימה אמין בפריסות ערוכות ולא ערוכים. המקום מספק יתרונות על פני שיטות נטייה קיימות בלוקים-ערוך שאינם כפי שהוא אינו דורש כל שינוי ישיר לרקמות ומאפשר גמישות בסידור של יצירות רקמה.
Introduction
היכולת להטביע דגימות רקמה מאנשים מרובים בבלוק פרפין יחיד מאפשרת השוואת Side-by-צד קל בין טיפולים ויחידים, מבטלת השתנות בין שקופיות, ומפחיתה את העלות ועומס עבודה של חתך ומכתים דגימות. בלוקים רבי רקמות אלה מיוצרים בדרך כלל כשני microarrays הרקמות (TMA) או בלוקים פרפין המכיל רקמות מאנשים רבים בפריסה הלא מערך. תחזוקה של זהות מדגם היא קריטית להצלחתו של כל ניתוח רב-רקמה. החוקרים השתמשו TMAs מאז פיתוחם כדי לשפר את היעילות של ניתוח, להפחית וריאציה בין שקופיות, לחסוך במשאבים יקרי ערך רקמה, ולהפחית את הזמן ועלות של ניסויי 1. כיוון נכון של TMAs יכול להיות מושלם תוך שימוש במגוון של שיטות, כולל רווחים, שורות או עמודות ריקות בין ליבות רקמת 2-4, הסדר סימטרי של קבוצות ליבה 3, 5 (למשל, ניהול עבודותl לעומת טיפול), ליבות "מגדלור" 6, וליבות אורינטציה מיועדות ממוקמות מחוץ למטריצת TMA 3. למרות ששיטות אלו עובדות היטב עבור TMAs, רוב לצרוך שטח יקר ליבת TMA וTMAs עם פערים וחללים כמזהים עלולים להיות מבלבלים כמו ליבות רקמה מותשות לאורך זמן. בנוסף, שיטות אלה אינן מתאימות לשימוש בבלוקים רב-רקמה בלי פורמט מערך כי הם מסתמכים על חריגות בדפוס הורה ההדוקה של ליבות microarray אחידות כמזהים. רוב לוקים רב-רקמה-ערוך שאינם חייבים להכיל רקמות לא אחידים ו, מעצם הגדרתו, אינו מציגים את רשת המערך המובנה שגורמת סטיות אלה עומדות בתור ציוני דרך.
למרות שיש יתרונות רבים לשימוש TMA, אחד החסרונות הגדולים ביותר הוא בגודל הקטן של הליבות וזה לא תמיד נציג של רקמה במידה רבה הטרוגנית 1. בלוקים רב-רקמה ערוכות שאינם מספקים רבים של tהוא היתרונות של TMA, אך מכיל דגימות רקמה גדולות יותר, או איברים שלמים ממחקרים בבעלי חיים. microarrays רקמות באמצעות ליבות יחידים ששונה התאמה עם חלקי רקמות שלמים המבוססים על החלבון של עניין ורב דורשים ליבות מרובות עבור התאמה מוגברת 7-11. בשל המורכבות והטבע הטרוגנית של כמה פנוטיפים סמן ביולוגי, TMAs באמצעות אפילו מספר גדול של ליבות (> 10) עדיין יכול להיות מספק ועשויה לדרוש שיטות אחרות מאשר microarrays לניתוח 8. בנוסף, בניית TMA היא לצרוך זמן, תובעני מבחינה טכנית, ודורשת את העלות הראשונית והשקעה באו גישה לarrayer רקמה. בלוקים רב-רקמה ללא ערוכה יכולים להתבצע בכל מעבדה בסיסית עם פחות זמן ומאמץ והוא אלטרנטיבה חוקית ללימודים שדורשים יותר מאשר רקמת מערכים לאפשר או כאמצעי כדי לקצץ בעלויות ולפשט את הניתוח.
בלוקים רב-רקמה-ערוך שאינו דומים דורשים אמין אוientation סמן כדי לעקוב אחר זיהוי מדגם, עם זאת, הפיתוח של סמנים אלה היה מוגבל. חלק גדול מהספרות המתארת אוריינטצית רקמות מתמקד בנטייה פיזיולוגית נכונה להטבעת חתיכות רקמה בודדות, כגון קעקוע הרקמה עם דיו 12, טרום הטבעת רקמות באגרו-ג'לטין לפני עיבוד 13, וסימון רקמות מסוימות עם חריצים 14 או 15 תפרים . למרות פונקציונלי, שיטות אלה אינן אידיאליים כסמנים בלוקים רבי רקמות בשל המגבלות שלהם. תפר יהיה מחולק במהירות ולא יכול להיות גלוי בכל סעיף. טרום הטבעת טכניקות באמצעות אגר-ג'לטין עשוי לשמור על הרקמה בכיוון נכון בזמן עיבוד והטבעה, אך אינו מספק רמז חזותי להבחין בין דוגמאות רבות בבלוק פרפין ושקופיות. חריצים או צבע על הרקמה עלולים לסבך ניתוח או לחסום פרטים מורפולוגיים חשובים. לחלופין, זהות רקמהבגוש רב-רקמה-ערוך שאינו יכול להישמר באמצעות הטבעה של חתיכות רקמה בהסדר סימטרי, אבל זה דורש 3 או יותר חתיכות רקמה ועשוי שלא לאפשר להסדר אופטימלי של רקמות לצורך הניתוח.
תג אוריינטציה הדגימה (SPOT) פותח כשיטת קלה וזולה לזיהוי רקמות בלוקים רב רקמה באופן ברור ומציע יתרונות רבים על פני שיטות נטייה קיימות. הנקודה היא קטנה, צבעונית, מורכבת מליבת ג'ל Hydroxyethyl agarose עיבוד וצבע סימון רקמה, והסתננה עם פרפין (איור 2 ג). ליבת המקום מוטבעת על קצה ליד רקמה יחידה בבלוק פרפין רב-רקמה ומופיעה כנקודה צבעונית בגוש ובכל סעיף (איור 1 א – ד), באופן ברור המעידה על הכיוון הנכון של הבלוק וחתכים לזיהוי רקמות קל.
Protocol
Representative Results
Discussion
הכנה וניצול מוצלחת של הכתמים דורשים דבקות מקפידה כמה צעדים טכניים. היתוך של agarose hydroxyethyl צריך להיעשות לאט ובחום נמוך. התכה במהירות בחום גבוה יכולה לגרום להתמוטטות של כמה agarose פחות מתוצאות אופטימליות. בעת חיתוך תקעי הצבע-לאדן לחתיכות לעיבוד, להבטיח כי העובי של כל חתיכה ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לד"ר ברנט האריס למתן סקירה ביקורתית של כתב היד. מחקרים אלה נערכו בומברדי המקיף מרכז הסרטן histopathology והמשאבים משותפים רקמות אשר נתמך בחלקו על ידי P30-CA051008 מענק NIH / NCI. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לסרטן או המכונים הלאומי לבריאות.
Materials
| HistogelTM Specimen Processing Gel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html |
| Tissue Marking Dye | Triangle Biomedical Sciences, Inc. | TMD-5 | Any tissue marking dye would most likely be sufficient. |
| Arraymold Kit A 2 mm (60 core) | Arraymold | 20015A | Any manual tissue arrayer would work similarly. |
Riferimenti
- Jawhar, N. Tissue microarray: a rapidly evolving diagnostic and research tool. Ann. Saudi. Med. 29 (2), 123-127 (2009).
- Dhir, R. Tissue microarrays: an overview. Methods Mol. Bio. 441, 91-103 (2008).
- Parsons, M., Grabsch, H. How to make tissue microarrays. Diagn. Histopath. 15 (3), 142-150 (2009).
- Saxena, R., Bade, S. Ch. 7 Tissue Microarray – Construction and Quality Assurance. Immunohistochemical Staining Methods 6th ed. , (2013).
- Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O., Sauter, G. Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research. Int. J. Cancer. 94, 1-5 (2001).
- Rangel, C. The tissue microarray: helpful hints. J.Histotech. 25 (2), 93-100 (2002).
- Hammer, A., Williams, B., Dietz, H., Hamilton-Dutoit, S. High-throughput immunophenotyping of 43 ferret lymphomas using tissue microarray technology. Vet. Path. 44, 196-203 (2007).
- Eckel-Passow, J., Lohse, C., Sheinin, Y., Crispen, P., Krco, C., Kwon, E. Tissue microarrays: one size does not fit all. Diagn Pathol. 5, 48-57 (2010).
- Lin, Y., Hatem, J., Wang, J., Quinn, A., Hicks, D., Tang, P. Tissue microarray-based immunohistochemical study can significantly underestimate the expression of HER2 and progesterone receptor in ductal carcinoma in situ of the breast. Biotech. Histochem. 86 (5), 345-350 (2011).
- Wampfler, J., et al. Determining the optimal numbers of cores based on tissue microarray antibody assessment in non-small cell lung cancer. J Cancer Sci. Ther. 3, 120-124 (2011).
- Quagliata, L., Schlageter, M., Quintavalle, C., Tornillo, L., Terracciano, L. M. Identification of new players in hepatocarcinogenesis: Limits and opportunities of using tissue microarray (TMA). Microarray. 3, 91-102 (2014).
- Miettinen, M. A simple method for generating multitissue blocks without special equipment. Immunohistochem. Mol. Morphol. 20 (4), 410-412 (2012).
- Jones, M., Calabresdi, P. Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing. BioTechniques. 42, 569-570 (2007).
- Carson, F., Hladik, C. . Histotechnology: A Self-Instructional Text. , (2009).
- Suvarna, S., Layton, C., Bancroft, J. . Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques. 7th ed. , (2013).
