SPOT Tissue corretto ogni volta in blocchi multi-tessuto

Summary

Lo scopo della Orientamento Tag Specimen (spot) è la funzione di strumento di orientamento per aiutare nella identificazione dei tessuti dell'individuo in blocchi di paraffina multi-tessuto. Questi protocolli dimostrano come è costruito facilmente da, a basso costo materiali comuni istologia e funge da indicatore visivo affidabile in blocchi di paraffina e sezioni.

Abstract

Blocchetti di paraffina Multi-tessuti garantiscono elevata analisi produttività con una maggiore efficienza, l'uniformità sperimentale, e riduzione dei tempi e dei costi. Microarrays tessuti costituiscono la maggior parte dei blocchi di paraffina multi-tessuto, ma sempre di più, i ricercatori stanno utilizzando blocchi non schierati contenenti grandi tessuti provenienti da più persone che possono fornire molti dei vantaggi di microarray di tessuti senza sostanziali investimenti nella progettazione e attrezzature. Un componente critico di qualsiasi analisi multi-tessuto è il metodo di orientamento utilizzato per identificare ciascun tessuto. Anche se i metodi esistono per mantenere il corretto orientamento e identificazione dei tessuti in blocchi più tessuti, la maggior parte non sono particolarmente adatti per i blocchi non schierati, può consumare spazio prezioso all'interno di un array e / o sono difficili da produrre in laboratorio di istologia normale. L'orientamento Tag Specimen (SPOT) è uno strumento semplice, a basso costo che l'orientamento è chiaramente visibile in blocchi di paraffina e di tutte le sezioni di tessuto for identificazione del campione affidabile nei layout schierati e non schierati. Lo spot fornisce vantaggi rispetto ai metodi di orientamento esistenti per blocchi non disposte in quanto non richiede alcuna modifica diretta al tessuto e consente flessibilità nella disposizione dei pezzi di tessuto.

Introduction

La capacità di incorporare campioni di tessuto provenienti da più persone in un unico blocco di paraffina permette facile confronto side-by-side tra i trattamenti e gli individui, eliminando la variabilità tra le diapositive, e riduce i costi e il carico di lavoro di sezionamento e colorazione campioni. Questi blocchi multi-tessuti sono tipicamente prodotte sia come microarrays tissutali (TMA) o blocchi di paraffina contenenti tessuto da più individui in un layout non array. Manutenzione di identità del campione è fondamentale per il successo di qualsiasi analisi multi-tessuto. I ricercatori hanno utilizzato TMAs dal loro sviluppo per migliorare l'efficienza di analisi, ridurre le variazioni tra le diapositive, conservare le risorse tessuti pregiati, e di ridurre i tempi ei costi di esperimenti ^1. Il corretto orientamento della TMA può essere realizzato utilizzando una varietà di metodi, inclusi gli spazi, righe o colonne tra nuclei di tessuto ^2-4, disposizione asimmetrica dei gruppi principali ^{3, 5} (per esempio, Control vs trattamento), "beacon" core ^6, e core orientamento designati situati al di fuori della matrice TMA ^3. Anche se questi metodi funzionano bene per TMA, più consumano spazio prezioso nucleo TMA e TMA con lacune e spazi come identificatori possono diventare fonte di confusione come nuclei di tessuto sono esauriti nel corso del tempo. Inoltre, questi metodi non sono appropriati per l'uso in blocchi multi-tessuto senza un formato array perché si basano su anomalie del modello ben ordinato di core microarray uniformi come identificatori. La maggior parte dei blocchi non schierati multi-tessuto devono ospitare i tessuti non uniformi e, per definizione, non visualizzare la griglia matrice strutturata che rende queste aberrazioni spiccano come punti di riferimento.

Anche se ci sono molti vantaggi di utilizzare un TMA, uno dei maggiori svantaggi è la piccola dimensione delle anime che non è sempre rappresentativa del tessuto ampiamente eterogenea ^1. Blocchi multi-tessuto non schierati forniscono molte delle tegli beneficia di un TMA, ma contengono campioni di tessuto più grandi, o interi organi da studi su animali. Microarrays tessuto con singoli conduttori hanno diversi concordanza con intere sezioni di tessuto a base di proteina di interesse e molti richiedono core multipli per una maggiore concordanza ^7-11. Data la complessità e la natura eterogenea di alcuni fenotipi di biomarker, TMA utilizza anche un gran numero di core (> 10) può ancora essere insufficiente e può richiedere metodi diversi da microarray per l'analisi ^8. Inoltre, TMA costruzione è in termini di tempo, tecnicamente impegnativo, e richiede il costo iniziale e gli investimenti in o l'accesso a un Arrayer tessuti. Blocchi multi-tessuto non in array possono essere fatte in qualsiasi laboratorio di base con molto meno tempo e fatica ed è una valida alternativa per gli studi che richiedono più il tessuto di array consentono o come mezzo per ridurre i costi e semplificare l'analisi.

Blocchi non in array multi-tessuto simile richiedono un affidabile oientation marcatore per monitorare l'identificazione dei campioni, tuttavia, lo sviluppo di questi marcatori è stato limitato. Gran parte della documentazione che presenta orientamento tessuto concentra sul corretto orientamento fisiologico per l'incorporamento pezzi di tessuto individuale, come il tatuaggio del tessuto con inchiostro ^12, pre-embedding tessuti agar-gelatina prima della trasformazione ^13, e la marcatura certi tessuti con tacche ^{di 14} o ¹⁵ punti di sutura . Anche se funzionale, questi metodi non sono ideali come marcatori in blocchi multi-tessuto a causa delle loro limitazioni. Una sutura verrà sezionato attraverso rapidamente e può non essere visibile in ogni sezione. Tecniche che utilizzano agar-gelatina può mantenere il tessuto nel giusto orientamento durante la lavorazione e incorporamento pre-embedding, ma non fornisce un segnale visivo per distinguere tra più campioni nel blocco di paraffina e diapositive. Tacche o tintura sul tessuto possono complicare l'analisi o occludere importanti dettagli morfologici. In alternativa, l'identità del tessutoin un blocchetto di non schierati multi-tessuto può essere mantenuta attraverso l'incasso di pezzi di tessuto in una disposizione asimmetrica, ma questo richiede 3 o più pezzi di tessuto e non può consentire disposizione ottimale dei tessuti per l'analisi.

L'orientamento Tag Specimen (spot) è stato sviluppato come un metodo facile ed economico per identificare chiaramente i tessuti in blocchi multi-tessuto e offre molti vantaggi rispetto ai metodi di orientamento esistenti. Lo spot è un piccolo, colorato, nucleo composto da Idrossietil agarosio gel lavorazione e tessuti tintura marcatura, e infiltrati con paraffina (Figura 2C). Il nucleo punto è incorporato su fine accanto a un singolo tessuto in un blocco di paraffina multi-tessuto e appare come un punto colorato nel blocco e in ogni sezione (Figura 1A – D), indicando chiaramente il corretto orientamento del blocco e sezioni per l'identificazione dei tessuti facile.

Protocol

1. Costruzione di The Spot Aggiungere 50 mg di albumina sierica bovina (BSA) per 1 ml di tessuto tintura marcatura in un tubo da 15 ml o 2 ml provetta per microcentrifuga e vortex per 1 minuto o fino a completa dissoluzione. Nota: per questo protocollo, utilizzare biochimico BSA Grade. Mentre gli altri gradi e purezza non sono stati testati, si prevede che grado e la purezza non avrebbe un impatto significativo sul successo della località. Calore 9 ml idrossietil gel di agarosio trasformazio…

Representative Results

Lo spot appare come un giro, puntino dai colori vivaci nel blocco di paraffina (Figura 1A e 2D), in tutte le sezioni di paraffina, e rimane sul vetrino attraverso la procedura di H & E o colorazione IHC (Figure 1B – 1D e 2D). Questo evidenti aiuti segnale visivo sia la histotechnician e ricercatore a identificare ogni pezzo di tessuto individuo e semplifica la comunicazione come il histotechnician possono utilizzare questo segnale v…

Discussion

Preparazione di successo e l'utilizzo dei luoghi richiede un'attenta adesione ad alcuni passaggi tecnici. Fusione del agarosio idrossietil dovrebbe essere fatto lentamente ea fuoco basso. Melting rapidamente attraverso l'alta temperatura può provocare un certo dettaglio della agarosio per risultati non ottimali. Quando si taglia le spine colorante carichi a pezzi per la lavorazione, assicurarsi che lo spessore di ciascun pezzo è superiore a 4,5 mm e non supera 7 mm. Le estremità arrotondate vengono rimoss…

Materials

HistogelTM Specimen Processing Gel	Thermo Scientific	HG-4000-012	http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html
Tissue Marking Dye	Triangle Biomedical Sciences, Inc.	TMD-5	Any tissue marking dye would most likely be sufficient.
Arraymold Kit A 2 mm (60 core)	Arraymold	20015A	Any manual tissue arrayer would work similarly.