Spot de juiste Tissue Every Time in Multi-weefsel Blocks

Summary

Het doel van het Specimen Orientation Tag (spot) is gefunctioneerd als leidraad ter te helpen bij individuele identificatie weefsel in meerdere weefsels paraffineblokken. Deze protocollen laten zien hoe dit is opgebouwd uit zachte, low-cost histologie materiaal en dient als een betrouwbare visuele marker in paraffineblokken en secties.

Abstract

Multi-tissue paraffineblokken een hoge doorvoer analyse van doelmatigheid experimentele uniformiteit en verminderde tijd en kosten. Weefsel microarrays vormen de meerderheid van de multi-weefsel paraffine blokken, maar in toenemende mate, zijn de onderzoekers met behulp van niet-array blokken met grotere weefsels uit meerdere personen, die veel van de voordelen van het weefsel microarrays kan verschaffen zonder aanzienlijke investeringen in de planning en uitrusting. Een essentieel onderdeel van een multi-weefsel analyse is de oriëntatie methode voor elke afzonderlijke weefsel identificeren. Hoewel methoden bestaan ​​om de juiste oriëntatie en het identificeren van weefsels in multi-weefselblokken handhaven meeste zijn niet goed geschikt voor niet-array blokken, kan waardevolle ruimte consumeren in een matrix en / of moeilijk te produceren in de standaard histologische laboratoria. Het Specimen Orientation Tag (spot) is een eenvoudige, goedkope oriëntatie instrument dat is duidelijk zichtbaar in paraffine blokken en alle weefselcoupes for betrouwbaar specimen identificatie in arrayed en non-array layouts. De spot verschaft voordelen boven bestaande oriëntatiemethoden voor niet array blokken als er geen directe wijziging van het weefsel vereisen en maakt flexibiliteit in de regeling van stukken weefsel.

Introduction

De mogelijkheid om weefselmonsters van verschillende individuen te bedden in een paraffineblok het eenvoudig side-by-side vergelijking tussen behandelingen en individuen, elimineert variabiliteit tussen dia en vermindert de kosten en de werkbelasting van snijden en vlekken specimens. Deze multi-weefselblokken worden typisch bereid als hetzij tissue microarray (TMA) of paraffineblokken die weefsel van meerdere personen in een niet array layout. Onderhoud monster identiteit is cruciaal voor het succes van een multi-weefselanalyse. De onderzoekers zijn met behulp van TMA's, omdat hun ontwikkeling om de efficiëntie van de analyse te verbeteren, variatie te verminderen tussen dia's, sparen waardevolle middelen weefsel, en het verminderen van de tijd en de kosten van de experimenten ^1. Correcte oriëntatie van TMA kan worden uitgevoerd met verschillende methoden, zoals spaties, rijen of kolommen tussen weefselkernen ^2-4, asymmetrische opstelling van kerngroepen ^{3, 5} (bijvoorbeeld control versus behandeling), "baken" kernen ⁶ en aangewezen oriëntatie kernen buiten de TMA matrix ³ gevestigd. Hoewel deze methoden goed werken voor TMA's, de meeste verbruikt waardevolle TMA kern ruimte en TMA's met lacunes en ruimten als identifiers verwarrend kan worden als weefsel kernen zijn uitgeput na verloop van tijd. Bovendien zijn deze werkwijzen niet geschikt voor gebruik in multi-weefselblokken zonder matrix format omdat ze vertrouwen op afwijkingen in de strak gelast patroon van uniforme microarray kernen als id. De meeste niet-array multi-weefsel blokken moeten geschikt niet-uniforme weefsels en, per definitie, niet de gestructureerde matrix raster dat maakt deze afwijkingen opvallen als oriëntatiepunten niet weergegeven.

Hoewel er vele voordelen aan het gebruik van een TMA, een van de grootste nadelen is de geringe omvang van de kernen die niet altijd representatief mate heterogeen weefsel ^1. Non-array multi-weefsel blokken bieden veel van tHij profiteert van een TMA, maar bevatten grotere weefselmonsters, of hele organen uit dierproeven. Tissue microarrays gebruikt enkele kernen variëren overeenstemming met hele weefselsecties basis van het eiwit van interesse en vele vereisen meerdere kernen voor extra concordantie ^7-11. Vanwege de complexiteit en heterogeniteit van enkele biomarker fenotypes, TMA gebruikt zelfs grote aantallen geleiders (> 10) nog onvoldoende zijn en kunnen andere dan microarrays for analysis ⁸ vereisen. Bovendien, TMA constructie is tijdrovend, technisch veeleisende en vereist de initiële kosten en investeringen in of toegang tot een tissue Arrayer. Non-array meerdere weefselblokken kan geschieden in basisch laboratorium met aanzienlijk minder tijd en moeite en is een alternatief voor studies die meer weefsel vereisen dan arrays toestaan ​​of als middel om kosten te besparen en te vereenvoudigen analyse.

Non-array multi-weefsel blokken op dezelfde vereisen een betrouwbaar ofientation marker voor monsteridentificatie sporen echter de ontwikkeling van deze merkers is beperkt. In de literatuur beschreven weefseloriëntatiedetectoren gericht op juiste fysiologische richting voor het inbedden afzonderlijke stukken weefsel, zoals het weefsel tatoeage inkt ^12, pre-inbedding weefsels in agar-gelatine voorafgaand aan de verwerking ¹³ en markering bepaalde weefsels van inkepingen ¹⁴ of ¹⁵ hechtingen . Hoewel functioneel zijn deze werkwijzen niet geschikt als markers in multi-weefselblokken vanwege hun beperkingen. Een hechting zal snel worden gesegmenteerd door en mogelijk niet zichtbaar in elk deel zijn. Pre-inbedding technieken met behulp agar-gelatine kan het weefsel in de juiste oriëntatie tijdens de verwerking inbedden houden, maar biedt geen visuele aanwijzing om onderscheid te maken tussen meerdere monsters in paraffine blokken en glijbanen. Inkepingen of kleurstof op het weefsel kan analyse bemoeilijken of af te sluiten belangrijke morfologische details. Als alternatief weefsel identiteitin een niet-array meerdere weefselblokje kan worden gehandhaafd door middel van het inbedden van weefselstukken in een asymmetrische rangschikking, maar dit vereist 3 of meer weefselstukken en wellicht niet toelaat optimale plaatsing van weefsels voor analyse.

Het Specimen Orientation Tag (spot) is ontwikkeld als een gemakkelijke en goedkope methode om weefsels in multi-weefsel blokken duidelijk te identificeren en biedt vele voordelen ten opzichte van bestaande oriëntatie methoden. De plek is een kleine, kleurrijke, kern bestaat uit Hydroxyethyl agarose verwerking gel en weefsel markering kleurstof, en geïnfiltreerd met paraffine (figuur 2C). De plek kern is ingesloten op het einde naast een enkele weefsel in een multi-tissue paraffineblok en verschijnt als een helder gekleurde stip in het blok en in elke sectie (Figuur 1A – D), duidelijke vermelding van de juiste oriëntatie van het blok en secties voor eenvoudige weefsel identificatie.

Protocol

1. De bouw van The Spot Voeg 50 mg van runderserumalbumine (BSA) tot 1 ml weefsel markeerinrichting kleurstof in een 15 ml conische buis of 2 ml microcentrifugebuis en vortex gedurende 1 minuut of totdat het volledig opgelost. Opmerking: Voor dit protocol, gebruiken biochemische Grade BSA. Terwijl andere kwaliteiten en zuiverheid zijn niet getest, wordt verwacht dat de kwaliteit en zuiverheid van een significante invloed op het succes van de locatie, niet zou hebben. Verwarm 9 ml hydroxyethyl…

Representative Results

De plek verschijnt als een ronde, helder gekleurde stip in het paraffine blok (figuur 1A en 2D), in alle paraffine secties, en blijft op het glaasje door de H & E en IHC kleuring procedure (figuren 1B – 1D en 2D). Deze duidelijke visuele hint hulpmiddelen zowel histotechnician en onderzoeker om elke afzonderlijke stuk weefsel en vergemakkelijkt de communicatie histotechnician kan deze visueel waarschuwingssignaal de opstelling van d…

Discussion

Succesvolle voorbereiding en het gebruik van de vlekken vereist een zorgvuldige naleving van enkele technische stappen. Het smelten van de hydroxyethyl agarose moet langzaam en op een laag vuur worden gedaan. Snel smelten bij hoge temperatuur kan leiden tot enige afbraak van de agarose minder dan optimale resultaten. Bij het snijden van de kleurstof beladen pluggen in stukken verwerkt, opdat de dikte van elk stuk groter is dan 4,5 mm en niet meer dan 7 mm. De afgeronde einden verwijderd als afval zij niet uniform 5 mm d…

Materials

HistogelTM Specimen Processing Gel	Thermo Scientific	HG-4000-012	http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html
Tissue Marking Dye	Triangle Biomedical Sciences, Inc.	TMD-5	Any tissue marking dye would most likely be sufficient.
Arraymold Kit A 2 mm (60 core)	Arraymold	20015A	Any manual tissue arrayer would work similarly.