Spot de Tejidos correcta cada vez que en los bloques de múltiples tejidos

Summary

El propósito de la Orientación Tag Espécimen (spot) es funcionar como una herramienta de orientación para ayudar en la identificación de tejidos individuales en bloques de parafina de múltiples tejidos. Estos protocolos demuestran cómo se construye fácilmente de materiales histológicos comunes de bajo costo y sirve como marcador visual confiable en bloques de parafina y secciones.

Abstract

Los bloques de parafina Multi-tejido proporcionan análisis de alto rendimiento con una mayor eficiencia, la uniformidad experimental, y reducción del tiempo y coste. Microarrays de tejidos constituyen la mayoría de los bloques de parafina de varios tejidos, pero cada vez más, los investigadores están utilizando bloques no son de arrays que contienen los tejidos más grandes de varios individuos que pueden proporcionar muchas de las ventajas de microarrays de tejidos sin una inversión sustancial en la planificación y el equipo. Un componente crítico de cualquier análisis de múltiples tejidos es el método de orientación utilizado para identificar cada tejido. Aunque existen métodos para mantener la orientación adecuada y la identificación de los tejidos en bloques de varios tejidos, la mayoría no son muy adecuados a los bloques no dispuestos, puede consumir el espacio valioso dentro de una matriz y / o son difíciles de producir en el laboratorio de histología normal. La Orientación Tag Espécimen (spot) es una herramienta simple, de bajo costo que la orientación es claramente visible en los bloques de parafina y todas las secciones de tejido FOr identificación de la muestra de confianza en diseños dispuestos y no dispuestos. El SPOT ofrece ventajas sobre los métodos de orientación existentes para bloques no dispuestos, ya que no requiere ninguna modificación directa al tejido y permite flexibilidad en la disposición de piezas de tejido.

Introduction

La capacidad de incrustar muestras de tejido de múltiples individuos en un solo bloque de parafina permite una fácil comparación lado a lado entre los tratamientos y los individuos, elimina la variabilidad entre las diapositivas, y reduce el costo y la carga de trabajo de seccionamiento y tinción de muestras. Estos bloques de múltiples tejidos se producen típicamente ya sea como microarrays de tejidos (TMA) o bloques de parafina que contienen tejido de varias personas en un diseño no-matriz. Mantenimiento de la identidad de la muestra es crítica para el éxito de cualquier análisis multi-tejido. Los investigadores han estado usando TMA desde su desarrollo para mejorar la eficiencia de análisis, reducir la variación entre las diapositivas, conservar los recursos valiosos del tejido, y reducir el tiempo y el costo de los experimentos ^1. La orientación correcta de las TMA se puede lograr usando una variedad de métodos, incluyendo los espacios en blanco, filas o columnas entre núcleos de tejido ^2-4, disposición asimétrica de los grupos principales ^{3, 5} (por ejemplo, control vs tratamiento), núcleos "baliza" ^6, y núcleos de orientación designados situados fuera de la matriz TMA ^3. Aunque estos métodos funcionan bien para TMA, la mayoría consumen valioso espacio central TMA y TMA con huecos y espacios como identificadores pueden llegar a ser confuso como núcleos de tejido se agotan con el tiempo. Además, estos métodos no son apropiados para su uso en bloques multi-tejido sin un formato de matriz porque se basan en anomalías en el patrón fuertemente ordenada de núcleos de microarrays uniformes como identificadores. La mayoría de los bloques no son de arrays de múltiples tejidos deben adaptarse a los tejidos no uniformes y, por definición, no mostrar la cuadrícula matriz estructurado que hace que estas aberraciones se destacan como puntos de referencia.

Aunque hay muchas ventajas de utilizar una TMA, una de las desventajas más grandes es el pequeño tamaño de los núcleos que no siempre es representativa de tejido en gran medida heterogénea ^1. Bloques multi-tejido no-dispuestas proporcionan muchos de tse beneficia de un TMA, pero contiene muestras de tejido más grandes u órganos enteros a partir de estudios con animales. Microarrays de tejidos utilizando núcleos individuales tienen diferentes concordancia con las secciones de tejidos enteros basados ​​en la proteína de interés y muchos requieren múltiples núcleos para una mayor concordancia ^7-11. Debido a la complejidad y heterogeneidad de algunos fenotipos de biomarcadores, TMA utilizando incluso un gran número de núcleos (> 10) todavía puede ser insuficiente y puede requerir métodos distintos de microarrays para el análisis de ^8. Además, la construcción TMA es mucho tiempo, técnicamente exigente, y requiere que el costo inicial y la inversión en o acceso a una arrayer tejido. Bloques de múltiples tejidos no son de arrays se pueden hacer en cualquier laboratorio básico con mucho menos tiempo y esfuerzo y es una alternativa válida para los estudios que requieren más tejido que permiten matrices o como un medio para reducir los costos y simplificar el análisis.

Bloques no son de arrays de múltiples tejidos de manera similar requieren un fiable oientation marcador para el seguimiento de identificación de la muestra, sin embargo, el desarrollo de estos marcadores ha sido limitado. Gran parte de la literatura que describe la orientación tejido se centra en la orientación fisiológica correcta para incrustar piezas de tejido individuales, tales como el tejido con el tatuaje de tinta ^12, los tejidos en agar-gelatina pre-incrustación antes del procesamiento ^13, y marcado ciertos tejidos con muescas ¹⁴ o suturas ¹⁵ . Aunque funcional, estos métodos no son ideales como marcadores en bloques multi-tejido debido a sus limitaciones. Una sutura se seccionó a través rápidamente y puede no ser visible en todas las secciones. Técnicas que utilizan agar-gelatina pueden mantener el tejido en la orientación correcta durante el procesamiento y la incrustación de Pre-incrustación, pero no proporciona una señal visual para diferenciar entre múltiples muestras en el bloque de parafina y se desliza. Las muescas o colorante en el tejido pueden complicar el análisis u ocluir importantes detalles morfológicos. Alternativamente, la identidad de tejidoen un bloque no vistió de múltiples tejidos se puede mantener a través de la incorporación de piezas de tejido en una disposición asimétrica, pero esto requiere de 3 o más piezas de tejido y puede no permitir la disposición óptima de los tejidos para su análisis.

La Orientación Tag Espécimen (spot) se ha desarrollado como un método sencillo y de bajo costo para identificar claramente los tejidos en bloques de varios tejidos y ofrece muchas ventajas sobre los métodos de orientación existentes. El lugar es un pequeño colorido, núcleo, compuesto de hidroxietil gel de agarosa y procesamiento de tejidos de tinte marcado, y se infiltró con parafina (Figura 2C). El núcleo Punto está incrustado en el extremo próximo a un único tejido en un bloque de parafina de múltiples tejidos y aparece como un punto de colores brillantes en el bloque y en cada sección (Figura 1 A – D), lo que indica claramente la orientación correcta del bloque y secciones para la identificación de tejido fácil.

Protocol

1. Construcción de la mancha Añadir 50 mg de albúmina de suero bovino (BSA) a 1 ml de tejido tinte de marcado en un tubo cónico de 15 ml o 2 ml tubo de microcentrífuga y agitar durante 1 min o hasta que esté completamente disuelto. Nota: Para este protocolo, utilice bioquímica Grado BSA. Mientras que otros grados y purezas no han sido probados, se espera que el grado y la pureza no tendrían un impacto significativo en el éxito de la mancha. Heat 9 ml hidroxietil gel de agarosa de pro…

Representative Results

El spot aparece como una ronda, punto de colores brillantes en el bloque de parafina (Figura 1A y 2D), en todas las secciones de parafina, y permanece en el portaobjetos de vidrio a través del procedimiento de tinción H & E o IHC (Figuras 1B – 1D y 2D). Este obvias ayudas señal visual tanto la histotechnician e investigador en la identificación de cada pieza de tejido individuo y simplifica la comunicación como el histotechnici…

Discussion

Preparación exitosa y la utilización de los lugares requiere una cuidadosa adhesión a unos pasos técnicos. Fusión de la agarosa hidroxietil debe hacerse lentamente y al fuego lento. Melting rápidamente a fuego alto puede dar lugar a alguna ruptura de la agarosa por menos de unos resultados óptimos. Al cortar los tapones en colorantes cargados en trozos para el procesamiento, garantizar que el espesor de cada pieza es mayor que 4,5 mm y no excede de 7 mm. Los extremos redondeados se eliminan como residuos, ya que …

Materials

HistogelTM Specimen Processing Gel	Thermo Scientific	HG-4000-012	http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html
Tissue Marking Dye	Triangle Biomedical Sciences, Inc.	TMD-5	Any tissue marking dye would most likely be sufficient.
Arraymold Kit A 2 mm (60 core)	Arraymold	20015A	Any manual tissue arrayer would work similarly.