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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Langfristige High-Resolution Intravitalmikroskopie in der Lunge mit einem Vakuum-Stabilisierte Imaging-Fenster

Published: October 6, 2016 doi: 10.3791/54603
Automatic Translation
1, 5, 1,2, 1,2,5, 3,4, 3,4
1Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Obstetrics/Gynecology and Woman’s Health, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Anatomy & Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 4Gruss-Lipper Biophotonics Center Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 5Medical Research Council Centre for Reproductive Health, Queen’s Medical Research Institute, University of Edinburgh

Abstract

Metastasierung zu sekundären Standorten wie der Lunge, Leber und Knochen ist ein traumatisches Ereignis mit einer Mortalitätsrate von etwa 90% 1. Von diesen Standorten ist die Lunge der schwierigste im Körper, zarte Natur und entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung richtige Physiologie mit intravital optische Bildgebung aufgrund seiner geschlossenen Position zu beurteilen. Obwohl klinische Modalitäten (Positronen-Emissions-Tomographie (PET), Kernspintomographie (MRI) und Computertomographie (CT)) vorzusehen noninvasive Bilder dieser Gewebe fähig sind, fehlt ihnen die Auflösung notwendig, um die frühesten seeding Ereignisse zu visualisieren, mit einem einzigen Pixel bestehend aus fast tausend Zellen. Aktuelle Modelle von metastasierendem Lungenkrebs Seeding Postulat, die Ereignisse kurz nach Ankunft eines Tumorzelle für das Überleben und das anschließende Wachstum deterministisch sind. Das bedeutet , dass in Echtzeit intravital Imaging - Tools mit Einzelzellenauflösung 2 erforderlich sind , um die Phänotypen der Aussaat cel zu definierenls und diese Modelle zu testen. Während hochauflösende optische Bildgebung der Lunge hat verschiedene ex vivo Präparaten durchgeführt wurde unter Verwendung sind diese Experimente typischerweise Einzelzeitpunkt Assays und sind anfällig für Artefakte und mögliche falsche Schlüsse aufgrund der dramatisch veränderten Umfeld (Temperatur, Überfluss, Cytokine, usw. ) aus der Entnahme aus dem Brustraum und Kreislaufsystem 3 führt. Neuere Arbeiten haben , dass die Zeit-lapse intravital optische Bildgebung der intakten Lunge gezeigt ist möglich unter Verwendung einer Vakuumabbildungsfenster 2,4,5 stabilisiert jedoch typische Aufnahmezeiten wurden auf etwa 6 Stunden begrenzt. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die langfristige intravital Zeitraffer-Bildgebung der Lunge Durchführung eines solchen Fensters über einen Zeitraum von 12 Stunden verwendet wird. Die Zeitraffer-Bildsequenzen dieser Methode unter Verwendung ermöglichen die Visualisierung und Quantifizierung von Zell-Zell-Interaktionen, Membrandynamik und Gefäßperfusion in der Lunge. Wir weiter dEscribe eine Bildverarbeitungstechnik, die eine beispiellos klare Sicht auf die Lunge microvasculature gibt.

Introduction

Hochauflösende optische Abbildungsintravital hat zum Verständnis vielen biologischen Prozessen entscheidend erwiesen, so dass Einzelzelle und subzellulären Parameter gemessen und quantifiziert. In der Krebsforschung hat intravital Bildgebung von Tumor- und Stromazellen führte zur Entdeckung vieler Mikroumgebungs Wechselwirkungen 6-11 , die nur in dem intakten Tier sind.

Entdeckungen über im Zusammenhang mit Mikroumgebungen intravasation und Verbreitung von Tumorzellen bei Brustkrebs einzelne Zelle auflösende optische Bildgebung in vivo unter Verwendung von sogar 12 bis 16 neue Marker für die Prognose und das Ansprechen auf eine Behandlung bei Brustkrebs - Patienten geführt. Die besten Imaging-Technologien für die Anzeige tief in intakten inneren lebenswichtigen Organe sind die klinischen Modalitäten (MRT, PET, CT), die eine hervorragende Aussicht auf das gesamte Organ bieten und Pathologien zeigen können, noch bevor sie klinische Symptome hervorrufen. Sie sind nicht in der Lage, however, um die frühesten Stadien der Metastasierung zeigen und die zellulären Mechanismen der Tumorprogression Fahr aufgrund ihres Mangels an Einzelzellauflösung. Durch die Zeit, Lungenmetastasen in dieser Modalitäten sichtbar sind, sind sie gut etabliert und proliferieren. In Anbetracht der Schätzung , dass 90% der disseminierten Tumorzellen , die in die Lunge gelangen entweder nicht 17 überleben oder bleiben zunächst ruhend 18 und der Beobachtung , dass sie ankommen viel früher als bisher 19 erwartet, die Abbildung der frühesten Schritte der Ankunft und das Überleben von entscheidender Bedeutung wird zu das Verständnis des Prozesses des metastasierten Seeding und ein erneutes Auftreten des Tumorwachstums an entfernten Standorten.

jedoch Durchführung dieser Beobachtungen in der Lunge hat sich als äußerst schwierig erwiesen; die überwiegende Mehrheit der Imaging - Studien haben ex vivo oder Explantation Präparate verwendet 20-23, die nur einen Blick in die Lunge zu einzelnen Zeitpunkten geben. Während diese Vorbereitungen nützliche Informationen zur Verfügung gestelltenrmation, sie nicht ein vollständiges Verständnis der Wechselwirkungen, Ursache-Wirkungs-Beziehungen und Dynamik ergeben, die zwischen den verschiedenen Komponenten des Mikroumgebung auftreten. Das Fehlen eines richtigen Kreislaufsystems (und damit einhergehenden Ungleichgewicht der Homöostase) und der Trennung vom Rest des Immunsystems des Körpers macht es wünschenswert , die Schlussfolgerungen zu validieren , die diese Präparate in intaktem Gewebe in vivo zu erzeugen.

Viele Gruppen haben intravital Bildgebung der intakten Lunge durchgeführt 2,4,5,24-33 mit Wearn und Deutsch die Pleura Schicht 24 und Terry entlarven die erste die erste chirurgisch zu sein ein implantierbares Abbildungsfenster 25 zu nutzen.

Hochauflösende Abbildung in der Lunge wird durch die Lunge des konstanten Bewegung und verschiedene Techniken wurden entwickelt, um diese Einschränkung zu überwinden stark behindert. Wagner und Filley 27 studierte die natürliche Bewegung des Hundelungeund entwickelt , um ihre chirurgische Protokoll ihrer implantierten Fenster über einen relativ stationären Bereich zu lokalisieren , während Wagner Vakuum in seinem Fenster chirurgische Vorbereitung verwendet , um das Gewebe 28 zu immobilisieren. 34 Bronchus Klemm, sequentielle Apnoe und Gated Imaging, überabgetasteten Erwerb, Verkleben des Lungenlappens und Vakuum: Seit dieser Zeit wurde eine Vielzahl von Techniken , um die Lunge zu Bild einschließlich verwendet worden. Jeder von ihnen hat seine Vor- und Nachteile und keiner Technik hat sich als überlegen weitere 34 entstanden. Zum Beispiel Bronchus Klemm- und sequenziellen Apnoe verändern die normale Austausch von Gasen in der Lunge und kann Atelektase verursachen. Gated Imaging und überabgetastete Erwerb nicht an diesen Nachteilen leiden, sondern erfordern eine hohe Geschwindigkeit oder spezielle Bildgebungsgeräte nicht allgemein zugänglich. Schließlich beide Verklebung der Lunge und der Vakuumtechnik beide der oben erwähnten Nachteile zu vermeiden, kann aber Scherkraft induzierten Verletzungen aufweisen, wenn Sie darauf, nicht tak isten. In den letzten Jahren hat sich die Vakuumfenster für den Einsatz bei Mäusen mit Hilfe einer konfokalen und Multiphotonen - Mikroskopie 4,5,33 und hervorragende hochauflösende Bildgebung erreicht wurde 2 miniaturisiert und angepasst. Tabelle 1 dieser reichen Geschichte zusammenfasst und unterstreicht die Papiere , die neu beschreiben Fortschritte bei der Verwendung von intravital Bildgebung der Lunge Fenster.

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von erweiterten Zeitraffer Multiphotonen- Intravitalmikroskopie zur Bild Metastase in der Live, intakte Lunge mit der höchsten subzellulärer Auflösung möglich. Bilder werden für bis zu 12 h erworben ein Multi Mikroskop mit einer hohen numerischen Apertur Objektivlinse und mehrere Photomultiplier-Röhre (PMT) -Detektoren ausgestattet ist. Transgener Mausmodelle werden zusammen mit fluoreszierenden hohem Molekulargewicht Dextran und fluoreszierende Protein transfizierten Tumorzellen zu fluoreszenz Label nativen Makrophagen genutzt (die Gefäße und Tumorzellen zu beschriften respectively). Während diese Wahl von fluoreszenzmarkierten Zellen Visualisierung von Tumorzell-Endothelzellen-Makrophagen-Interaktionen und Dynamik ermöglicht, wird dieses Protokoll für jeden Stamm von fluoreszierenden oder nicht-fluoreszierenden Maus arbeiten. Nach der Erfassung wird die Restdriftbewegung (falls vorhanden) ein Fidschi - Plugin 35,36 und benutzerdefinierte Makros Zeit Durchschnitt des Gefäßkanals durch unmarkierten zirkulierenden Blutzellen zu eliminieren Blitzen verursacht unter Verwendung eliminiert.

Während dieses Protokoll auf die Bildgebung Metastasierung konzentriert, sind die Techniken, die für viele andere biologische Prozesse zu beobachten mit hochauflösenden Einzelzell-Bildgebung in der Lunge.

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Protocol

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften für den Einsatz von Wirbeltieren, einschließlich der vorherigen Zustimmung des Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care und Use Committee durchgeführt.

1. Erstellen von fluoreszenzmarkierten Maus-Modell und Tumorzellen

  1. Herstellung von 100 ml von 0,1% (w / v) Rinderserumalbumin / phosphatgepufferter Salzlösung (BSA / PBS) -Puffer durch Mischen von 0,1 g BSA mit 100 ml PBS.
  2. Bereiten fluoreszierend markierten Tumorzellen durch stabile Transfektion.
    HINWEIS: Hier verwenden wir E0771-LG - Zellen, eine hochgradig metastatische Derivat von E0771 Maus - Mamma - Adenokarzinom - Zellen 37 , die von metastatischen Tumoren in der Lunge von C57BL / 6 - Maus entwickelt isoliert wurden intravenös mit elterlicher E0771 38 - Zellen injiziert.
    1. 24 Stunden vor der Transfektion Platte 1 x 10 5 EO771-LG Zellen auf einer 60 - mm - Gewebekulturschale auf 2 ml antibiotic free 10% FBS (fötales Rinderserum) DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) und bei 37 ° C und 5% CO 2 inkubieren.
    2. Zum Zeitpunkt der Transfektion inkubieren 2 ug des fluoreszierenden Proteins Vektor mit 10 & mgr; l Transfektionsreagenz für 30 min, bevor 190 & mgr; l der reduzierten Serummedien hinzugefügt wird.
    3. Wasch EO771-LG Zellen mit Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (D-PBS) einmal und füge vorsichtig das Transfektionsgemisch.
    4. Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO 2 für 6 Stunden.
    5. Waschen der transfizierten Zellen und der Kultur in 2 ml komplettem DMEM (10% FBS, 1 mM Pyruvat, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin) für 2 Tage.
    6. Wash-Zellen mit 2 ml sterilem PBS, 500 & mgr; l von 0,25% Trypsin-EDTA und Inkubation für 2 min bei 37 ° C.
    7. Sammeln Zellsuspension und mischen sich mit mindestens 1 Volumen von komplettem DMEM und Spin-down bei 280 x g.
    8. Resuspendieren der Zellen in 1 ml komplettem DMEM und erweitern Sie die Zellkultur in10 cm Gewebekulturschale.
    9. Starten Sie Selektion von transfizierten Zellen, die durch Zugabe von 700 ug / ml G418 selektiven Antibiotikum bis 8 ml komplettem DMEM und Kultur für eine Woche, Wechsel-Medium alle drei Tage.
  3. Reichern die fluoreszierende Population von transfizierten Zellen , die in G418 durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) 39,40 unter Selektion wurden.
    1. Wasche die Zellen mit 5 ml PBS und 1,5 ml von 0,25% Trypsin.
    2. Inkubieren für 2 min bei 37 ° C und mit mindestens einem Volumen von komplettem DMEM mischen.
    3. Sammeln Zellsuspension und des Abschaltens bei 280 xg und resuspendieren Zellen in 1 ml steriler 0,1% (w / v) BSA / PBS-Puffer.
    4. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 40 & mgr; m-Mesh und stellen Sie die Lautstärke auf 1 ml mit 0,1% BSA / PBS-Puffer für die Sortierung.
    5. FACS-Sortieren der 10% hellste Bevölkerung basierend auf Fluoreszenzspektrum 41 der FACS - Sorter mit.
    6. Kultur die sortierten Zellen für eine weitere Woche under Auswahl (700 ug / ml G418 in komplettem DMEM).
    7. fluoreszierend markierten Zellen durch Fluss neu wählen Zytometrie durch Schritte 1.3.1 bis 1.3.6 noch einmal zu wiederholen.
    8. Nach einer zweiten Selektionsrunde trypsinize, Filter und resuspendieren Zellen in 0,1% BSA / PBS, wie beschrieben (Schritte 1.3.1-1.3.4). Einstellen Konzentration auf 2 x 10 6 Zellen / ml für die einzelne Zelle in 96 - Well - Platten Sortieren der FACS - Sorter werden.
    9. Bereiten Sie 3-5 96-Well-Platten mit 100 ul Voll DMEM für die Sammlung. Zur Verbesserung der Überlebenszeit nach dem Sortieren, 100 & mgr; l filtrierten Kulturmedium aus Gerichten , wo die EO771-Zellen LG 42 angebaut wurden.
    10. Nach dem Sortieren der Zellen in den Platten mit 96 Vertiefungen, kehren Zellen zur Kultur für 2 Tage (37 ° C, 5% CO 2).
    11. Identifizieren Brunnen mit tragfähigen einzelnen Klone durch Prüfung unter einem inversen Mikroskop mit 5-facher Vergrößerung.
    12. Trypsinize und tragfähige Klone erweitern und Zellen für die Sicherung einzufrieren.
      1. Waschen Sie Brunnen mit graufgrund Klone mit 100 ul sterilem PBS. Werden 50 & mgr; l von 0,25% w / v Trypsin und Inkubation 2 Minuten bei 37 ° C. In 50 ul komplettem DMEM und Transfer zum sterilen V-Boden oder rundem Boden 96-Well-Platte bei 280 g für 5 min auf Spin-Down.
      2. Die Zellen in 100 & mgr; l von 700 & mgr; g / ml G418 vollständigen DMEM und jeder Klon in 12-Well-Platten plattieren. In 400 ul komplettem DMEM mit G418 und Kultur bis zur Konfluenz.
      3. Waschen Vertiefungen mit 500 ul PBS, 100 & mgr; l von 0,25% Trypsin und Inkubation 2 min bei 37 ° C. 100 l komplettem DMEM und Spin-down für 5 Minuten bei 280 x g. Die Zellen in 100 ul komplettem DMEM mit G418 und Platte Zellen in Platten mit 6 Vertiefungen bis zur Konfluenz.
      4. Sobald konfluent, trypsinize Zellen, Spin-down und resuspendieren in 10% DMSO in FBS Zelle Aktien einzufrieren.
      5. Halten 1/10 der Zellsuspensionen in Kultur indem man sie in 100 mm-Gewebekulturschalen zur Auswertung ihres metastatischen Potential Plattieren.
  4. Testen metastatischen Potential ausgewählter Klone.
    1. Trypsinize und resuspendieren Zellen in Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 2,5 x 10 6 Zellen / ml und 200 ul injiziert in C57BL / 6 - Mäusen intravenös über die Schwanzvene.
    2. Nach 2 Wochen Lungengewebe zu sammeln , wie zuvor 23 beschrieben und Tumorbelastung durch Oberflächenanzahl oder stereo Verfahren 43 zu quantifizieren. Wählen Sie Klone mit hohem metastatischem Potential für intravital Bildgebung.
  5. Raise MacBlue (eine myeloische spezifischen Promotor , cyan fluoreszierendes Protein (GFP) Ausdruck (CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16)) Reporter - Mäuse 44.
    HINWEIS: In der Regel verwendet werden, Mäuse, zwischen 8 und 12 Wochen, aber Mäusen so früh wie 7 und so spät wie 20 Wochen wurden getestet, wie gut zu funktionieren.

2. Multiphotonenionisation Mikroskop Set up und Imaging Vorbereitung

HINWEIS: Während dieses Protokoll kann auf jedem m durchgeführt werdenultiphoton Mikroskop, wobei das System verwendet , um die Daten in diesem Protokoll gezeigt erwerben wurde zuvor 45 im Detail beschrieben.

  1. Schalten Sie alle Mikroskop und Laserkomponenten einschließlich der Zwei-Photonen-Laser und den Detektoren mindestens eine Stunde vor dem gewünschten Bildgebungszeit.
  2. Kurz vor der Operation mit dem Mikroskop die Leistung des Lichteingangssignals zu messen, den Kopf des optischen Leistungsmesser in den Strahlengang kurz vor dem Mikroskop platziert und stellen Sie gelesen, um den Laser-End-Knöpfe Resonatorspiegel, bis die maximale Lichtintensität bei 880 nm auf die optische Leistungsmesser.

3. Vakuumsystem einrichten

  1. Kleben Sie das Deckglas in die Abbildungsfenster (Supplemental Abbildung 1) mit Cyanacrylat. Lassen Sie mindestens 4 Stunden für den Kleber vollständig trocknen.
    Hinweis: dieser Schritt auch vor der Zeit durchgeführt werden.
  2. Schneiden Sie die 100 ul Pipettenspitze in der ersten Zeile von der kleinen Öffnung und schließen Sie das ungeschnittene Ende der dünnen vacuum Schlauch.
  3. Schließen Sie das Vakuumsystem gemäß Abbildung 1 und Abbildung 2 einen Brief.
  4. Mit dem Vakuum und dem offenen Ende blockiert, stellen Sie den Vakuumregler für <3 inHg.
    HINWEIS: Endgültige Einstellung des Vakuumniveaus wird durch Beobachtung der Gefäße in vivo durchgeführt werden.
  5. Tragen Sie einen dünnen Film aus Petroleumfett auf der Unterseite der Bildplatte aus der Objektivlinse Tauchmedium zu verhindern, dass durch die Bildplatte weggesaugt.
  6. Setzen Sie die Druckplatte auf dem Mikroskoptisch.
    HINWEIS: Die benutzerdefinierte Bildplatte (Supplemental Abbildung 3) ist ein Blatt von 1/8 "dicken Aluminium gefräst sowohl in der Tischeinlage Raum zu passen und mit einem Durchgangsloch in der Mitte zur Aufnahme des Abbildungsfenster.
  7. Legen Sie die Vakuumfenster in die Bildplatte mit dem Deckglas nach unten.
  8. Sterilisieren alle Oberflächen und Instrumente, einschließlich Abbildungsstufe Platte und Imaging-SiegDow mit 70% Ethanol.
  9. Schließen Sie das Schnittende der Pipettenspitze in die Vakuumfenster und kleben Sie den Schlauch nach unten auf die Bildplatte.
  10. Bringen Sie das Ziel nahe dem Abbildungsfenster und legen einen großen Tropfen von Wasser zwischen dem Ziel und dem Deckglas.
  11. Stellen Sie sicher, dass es keine undichten Stellen aus dem Deckglas sind durch die zentrale Öffnung des Vakuumfensters blockiert und sicherstellen, dass der Wassertropfen zwischen dem Objektiv und Deckglas nicht abgesaugt bekommt.
    HINWEIS: Ein alter Stil Computermaus Ball über das Fenster platziert ist nützlich, um die zentrale Öffnung zu blockieren.

4. Chirurgie

  1. Bereiten Sie den sterilen OP-Bereich.
    1. Legen Sie alle Instrumente leicht zu erreichen. Sterilisieren alle Oberflächen und Instrumente einschließlich OP-Bereich und chirurgische Instrumente mit 70% Ethanol.
  2. Binden Sie einen 3-Zoll-Länge von 2-0 Naht mit dem Katheter, ¼ Zoll über die Buchse mit einem doppelten Knoten.
  3. Bereiten Schwanzvenenkatheter folgenden dem veröffentlichten Protokoll von Harney et al. 46.
  4. Verwendung eines Infrarot (IR) Heizlampe, erwärmen das Tier in seinen Käfig für ~ 5 min um den Blutfluss in die Schwanzvene zu erhöhen und in Kathetereinführung zu erleichtern. Es wird empfohlen, das Tier zu halten, um physiologischen Temperaturen während des chirurgischen Eingriffs erwärmt entweder einer Wärmelampe oder eine wärmende Pad.
  5. Anesthetize das Tier mit 5% Isofluran und stellen Sie sicher, dass es keine Antwort auf eine Zehe Prise ist.
  6. Anwenden ophthalmische Salbe zu den Augen des Tieres.
  7. Anwenden Enthaarungslotion für 10-30 sec Haar von der linken Seite des Tieres zu entfernen; von der Mittellinie der Brust zu ¼ von hinten und von der Achselhöhle unter dem Brustkorb nur.
  8. Reinigen Sie das überschüssige Lotion und sterilisieren ausgesetzt Haut mit 70% Alkohol.
  9. Bringen Sie eine sterile Spritze gefüllt mit PBS zum Schwanzvenenkatheter und einfügen und Band an Ort und Stelle nach dem veröffentlichten Protokoll von Harney et al. 46. Sicherstellen, dass das Band sicher an der Nadel anhaftet und sich nicht frei in den Spalt zwischen dem Schwanz und dem Band.
  10. Intubate die Maus entweder nach dem veröffentlichten Protokoll von Das et al. 47 oder von DuPage et al. 48
  11. Schalten Sie den Ventilator und legen Sie es 135 Atemzüge pro Minute und 200 & mgr; l von Isofluran-Sauerstoff-Mischung zu liefern.
  12. Schließen Sie den Trachealkatheter an das Beatmungsgerät.
  13. Bewegen Sie die Maus auf den OP-Bereich. Größte Vorsicht walten lassen nicht den Katheter zu entfernen.
  14. Binden Sie die 2-0 Naht um die Schnauze der Maus unter der Frontzähne.
  15. Kleben Sie den Katheter in die Schnauze.
  16. Band das linke Vorderbein mit dem Katheter es aus dem Operationsfeld zu halten.
  17. Senken Sie die Isofluran-Narkose auf eine Erhaltungsniveau von 2,5% und überprüfen gibt es keine Antwort auf eine Zehe Prise.
  18. Mit den scharfen Schere, entfernen 1 cm 2 der Haut über der linken Brustwand.
  19. Aufzug ter Brustfettpolster und ätzen mit offen liegenden Blutgefäße mit dem Kauter Stift.
  20. Resezieren die Fettpolster, indem sie mit den scharfen Schere schneiden.
  21. Entfernen Sie die Muskelschicht auf den Brustkorb nach unten, indem sie mit den scharfen Schere schneiden. Achten Sie darauf, nicht die axillaris Lauf an der Basis des forelimb zu schneiden.
  22. Verwenden einer Pinzette zu greifen und heben Sie die 6. Rippe. Mit den scharfen in einem flachen Winkel gehalten Schere (~ 5 °) schneiden die Rippe in der Nähe des Randes der Öffnung in der Haut. Nehmen Sie nicht extrem vorsichtig die freiliegende Lungengewebe zu berühren.
  23. Widen die Öffnung in der Brustwand durch Entfernen vier aufeinander folgenden Rippen die gesamte Lungenlappen zu belichten.
    Hinweis: Halten Sie die Öffnung mindestens 5 mm vom Brustbein entfernt, das Herz zu vermeiden.
  24. Vorsichtig die Maus heben durch den Schwanz und Trachealkatheter greifen und die Maus in die Mikroskop-Abbildungs ​​Bühne bewegen.
  25. Mit dem Vakuum ab, füllen Sie die Kammer des Vakuumfensters mit PBS.
  26. Kehren Sie die Maus und die Position der exponierteLunge über das Vakuum-Abbildungsfenster.
  27. Drehen Sie langsam auf das Vakuum auf etwa 3-5 Zoll Quecksilber den Kugelhahn mit.
  28. Legen Sie einen Haltegeschirr aus Seidenpapier in der Mitte gefaltet zweimal über die Brust der Maus und Band auf die Tischplatte als 2 in einen Brief gezeigt.
  29. Clip der Oberschenkelsensor des Pulsoximeter auf den Oberschenkel des Tieres und die Software starten.
  30. Legen Sie die Klimakammer auf der Bühne und schalten Sie die Hitze mit der Maus auf einer physiologischen Temperatur zu halten.
  31. Reduzieren Sie die Ebene von Isofluran auf 1-1,5% Narkose zu halten und den Blutfluss aufrechtzuerhalten.

5. Intra Imaging

  1. Bringen Sie die 25 x 0,95 numerische Apertur (NA) Objektivlinse in der Nähe des Deckglases und fügen Sie zwischen ihnen ein großer Tropfen Wasser.
  2. Mit Epifluoreszenz-Modus zu sehen, FITC Kanal und bringen das Lungengewebe in den Fokus.
  3. Wenn nicht vor der Operation durchgeführt, inject Tumorzellen durch die Schwanzvene Katheter.
    1. Trennen Sie die PBS Spritze aus der Schwanzvene Katheter.
    2. Legen Sie eine sterile Spritze , die mit 100 & mgr; l der Tumorzellsuspension (2 x 10 7 Zellen / ml in PBS Maximum).
      Hinweis: Dieser Schritt kann im Voraus erfolgen Krebszelle Ankunft in der Lunge zu verschiedenen Zeitpunkten zu studieren.
    3. Verbinden Sie die Spritze mit Tumorzellen auf die Schwanzvene Katheter.
    4. die Tumorzellen in die Schwanzvene langsam injizieren.
    5. Trennen Sie die Spritze mit den Tumorzellen aus der Schwanzvene Katheter.
    6. Schließen Sie das PBS Spritze an den Schwanzvenenkatheter.
      HINWEIS: Identifizieren der Positionen aller der Tumorzellen vor dem Einspritzen des Dextran als es schwierig wird, die Tumorzellen aus dem Dextran-Signal über das Okular nach der Injektion zu unterscheiden.
  4. Finde Tumorzellen Bild
    1. Für einzelne Tumorzellen Bildgebung, alle Tumorzellen zu finden und ihre Standorte mit th aufnehmene Mehr Panel der Software.
      1. Suchen Sie alle Sichtfelder Bild durch die Tumorzellen im Mikroskop Okular zu beobachten.
      2. In der Software-Schalter, mit dem Multipanel, indem Sie auf die Multi-Point-Button klicken und speichern die Position der Zelle auf der Position hinzu Schaltfläche anklicken.
    2. Für Mosaik-Bildgebung, suchen Sie den Ursprung des Mosaiks und stellen Sie die Abbildungskoordinaten
      1. Lokalisieren einer Position in der linken oberen Ecke der Struktur erfasst werden.
      2. Null die x-, y- und z-Koordinaten der Bühne durch die Taste "Zero" auf der Bühne Controller drücken.
      3. Legen Sie das entsprechende Liste der Mosaik-Koordinaten auf, indem Sie auf die Schaltfläche "Laden" klicken und die Liste auswählen.
        HINWEIS: Ein Beispiel Liste für eine 2 x 2-Mosaik mit einer 20% igen Überlappung eines 500 um Sichtfeld wäre: Pos.1 = (0,0), Pos. 2 = (400,0), Pos. 3 = (0400), Pos. 4 = (400,400).
  5. Entfernen Sie die Spritze with PBS in den Venenkatheter Schwanz und ersetzen mit der Spritze das Dextran enthält.
  6. Langsam injizieren über die Schwanzvene Katheter durch Injektion von 50 & mgr; l steriler PBS die Leitung zu spülen, anschließend in PBS in der Maus zu 100 ul 20 mg / ml 155 kDa Rhodamin-Dextran gelöst werden. Führen Sie keine Blasen in der Leitung. Bei Bedarf injizieren Dextran mindestens eine Stunde nach der Injektion von Krebszellen, so dass das Gesamtvolumen auf der Maus verabreicht nicht überschreitet 4 ml / kg / h.
  7. Richten Sie Abbildungsparameter.
    1. Schalten Sie das Mikroskop auf Multimodus.
    2. Stellen Sie den Zoom auf einen Faktor von 2X, indem Sie auf die Taktsignale Schaltfläche klicken und den Zoomfaktor Feld zu aktualisieren.
    3. Stellen Sie die Laserleistung auf ~ 10% (~ 10-15 mW bei der Probe) von den Detektoren und Laser-Taste klicken und den Tsunami Power Slider bis 10 eingestellt werden.
  8. Bild jeder Lage, das Vorhandensein von Tumorzellen zu verifizieren und die Strömung und die Integrität des Vascu visualisierenlature.
    HINWEIS: Die Schiffe sollten mit fließenden Erythrozyten vollständig durchbluteten erscheinen und fluoreszierenden Dextran sollte innerhalb der Gefäße ohne Leckage zu den Extravasalraum enthalten sein. Etwa 10 bis 20 Tumorzellen innerhalb der freien Öffnung des Vakuumfensters erwartet werden.
  9. Stellen Sie die Starttiefe von jeder Stelle abgebildet werden.
    1. Für jeden Standort einstellen durch Drehen des Fokusknopf auf der Bühne Controller Bild die obere Scheibe der Tumorzelle die z-Position.
    2. Positionieren Sie die Zelle in der Mitte des Sichtfeldes.
    3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Mehr, klicken Sie auf die Position des Sichtfeldes um es zu markieren und die Add-Klick für die Schaltfläche Löschen gefolgt der Zelle gespeicherten Position in der Mehr Liste zu ersetzen.
    4. Visuell beobachten, in jeder Position, die relative Helligkeit der Tumorzelle.
  10. Speichern Sie die neuen Positionen von jeder der Zellen, die durch in der Multipoint-Panel ein auf die Schaltfläche Speichern klickend einen Dateinamen angeben.
  11. Für die Bildgebung von einzelnen Tumorzellen, Pick drei Zellen von etwa äquivalente Helligkeit und löschen Sie alle anderen Orte aus der Mehr Liste von in der Liste auf ihrer Position klicken und dann auf die Schaltfläche Löschen klicken.
  12. Klicken Sie auf die Detektoren und Laser - Taste und verschieben Sie die Regler für die PMT - Verstärkung der grünen und roten Kanäle 45 , so dass die Signale unterhalb der Sättigung sind.
  13. Stellen Sie den Regler für den blauen Kanal 45 , so dass Makrophagen Cyan erscheinen.
    HINWEIS: Jede zweite harmonische Signal nur in den blauen Kanal erscheinen und kann zuvor 45 beschrieben , indem Sie die Kanal Subtraktionsverfahren aus den Cyan Makrophagen getrennt werden.
  14. Stellen Sie den Z-Stapel Starttiefe auf 0 & mgr; m und die Endtiefe bis 24 & mgr; m von der Z-Stufe an der Stelle zu bewegen und auf die Start- und End-Tasten sind.
    Hinweis: Zellen innerhalb dieser Tiefe wird mit dem besten Signal sichtbar gemacht werden, umRauschen und Auflösung.
  15. Stellen Sie die z Schrittweite bis 3 um.
  16. Stellen Sie die Bildparameter folgende Parameter vorher 45,49 beschrieben.
    1. Für die Bildgebung von einzelnen Tumorzellen, klicken Sie auf die Taktsignale Taste und dann 4 eingeben V in den Zoomfaktor Feld (entspricht einem Zoomfaktor von 1,5x), geben Sie 3 in den Rahmen Durchschnitte Feld ein und klicken Sie auf Time-Lapse-Taste und 10 eingeben in den Zeitraffer-Feld.
      HINWEIS: Diese Einstellungen werden erwerben 1 Frame alle 3 Sek.
    2. Für Mosaik-Bildgebung, klicken Sie auf die Timing-Signale Taste und einen Zoomfaktor von 1,5 V (entspricht einem Zoomfaktor von 4X) einzugeben, geben Sie 3 in der Anzahl der Rahmenmittelwerte und klicken Sie auf die Time-Lapse-Taste und geben Sie 10 in die zeit- verfallen Zeitverzögerung Feld.
      HINWEIS: Diese Einstellungen werden erwerben 1 Frame alle 3 Sek.
  17. Aktivieren Sie die Mehr, Z-Stapel und t-Lapse Imaging Modi, indem Sie auf ihre Schaltflächen klicken.
  18. Drücken Sie die Aufnahmetaste, um Bilder aufzunehmen.
    NICHTE: Lungengewebe ist sehr empfindlich und anfällig für Photoschäden. Wenn nach dem Zeitpunkt der Blutfluss Reihenaufnahmen in dem abgebildeten Bereich hält, der Laser sehr wahrscheinlich zu hoch ist und nachfolgende Abbildung anderer Felder müssen mit geringerer Leistung erfolgen.
  19. Alle 30-45 min, injizieren langsam 50 ul PBS oder Kochsalzlösung Hydratation des Tieres zu halten.

6. Euthanasie

  1. Erhöhen Sie die Isofluran bis 5%.
  2. Halten Sie das Tier unter 5% Isofluran bis 30 Sekunden, nachdem er aufhört, das Tier von der Bühne zu atmen und zu entfernen.
  3. Führen Sie Zervikaldislokation vollständige Euthanasie zu gewährleisten.

7. Bildanalyse

  1. Für Einzelzell-Imaging Experimente:
    1. Laden Sie Bilder in Fidschi und formatieren Sie sie als Hyperstack.
    2. Für jede z-Scheibe in der Hyperstack, die Zeitraffer-Film spielen und auf Reste von xy Bewegung suchen. Wenn Rest xy Bewegung gefunden wird, gilt das Plugin STACKREG 36 auf den Stapel aufgerufendie Bewegung zu beseitigen.
  2. Für Mosaik-Bildgebung Experimente:
  3. Laden Sie Bilder in Fidschi und nähen sie zusammen durch die Mosaic Stitching-Makro (Supplemental-Code-Datei Mosaic Stitching) zu öffnen und die Eingabe von Informationen über die Bilder wie das Verzeichnis, die Datei Basisnamen, die Anzahl der Felder x und y im Mosaik und die Anzahl von Scheiben und Zeitpunkten.
    HINWEIS: Aufgrund der wie Java interpretiert Verzeichnisse, Ordnernamen müssen zwei Schrägstriche als Unterordner Separatoren haben. Aufgrund von Einschränkungen in der Einbau-Plugin Pairwise Stitching, Namen Basisdatei müssen alle Striche nicht enthalten.
  4. Um eine klare Sicht auf die Grenzen des Gefäßsystems zu erhalten, im Durchschnitt zusammen alle Zeitpunkte für den Blutkanal in einem einzigen Bild und dann dieses Bild replizieren als Hintergrund für jedes Bild des Films der anderen Kanäle.
    HINWEIS: Diese einfach gemacht wird, indem das Makro Blut Averaging Führen läuft (Supplemental-Code-Datei Blut Averaging Perform).

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Representative Results

Um die Art der Ergebnisse zeigen , die mit diesem Verfahren erreicht werden kann, injizierten wir E0771-LG Tumor mit dem fluoreszierenden Protein Clover in die Schwanzvene von Mäusen MacBlue 44 markierten Zellen zu Zeitpunkten vor der Operation variiert. Nach der Operation wurde 155 kD Rhodamin markiertes Dextran IV injiziert das Gefäßsystem und Zeitraffer-Bildgebung zu markieren durchgeführt wurde.

Wenn Mäuse Abbildung 24 Stunden nach der Injektion, sind einzelne Zellen innerhalb des Gefäßsystems sichtbar, die Interaktion mit Makrophagen und Monozyten. Ein Beispiel hierfür ist in Figur 2A (Supplemental Film 1) gezeigt. Hier wird ein optischer Schnitt eines einsamen Tumorzelle (grün) 12 & mgr; m tief in die Lungengefäße eingelegt wird über 5 Stunden bebildert und 20 Minuten, wie es vorübergehend mit einem residenten Makrophagen (cyan) in Wechselwirkung tritt. Gefäßsystem wird durch hochmolekulare Dextran markiert. Die Stabilität derBildgebung ist derart , dass aufeinanderfolgende Z-Stapel Abbildungs des Feldes erfasst werden können und eine 3 - dimensionale Rekonstruktion kann (2B, Supplemental Movie 2) hergestellt werden.

Verwendung der Mikroskopeinstellungen beschrieben in dem Protokoll für mosaic Bildgebung ermöglicht die Abbildung von Strukturen größer als ein einzelnes Bildfeld. Zum Beispiel Abbildung 3 Erwerb einer einzigen metastatischen Läsion zeigt, 12 Tage nach der Injektion. Das 5 x 5 Mosaik zeigt ein 890 & mgr; m Sichtfeld über 205 min bei 15 (3A, Tafel links; Supplemental Movie 3) und 25 & mgr; m (3A, rechts) unter der Oberfläche der Lunge. Trotz der großen Sichtfeld, die hohe Auflösung der zugrunde liegenden Rahmen des Mosaik - Komposition ermöglicht die Erfassung subzellulärer Ereignisse wie die Mitose von einer einzelnen Zelle , wie durch Chromosomentrennung (3B hervorgeht, SupplementalFilm 4).

Intravaskuläre Injektion eines hochmolekulares Dextran fluoreszenz Ergebnisse bei der Markierung des Gefäßlumens markiertem jedoch unmarkiert zirkulierende Erythrozyten und Leukozyten in das Dextran okkludieren. In den kleinen Kapillaren der Lunge, ist die Okklusion vollständig , was zu einem Blinken des Dextran - Signal und ein Verlust der Definition der Gefäßgrenzen (Abbildung 4, links; Supplemental Film 5). Die hohe räumliche Stabilität, die durch dieses Protokoll bereitgestellt wird, ermöglicht zeitliche Mittelung des Blutkanal, ohne dass diese verschwimmen, wodurch die temporäre Überdeckungen wiederherzustellen. Die anderen Signalkanäle können dann auf das Gefäßsystem überlagert werden , um eine klare Sicht auf die Gefäßgrenzen zur Verfügung zu stellen (Abbildung 4, rechts; Supplemental Film 6).

Abbildung 1
Abbildung 1:. Aufbau des Vakuumsystemhaus Vakuum mit einem Vakuumregler auf definierte Ebene genutzt und eingestellt. Eine Erfassung Kolben verhindert eine Verschmutzung des Reglers und Vakuumsystem durch Körperflüssigkeiten. Ein dünner, biegsamer Schlauch befördert das Vakuum in eine Pipettenspitze Schnitt in den Vakuumanschluss des Abbildungsfensters. Das Abbildungsfenster ist fit in eine vertiefte Nut in der Abbildungsplatte ihre Lagestabilität in Bezug auf das Mikroskopobjektivlinse zu halten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Single Cell Imaging in der Lunge (A) noch von einem Zeitraffer - Film aus einer einzigen Zelle Tumor im Kapillarbett der Lunge 24 h nach der Schwanzvene.Injektion. (Red = Blutgefäße, Grün = Tumor Cells, Cyan = Makrophagen) (B) Stable Bildgebung ermöglicht dreidimensionale Rekonstruktion der Bilddaten über die Zeit. Die Blutgefäße wurden Zeit für Klarheit gemittelt. (Rot = Blutgefäße, Grün = Tumorzellen, Blau = Makrophagen). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Die Stabilität der Lunge ermöglicht hochauflösende, Groß-Sichtfeld Imaging in der Lunge durch die sequentielle Erfassung und Zusammennähen mehrerer geringer Vergrößerung Felder (A) 5 x 5 Mosaik ein 890 & mgr; m Sichtfeld zeigt von. eine metastatische Läsion in der Lunge 12 Tage nach Injektion von Tumor bei 15 & mgr; m unterhalb der Lungenoberfläche entnommenen Zellen Schwanzvene(Linkes Bild). Rechte Bild zeigt die gleiche metastatischen Läsion bei 25 & mgr; m unterhalb der Lungenoberfläche. (B) Die einzelnen hochauflösende Felder zeigen subzellulärer Prozesse wie chromosomale Ausrichtung (gelbe Pfeile) und Trennung (rote Pfeile) während der Zellteilung. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: intravaskuläre Injektion von fluoreszenzmarkierten Hochmolekulares Dextran Marks das Lumen des Gefßsystems Außer wenn Unlabeled Erythrozyten und anderen zirkulierenden Zellen Verschließen Sie das Fluoreszenzsignal (A) Occlusion führt zu einer unvollständigen Markierung , die in der Zeit bewegt , in einem blinkenden Effekt verdeck resultiert. die Gefäßgrenzen. (B) Die hoheräumliche Stabilität des Vakuumfensters kann der Blutkanalzeit gemittelt, das Ausfüllen der temporäre Überdeckungen und klar zu definieren, die Gefäßgrenzen zu sein. Die anderen Kanäle werden dann ohne Mittelung überlagert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Jahr Erster Autor / Letzter Autor Tier Chirurgie Art der Bildgebung Notizen
1926 Wearn & Deutsch Katzen Brustwand geschnitten Pleura Schicht nach unten. Die zweite Öffnung durch Membrane aus nach unten zu Pleura für die Beleuchtung. Hellfeldmikroskopie. First "Fenster" durch Pleura Wand.
1939 Terry Katzen Die Rippen sind getrennt, 1 in. Fenster implantiert, Luft aus Thorax mit Vakuum entfernt. unter Verwendung von polarisiertem Licht, Binokular und Hautmikroskop. Erste optische Fenster implantiert. Gebrauchte Vakuum Gewebe Fenster zu zeichnen.
1963 de Alva & Rainer Kaninchen und Hunde Ein oder zwei Rippen sind reseziert und 1 in. Fenster eingefügt und an der Brustwand vernäht. Haut wurde über Fenster geschlossen und Tier erlaubt, um zu heilen. Vor Bildgebung wurde Haut seziert Fenster zu belichten. Gebrauchte High-Speed-Stroboskop-Kinematografie durch eine niedrige mag (11X) Ziel. Erste Überleben Fenster.
1965 Wagner & Filley Hunde Rechts forelimb entfernt, eine Rippe geschnitten und Fenster eingesetzt und vernäht. Reflection Mikroskopie mit 22X Ziel. Erste relativ Bewegung frei Fenster ohne Vakuum.
Wagner Hunde Eine Rippe reseziert, 3 in. Fenster implantiert. Gewindeflansch Schrauben an Fensterdichtung an der Brustwand zu bilden. Hellfeldmikroskopie mit hoher Vergrößerung 100X -Ölimmersionsobjektiv. Erstes Fenster verwenden Vakuum Gewebebewegung zu stabilisieren.
1992 Groh & Goetz Kaninchen Eine Rippe reseziert, 1.2. Fenster implantiert. Gewindeflansch Schrauben an Fensterdichtung an der Brustwand zu bilden. Vakuum angelegt. Epifluoreszenzmikroskopie mit 25X Ziel. Erster Einsatz eines Vakuumfenster mit Epifluoreszenz.
1994 Fingar & Wieman Ratten 2 Rippen reseziert, 1 in. Fenster implantiert und an der Brustwand und die Haut vernäht. Epifluoreszenzmikroskopie mit 40X-Objektiv. Erste Überlebens Fenster in Ratten.
2000 Fuňákoshi & Mitsui Mäuse Gesamte Brustwand entfernt. Vakuum-Saugring rechten Lunge angebracht. Die konfokale Mikroskopie mit einem 20x-Objektiv. Erster Einsatz von Vakuumfenster in Mäusen.
2005 Lamm & Glenny Ratten Gesamte Brustwand entfernt, 1 in. Fenster Lunge angebracht. Reflexion und Epifluoreszenzmikroskopie mit einem 20x-Objektiv. Erster Einsatz von Vakuumfenster in Ratten.
2008 Tabuchi & Keubler Mäuse 3 Rippen reseziert, Kunststoff-Folie aufgebracht Öffnungsloch in der Brustwand abzudichten. Air über intrapleural Katheter entfernt. Epifluoreszenzmikroskopie mit 20x-Objektiv. Erste Kunststoff-Folie zu verwenden Öffnung in der Brustwand abzudichten.

Tabelle 1: Historischer Überblick der Develwicklung von Intra Lung Imaging - Windows. Viele neuartige intravital Bildgebung der Lunge Fenster wurden im Laufe der Jahre entwickelt, wobei das jüngste bei Mäusen zur Verwendung miniaturisiert, für die Gewebe Stabilisierung einsetzt Vakuum und ausreichend hoher Auflösung zu offenbaren subzellulärer Detail der Lage sein, zu erreichen.

Ergänzende Abbildung 1: Konstruktionszeichnung des Vakuum - Imaging - Fenster Bitte hier klicken , um diese Figur zum Download bereit .

Supplemental Abbildung 2: Fotografien von Vakuum - Setup Bitte hier klicken , um diese Figur zum Download bereit .

Ergänzende Abbildung 3: Design - drawing Bühne Plate Adapter Bitte hier klicken , um diese Figur zum Download bereit .

Supplemental 1
Supplemental Film . 1: Film - Stills in 2A (Rechtsklick zum Herunterladen).

Supplemental 2
Supplemental verschieben . 2: Film von 3D - Rekonstruktion in 2B verschiedenen Blickwinkeln gezeigt und Progression über die Zeit zeigt (Rechtsklick zum Download).


Supplemental Film . 3: Film von 5x5 Mosaik bei 15 & mgr; m unter Lungenoberfläche in 3A gezeigt (Rechtsklick zum Download).

Supplemental 4
Supplemental Film . 4: Film einer einzelnen Zelle in 3B dargestellt Mitose in der Lunge unterziehen (Rechtsklick zum Download).

Supplemental 5
Supplemental Film 5: Film von 4, linke Tafel zeigt Okklusion und fLasch. (rechts Download anklicken).

Supplemental 6
Supplemental Film . 6: Film von 4, rechte Tafel Wiederherstellung der Gefäß Definition nach der Blutlungs zeigt (Rechtsklick zum Download).

Supplemental - Code - Datei. Mosaic Stitching Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.

Supplemental - Code - Datei. Blut Averaging Perform Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Hohe Auflösung in vivo optische Bildgebung mit fluoreszenzmarkierten funktionellen Tags kombiniert, wie Proteine und Antikörper hat sich unser Verständnis der metastatischen Kaskade dramatisch zugenommen. Es wurde eine direkte Visualisierung und Quantifizierung der Einzelzelle und subzellulären Parameter in Tumorzellen, Wirtszellen und ihrer Mikroumgebung aktiviert. Diese Abbildungs innerhalb des Primärtumors hat dazu geführt, beispielsweise zu der Entdeckung von diskreten Mikroumgebungen , die unterstützt entweder Wachstum Invasion oder Verbreitungs 6,7. Im Falle einer Invasion hat in vivo - Bildgebung die bevorzugte Rolle des Co-migrational streaming von Makrophagen und Tumorzellen in intravasation 7,50 ergab.

In sekundären Standorten wie der Lunge, das Verständnis der Dynamik von Tumorzellverhalten in den frühesten Stadien der Metastasierung, einschließlich der Pre-Mikrometastasierung Seeding Stadium, wenn einzelne oder kleine Gruppen von Tumorzellen gelangen undInteraktion mit dem Schiff Endothel Blut wird nur erreicht werden, hochauflösende optische Bildgebung. Standard-klinische Bildgebungsverfahren haben nicht die Auflösung benötigt entweder die Feinstruktur des Kapillarbetts oder die Morphologie und die Wechselwirkung von Zellen auf Einzelzell Auflösung sichtbar zu machen. Die bildgebenden Verfahren in diesem Protokoll vorgestellt erfüllen diese anspruchsvolle Aufgabe.

Intravital Imaging - Fenster , wie sie in Tabelle 1 aufgeführten bieten einen erheblichen Vorteil gegenüber Ex - vivo - Lungenpräparate durch geeignete Lungenphysiologie einschließlich Perfusion, Anschluss an das Immunsystem zu erhalten und mehr als nur eine statische Sicht der zellulären Dynamik bietet. Das Vakuum stabilisiert Fenster bieten insbesondere ein Maß an Gewebestabilität, die den Erwerb von hoch registrierten Bildern ermöglicht, so dass dreidimensionale Rekonstruktionen (2B) und die Fähigkeit , für großes Sichtfeld Mosaik - Bildgebung (Abbure 3A). Zusammen bieten diese eine Reihe von Ansichten der Lunge, von einer histologischen Typ Ansicht geringer Vergrößerung , die die Gewebemorphologie gibt, zu einer Unter zellulären Ansicht , dass auch chromosomale Trennung offenbaren kann und ruhende und Dividieren Tumorzellen (3B) unterscheiden. Mehrere Erfassungskanäle können mehrere Zelltypen und deren Wechselwirkungen gleichzeitig visualisiert werden (2A).

Während das Protokoll einige technische Geschick, Übung und Aufmerksamkeit auf einige wichtige Schritte und Punkte dauert die Erfolgsrate der Verfahren und Aufnahmezeiten von bis zu 12 Stunden verbessern zu erwarten. Es ist wichtig, das Lungengewebe, um sicherzustellen, weit über dem Fenster (Schritt 4.25) zentriert ist. Dadurch wird sichergestellt, dass das Vakuum gleichmäßig aufgetragen und vollständig über das Lungengewebe (Schritt 4.27). Wird das Gewebe zum Zentrum wird in der Bewegung des Gewebes zur Folge haben. Der Rückhaltebaum (Supplemental Abbildung 2) wird verwendet , to Verringerung der durch Verengung der Intercostalmuskeln während der natürlichen Atemzüge induzierte Bewegung das Tier nimmt. Es sollte über die Maus fest sitzen, aber nicht die Brust komprimieren. Zu viel Kompression übt Druck auf alle der Lappen der Lunge sowie das Herz und führt zu einer reduzierten Lebensfähigkeit der Maus. Wenn Dextran nicht beobachtet wird, in die Lungengefäße nach der Injektion (Schritt 5.8) fließt, wird das Lungengewebe entweder durch unsachgemäße Handhabung während der Operation beschädigt oder das Vakuumniveau ist zu hoch. Das Absenken der Vakuum von 0,5-1 Zoll Hg kann versucht werden, um zu sehen, ob Fluss wiederhergestellt wird. Wenn der Fluss nicht wiederhergestellt wird, oder wenn es Strömung, aber Dextran extravaskulär beobachtet wurde das Lungengewebe wurde in diesem Bereich beschädigt, und es wird dem Bild eine andere Sichtfeld erforderlich sein. Aufrechterhaltung der korrekten Blutfluss in dem Abbildungsbereich ist wichtig, um sicherzustellen, dass die richtige Physiologie gemessen wird. Da Sauerstoff an das Gewebe aus dem Inneren der Alveolen und nicht durch die vas geliefertenculature, ischämischer Hypoxie ist unwahrscheinlich. Dennoch kann unperfused Gefäße führen möglicherweise zu einer veränderten Sauerstoff / CO 2 Ebenen und wird auch verhindern , dass Leukozyten aus dem Erreichen der Gewebe von Interesse im Umlauf. Visualisierung des strömenden Erythrozyten können als Indikator für den entsprechenden Lungenfunktion verwendet werden. Lungengewebe ist sehr empfindlich und auch anfällig für Photoschäden. Wenn nach dem Zeitpunkt der Blutfluss Reihenaufnahmen in dem abgebildeten Bereich hält, der Laser sehr wahrscheinlich zu hoch ist und nachfolgende Abbildung anderer Felder müssen mit geringerer Leistung erfolgen. Wir haben ~ 10-15 mW bei der Probe gefunden ausreichend helle Bilder ohne Lichtschäden zu erzeugen, wenn entweder GFP oder Clover mit transfizierten Zellen (die viermal die mittlere Helligkeit hat). Minimale Helligkeitspegel für die fluoreszierende Proteine ​​sind stark abhängig von Mikroskop-Parameter und den Expressionsspiegel in den Zellen und muß empirisch getestet werden.

In diesem Protokoll werden Tumorzellen mit einem hellen cytoplas gekennzeichnetmic fluoreszierendes Protein , das eine freie Sicht auf den Zellkörper und intrazellulären Räumen bietet, die das Protein (dh Kern) auszuschließen. Makrophagen sind gekennzeichnet durch ein transgenes Mausmodell syngenen an die Tumorzellen verwendet. Etikettieren beiden Zelltypen ermöglicht die Visualisierung ihrer direkten Interaktion in Echtzeit. Die verlängerte Dauer der Bildgebung ermöglicht die Quantifizierung der Frequenz, Dauer und das Ausmaß, mit denen Krebszellen mit Makrophagen in einem physiologisch relevanten Kontext interagieren.

Wenn richtig ausgeführt, ermöglicht dieses Verfahren Bewegung frei, Mehrkanal, hochauflösende, Single-Cell-Imaging in der intakten Lunge für einen Zeitraum von bis zu 12 Stunden. Die Verwendung einer hohen numerischen Apertur Objektiv wie die 25X 0.95NA und die Multi Fähigkeiten für den elektronischen Zoom ermöglicht die höchste Auflösung optische Bildgebung in der Lunge bisher gesehen.

Intravaskulär injiziert fluoreszierend, hochmolekulare Dextran performs die doppelte Rolle des vaskulären Raum Kennzeichnung und seine Integrität zu überprüfen. 155 kDa-Dextran verwendet Diffusion durch die interendothelialen Räume zu verhindern. Jedes Anzeichen eines Mangels an Gefäßfluß oder vaskulärer Leckage in den extravaskulären Raum zeigt Schädigung des Gewebes durch unsachgemäße Handhabung oder übermäßige Vakuum.

Schließlich können einzigartige Bildverarbeitungstechniken eingesetzt werden, die die Vorteile der hohen räumlichen Stabilität dieses Protokoll aufzunehmen. Da die nicht-markierten Erythrozyten und anderen Leukozyten das fluoreszierende Dextran auszuschließen, wenn sie durch die Kapillaren passieren kann dieses Signal über die Zeit gemittelt werden, um das Blinken zu entfernen, die sie schaffen. Dies bietet eine gut definierte Ansicht des Gefßsystems sonst nicht möglich.

Einschränkungen dieser Technik umfassen sowohl die invasive Art der Operation, die möglicherweise die Verwendung von Krankheiten für das Studium erschwert , die das Tier (zB späten Stadium metastasiertem Krebs zu schwächen,akute Sichelanämie Zelle), und die Tatsache, dass die Operation Terminal ist, die sie zu einem einzigen, wenn auch lange verwenden begrenzt (bis zu 12 h), Imaging-Sitzung. Ferner kann 51, Glukosegabe gegeben werden , angesichts der langen Dauer der Imaging - Sitzung und dem niedrigen Leberglykogens Reserve von Mäusen potentielle Fehlerquellen in Experimenten zu vermeiden.

Dieses Protokoll könnte möglicherweise mit injizierbaren fluoreszenzmarkierten Antikörper modifiziert werden, entweder anstelle von oder zusätzlich zu dem Dextran, um andere Strukturen oder Zelltypen in Echtzeit zu kennzeichnen. Dadurch werden die Fähigkeiten zur Analyse und seziert die Tumor-Mikroumgebung durch die direkte Visualisierung von Tumorzellen-Wirt-Zell-Interaktionen und Dynamik in Echtzeit zu erweitern.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 - 20" Hg Vacuum McMaster Carr 4172K12  Vacuum Regulator
Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe McMaster Carr 5346K13 Vacuum Regulator Hose Adapter
Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50 ml Corning Life Sciences Glass 5360-50 Vacuum Flask
Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm dia.  Ted Pella, Inc. 260368 Cover slips
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22 g x 1 in.  Exel International 26746 Tracheal Catheter
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0 VWR 95056-992 String
Liquid Super Glue, Clear, 0.14 oz Hendel Corp. LOC1647358 Cyano-acrylate Glue
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran Sigma-Aldrich T1287-500MG 155 kD Dextran
Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length McMaster Carr 5155T12 Thin Tubing & Tubing for Luer
Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length  McMaster Carr 5181K24  Thick Tubing
Depillatory Lotion Nair -
Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/1 Tubing for tail vein catheter
30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle BD 305128 Needles for tail vein catheter
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs  Fisher Scientific 867WCNOGLUE
Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID McMaster Carr 5117k51 Connectors between tubes
One-Hole Rubber Stoppers Fisher Scientific 14-135F Stopper for Vacuum Flask
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µl Denville Scientific Inc. P1125 Pipette Tip
Laboratory tape Fisher Scientific 159015R
Puralube Henry Schein Animal Health 008897 Opthalmic Ointment
Gemini Cautery Kit Harvard Apparatus 726067 Cautery Pen
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length Roboz Surgical RS-5135  Forceps
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm Roboz Surgical RS-5912 Sharp Scissors
Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt Roboz Surgical RS-5980 Blunt Scissors
Wipes Fisher Scientific 06-666-A  Harness
PhysioSuite System Kent Scientific PhysioSuite Vitals Monitor
1 ml Syringe, Tuberculin Slip Tip BD 309659 Syringe
Cyano acrylate Staples LOC1647358 Cover Slip Adhesive
Petroleum Jelly Fisher Scientific 19-086291 Water Barrier
Adapter Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mm Harvard Apparatus 734118 Catheter Connector
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter Kent Scientific Pulse Oximeter
Isoethesia (isoflurane) Henry Schein Animal Health 50033 250 ml
Oxygen TechAir OX TM
1x PBS Life Technologies 10010-023
PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In Grainger 3CGJ7 Vacuum Valve
Small Animal Ventilator Harvard Apparatus 683 Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent
OptiMEM Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 31985062 
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice Jackson Laboratory 026051 
Multiphoton Microscope Olympus Fluoview FV1000 Alternative to custom built scope
Environmental Enclosure Precision Plastics Chamber for FV1000 Alternative to custom built enclosure
Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190136
Laser Power Meter Coherent FieldMaxIITOP
Laser Power Meter Head Coherent PM10
pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector Addgene 40259
G418 Sulfate Selective Antibiotic ThermoFisher Scientific 10131027
MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter  Beckman Coulter XDP
Trypsin EDTA 1x Corning 25-052-Cl
40 µm Mesh Falcon 352235
96 Well Plate Costar 3599
60 mm Culture Dish Corning 430196
10 cm Culture Dish Corning 353003
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4503
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Corning 21-031-CV
C57BL/6J Mouse Jackson Laboratory 000664 
Kim Wipes Fisher Scientific 06-666-A 

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Cancer Research Ausgabe 116 Intra Bildgebung Vakuumfenster Multiphotonenmikroskopie Lunge Zeitraffer Biologie Krebs
Langfristige High-Resolution Intravitalmikroskopie in der Lunge mit einem Vakuum-Stabilisierte Imaging-Fenster
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Rodriguez-Tirado, C., Kitamura, T., Kato, Y., Pollard, J. W., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. J. Vis. Exp. (116), e54603, doi:10.3791/54603 (2016).

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