Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Bir Vakum Stabilize Görüntüleme Penceresi ile Akciğer uzun vadeli Yüksek Çözünürlüklü Intravital Mikroskopi

Published: October 6, 2016 doi: 10.3791/54603
Automatic Translation
1, 5, 1,2, 1,2,5, 3,4, 3,4
1Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Obstetrics/Gynecology and Woman’s Health, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Anatomy & Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 4Gruss-Lipper Biophotonics Center Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 5Medical Research Council Centre for Reproductive Health, Queen’s Medical Research Institute, University of Edinburgh

Abstract

Akciğer, karaciğer ve kemik gibi ikincil sitelere Metastaz yaklaşık 90% 1 mortalite oranı travmatik bir olaydır. Bu sitelerin, akciğer nedeniyle vücudun hassas doğası ve uygun fizyolojisi sürdürülmesinde hayati rol içindeki kapalı konumuna intravital optik görüntüleme kullanarak değerlendirmek en zor olandır. Klinik yöntemler (pozitron emisyon tomografisi (PET), manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve bilgisayarlı tomografi (BT)) bu doku noninvaziv görüntülerini sağlayabilen olsa da, tek bir piksel ile en erken ekim olayları görselleştirmek için gerekli çözünürlük, eksikliği yaklaşık bin hücrelerinden oluşan. Sadece bir tümör hücresinin geldikten sonra olaylar hayatta kalma ve daha sonraki büyüme için deterministik olan metastatik akciğer tohumlama postülanın Güncel modelleri. Bu tek hücreli çözünürlükte 2 ile gerçek zamanlı intravital görüntüleme araçları tohumlama cel fenotipleri tanımlamak için gerekli olduğu anlamına gelirls bu modelleri test ve. Akciğer yüksek çözünürlüklü optik görüntüleme çeşitli eks vivo preparatlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir birlikte, bu deneyler, tipik haliyle tek bir zaman noktası deneyler ve (nedeniyle önemli ölçüde değişmiş ortam sıcaklığı, bolluğu, sitokinler, vb eşya ve olası hatalı sonuçlara duyarlı ) göğüs boşluğuna ve dolaşım sistemi 3 çıkarıldıktan kaynaklanan. Son çalışmalar bir vakum ancak görüntüleme penceresi 2,4,5 stabilize kullanarak mümkün sağlam akciğerin o zaman atlamalı intravital optik görüntüleme olduğunu göstermiştir, tipik görüntüleme süreleri yaklaşık 6 saat ile sınırlı kalmıştır. Burada 12 saatlik bir süre boyunca böyle bir pencere kullanılarak akciğer uzun süreli intravital zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için bir protokol açıklar. Bu yöntem kullanılarak elde edilen zaman atlama görüntü sıralarını akciğer görselleştirme ve hücre-hücre etkileşimleri kantitatif membran dinamikleri ve vasküler perfüzyon sağlar. Biz daha dAkciğer mikrovasküler emsalsiz net bir görünüm verir bir görüntü işleme tekniği Escribe.

Introduction

Yüksek çözünürlüklü intravital optik görüntüleme tek hücreli ve alt-hücresel parametreler ölçülmüş ve sayısal olarak izin birçok biyolojik süreçleri anlamak için çok önemli olduğu kanıtlanmıştır. Kanser araştırmalarında, tümör stromal hücrelerin intravital görüntüleme hayvanda sadece mevcut bir çok mikro-çevresel etkileşimleri 6-11 keşfine yol açmıştır.

In vivo tek bir hücre çözünürlüğü, optik görüntüleme kullanılarak göğüs kanserinde intravasation ve tümör hücrelerinin yayılması ile bağlantılı mikroçevrelerde keşiflerine da prognoz ve göğüs kanseri hastalarında 12-16 tedaviye yanıt için yeni işaretleri yol açmıştır. bozulmamış iç hayati organlara içinde derin görüntülemek için mevcut en iyi görüntüleme teknolojileri tüm organ mükemmel manzarasına sahiptir ve klinik belirti bile önce patolojileri ortaya çıkarabilir klinik yöntemler (MRI, PET CT) 'dir. Bunlar edemiyoruz, however nedeniyle tek bir hücre çözünürlükte onların eksikliği tümör ilerlemesini sürüş metastaz erken aşamaları ve hücresel mekanizmaları ortaya çıkarmak için. Zamanla akciğer metastazı bu modaliteleri görünür, onlar iyi kurulmuş ve artıyor. Onlar çok daha erken, daha önce geliş ve hayatta kalma erken adımları görüntüleme, 19 beklenenden daha gelmesi yaygın tümör akciğere ulaşması ya 17 hayatta olmayan veya başlangıçta atıl 18 kalır hücreleri ve gözlem% 90 için çok önemli hale gelmesi tahmini göz önüne alındığında uzak bölgelerde metastatik tohumlama ve tümör büyümesinin nüks süreci anlamak.

Akciğerde bu gözlemleri Sahne ancak son derece zor olduğu kanıtlanmıştır; görüntüleme çalışmalarının büyük çoğunluğu yalnızca tek zaman noktalarında akciğer içine bir görünüm vermek ex vivo veya eksplant hazırlıkları 20-23 kullanmışlardır. Bu hazırlıklar yararlı bilgiler sağlamakla birlikteım, onlar mikroçevresinin çeşitli bileşenleri arasında meydana gelen etkileşimlere, sebep-sonuç ilişkileri ve dinamikleri tam bir anlayış vermeyin. Uygun bir dolaşım sistemi (ve homeostasis eşlik eden dengesizlik) ve vücudun bağışıklık sisteminin geri kalanından kesilmesi eksikliği arzulu bu hazırlıkların in vivo sağlam dokuda oluşturmak sonuçlara doğrulamak için yapar.

Birçok grup Wearn ve Alman plevra tabakası 24 açığa cerrahi olarak ilk ve Terry implante edilebilir görüntüleme penceresi 25 kullanan ilk olmak sağlam akciğer 2,4,5,24-33 intravital görüntüleme gerçekleştirdik.

Akciğerde Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ölçüde akciğer sürekli hareket tarafından engellenmektedir ve çeşitli teknikler bu sınırlamayı aşmak için geliştirilmiştir. Wagner ve Filley 27 köpek akciğer doğal hareket okuduve Wagner doku 28 hareketsiz onun pencere cerrahi hazırlık vakum kullanılan iken nispeten sabit bölge üzerindeki implante pencereyi bulmak için cerrahi protokol tasarlanmış. Bronş sıkıştırma, sıralı apne ve kapı görüntüleme, örneklemeyi edinimi, akciğer lobu ve vakum 34 yapışması: O zamandan beri, çeşitli teknikler görüntüsüne dahil akciğer faydalanılmıştır. Bunların her biri kendi avantajları ve dezavantajları vardır ve hiç kimse teknik başka 34'e kadar üstün ortaya çıkmıştır. Örneğin, bronş sıkma ve ardışık apne akciğer gazların normal alışverişini değiştirebilir ve atelektazi neden olabilir. Geçitli görüntüleme ve oversampled edinimi bu dezavantajları muzdarip ama yüksek hızda veya özel görüntüleme cihazları yaygın olarak erişilebilir değil gerekmez. Sonunda akciğer hem yapıştırma ve vakum tekniği yukarıda belirtilen sakıncaları hem önlemek, ancak bakım tak değilse kesme kuvveti kaynaklı yaralanma görülebiliren. Son yıllarda, vakum penceresi minyatürize edilmiş ve konfokal ve multiphoton mikroskopi 4,5,33 ve mükemmel yüksek çözünürlüklü görüntü kullanılarak farelerde kullanılmak üzere adapte elde edilmiştir 2. Tablo 1, bu zengin geçmişini özetleyen ve yeni tarif o kağıtları özeti intravital akciğer görüntüleme pencereleri kullanımında gelişmeler.

Bu protokol mümkün olan en yüksek hücre içi çözünürlük ile canlı, sağlam akciğer görüntü metastaz genişletilmiş time-lapse multiphoton intravital mikroskopi kullanımını tarif etmektedir. Görüntüler yüksek sayısal açıklık objektif lens ve çoklu photomultiplier tüp (PMT) dedektörleri ile donatılmış bir multiphoton mikroskop kullanarak en fazla 12 saat boyunca elde edilir. Transgenik fare modelleri flüoresan yüksek molekül ağırlıklı dekstran ve floresan protein transfekte edilmiş tümör hücreleri (damar ve tümör hücreleri respectivel etiket ile floresan etiket yerel makrofajlara kullanılırY). floresan etiketli hücrelerin bu seçim tümör hücre endotelyal hücre-makrofaj etkileşimleri ve dinamikleri görselleştirme sağlar iken, bu protokol floresan veya floresan olmayan fare herhangi suşu için çalışacaktır. Kazanılmasından sonra, artık sürüklenme hareketi (varsa) etiketsiz dolaşan kan hücrelerinin neden yanıp sönen ortadan kaldırmak için 35,36 ve özel makrolar zaman ortalama damar kanalı eklentisi Fiji kullanılarak elimine edilir.

Bu protokol, görüntüleme metastaz odaklanırken, teknikler akciğer yüksek çözünürlüklü tek hücreli bir görüntüleme ile gözlemlenebilir diğer biyolojik süreçlerde uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokol açıklanan tüm işlemler Tıp Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Albert Einstein College of tarafından önceden onay da dahil olmak üzere omurgalı hayvanların kullanımı için kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapılmıştır.

1. Yaratma floresan etiketli Fare Modeli ve Tümör Hücreleri

  1. PBS, 100 ml BSA 0.1 g karıştırılarak% 0.1 (a / h) inek serumu albümini / fosfat tamponlu tuzlu su (BSA / PBS) tamponu 100 ml hazırlayın.
  2. dengeli transfeksiyon floresan işaretli tümör hücrelerinin hazırlanması.
    NOT: Burada E0771-LG hücreleri damardan ebeveyn E0771 hücreleri 38 ile enjekte C57BL / 6 fare akciğer geliştirilen metastatik tümörler izole edildi E0771 fare meme adenokarsinoma hücreleri 37 derece metastatik türevi kullanın.
    1. Transfeksiyondan 24 saat önce, levha 1 x 10 Antibiyotik, 2 ml bir 60 mm doku kültürü tabağına 5 EO771-LG hücreleritlc bilgilerini% 10 FBS (fetal inek serumu) DMEM (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı) ve 37 ° C 'de inkübe etmek ve% 5 CO2.
    2. Transfeksiyon zamanda, düşük serum ortamında 190 ul ilave edilmeden önce 30 dakika boyunca transfeksiyon reaktifi 10 ul floresan protein vektörünün 2 ug inkübe edin.
    3. Yıkama EO771-LG Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su (D-PBS) ile hücreler bir kez yavaşça transfeksiyon karışımı ekleyin.
    4. 6 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübe edin.
    5. 2 gün bitmiş DMEM, 2 ml (% 10 FBS, 1 mM piruvat, 100 U / ml penisilin / ml streptomisin, 100 ug) transfekte hücreler ve kültür yıkanır.
    6. Steril PBS ve 2 ml hücreleri yıkayın% 0.25 tripsin-EDTA, 500 ul ve 37 ° C'de 2 dakika boyunca inkübe edin.
    7. hücre süspansiyonu toplayın ve tam DMEM en az 1 hacmi ile karıştırın ve 280 x g aşağı doğru döndürün.
    8. tam DMEM 1 ml hücrelerin tekrar ve içine hücre kültürü genişletmek10 cm doku kültürü çanak.
    9. her üç günde bir ortam değiştirme bir hafta bitmiş DMEM ve kültür 8 ml G418 seçici antibiyotiği 700 ug / ml ekleyerek transfekte edilmiş hücrelerin seçimi başlatın.
  3. Floresans ile aktive edilen hücre sıralama (FACS) 39,40 ile G418 içinde seçimi altında olmuştur transfekte edilmiş hücrelerin flüoresan nüfus zenginleştirmektedir.
    1. 5 ml PBS ile hücreleri yıkanır ve 1.5 ml% 0.25 tripsin ekleyin.
    2. 37 ° C'de 2 dakika süreyle inkübe edin ve tam DMEM en az bir hacim ile karıştırın.
    3. hücre süspansiyonu toplayın ve 280 xg'de aşağı spin ve steril% 0.1 1 mL (w / v) BSA / PBS tampon hücreleri yeniden askıya.
    4. 40 mikron örgü ile hücre süspansiyonu Filtre ve sıralama için% 0.1 BSA / PBS tamponu ile 1 ml ses seviyesini ayarlamak.
    5. FACS sıralayıcı 41 kullanılarak floresan spektrum göre% 10 parlak nüfus FACS-sıralayın.
    6. bir hafta u Kültür sıralanmış hücrelernder seçimi (komple DMEM 700 ug / ml G418).
    7. sitometrisi kez daha adımları 1.3.6 1.3.1 tekrarlayarak akışı ile floresan işaretli hücrelerin yeniden seçin.
    8. (Adım 1.3.1-1.3.4) tarif edildiği gibi bir seçim, trypsinize, filtre ve bir ikinci tur sonra% 0.1 BSA / PBS içinde hücrelerin yeniden askıya. FACS ayırıcıyla 96 gözlü plakalara ayırma tek bir hücre için 2 x 10 6 hücre / ml konsantrasyon ayarlayın.
    9. toplanması için tam DMEM 100 ul 3-5 96 oyuklu plakalar hazırlamak. , Sıraladıktan sonra hayatta kalma geliştirmek EO771-LG hücreleri 42 yetiştirilmiştir yemekler süzülmüş kültür ortamının 100 ul ekleyin.
    10. 96 gözlü plakalara hücreleri sıraladıktan sonra, 2 gün boyunca kültür hücreleri dönüş (37 ° C,% 5 CO2).
    11. 5x büyütme tersine bir mikroskop altında incelenmesi ile olarak tek klonlar ile kuyu tanımlar.
    12. Trypsinize ve yaşayabilir klonlar genişletmek ve yedekleme için hücreleri dondurma.
      1. gr ile kuyu yıkayınsteril PBS 100 ul klonlar sayesinde. h tripsin / ağ% 0.25 50 ul ilave edin ve 37 ° C'de 2 dakika kuluçkalayın. bitmiş DMEM, 50 ul ilave edin ve 5 dakika boyunca 280 x g'de döndürülür ve steril bir V-tabanlı ya da yuvarlak tabanlı 96 oyuklu plakaya transfer.
      2. Süspanse 700 ug / ml G418 tam DMEM 100 ul hücre 12 oyuklu plakalarda her klon plaka. akana kadar G418 ve kültürü ile tam DMEM 400 ul ekleyin.
      3. , 500 ul PBS ile kuyu yıkayın% 0.25 tripsin, 100 ul ve 37 ° C'de 2 dakika kuluçkalayın. tam DMEM 100 ul ekleyin ve 280 x g'de 5 dakika aşağı doğru döndürün. birbirine karışana kadar 6 kuyulu plakalarda, G418 ve plaka hücrelerle tam DMEM 100 ul hücrelerin tekrar.
      4. birleşmiş kez trypsinize hücreler, aşağı spin ve FBS% 10 DMSO içinde tekrar süspansiyon hücre stokları dondurmak için.
      5. metastatik potansiyelin değerlendirilmesi için 100 mm doku kültürü çanakları içinde onları kaplama ile kültür içinde hücre süspansiyonları 1/10 tutun.
  4. Seçilen klonların metastatik potansiyelini test.
    1. Tripsinize ve 2,5 ml x 10 6 hücre / lik bir konsantrasyon tuz içinde hücrelerin yeniden askıya ve kuyruk damarı yoluyla damardan C57BL / 6 farelerine 200 ul enjekte edilir.
    2. Daha önce 23 açıklandığı gibi 2 hafta sonra, akciğer dokusu toplamak ve yüzey sayısı veya stereolojik yöntemle 43 ile tümör yükünü ölçmek. Intravital görüntüleme için yüksek metastaz potansiyeline sahip klonlar seçin.
  5. MacBlue muhabiri fareler 44 (mavi floresan proteini (OBP) ifadesini (CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16) sürüş miyeloid spesifik promotör) kaldırın.
    NOT: Genellikle, 8 ve 12 hafta arasında fareler kullanılır, ancak erken 7 olarak ve olabildiğince geç 20 kadar hafta da çalışmak için test edilmiştir fareler.

2. multiphoton Mikroskop Seti yukarı ve Görüntüleme Hazırlık

NOT: Bu protokol, her m gerçekleştirilebilir birlikteultiphoton mikroskop, bu protokolde gösterilen veri elde etmek için kullanılan sistem detaylı 45 daha önce tarif edilmiştir.

  1. iki foton lazerler ve en az bir saat öncesinde istenen görüntüleme süresi dedektörler de dahil olmak üzere tüm mikroskop ve lazer bileşenleri açın.
  2. okunur ameliyattan hemen önce, hemen mikroskop önce ışın yolu optik güç ölçer başkanı yerleştirerek mikroskop ışık girdi gücünü ölçmek ve 880 nm maksimum ışık yoğunluğu kadar lazer uç boşluğu ayna düğmeleri ayarlamak optik güç metre.

3. Vakum Sistemi kurma

  1. Siyanoakrilat ile görüntüleme penceresi (Company Şekil 1) içine lamel Tutkal. Tamamen kuru yapıştırıcı için en az 4 saat bırakın.
    NOT: Bu adım, vaktinden önce gerçekleştirilmelidir.
  2. küçük açıklıktan ilk satırında 100 ul pipet kesin ve ince v kesilmemiş ucunuacuum hortumu.
  3. Şekil 1 ve Ek Şekil 2'ye göre yeni bir elektrik bağlantı sistemi.
  4. üzerinde vakum ve bloke açık uçlu, <3 inHg için vakum regülatörü ayarlayın.
    Not: vakum seviyesinde son ayarı, in vivo olarak damar gözlemlenerek yapılacaktır.
  5. görüntüleme plakası ile uzak wicked olmaktan objektif lens daldırma ortamı önlemek için görüntüleme plakanın alt petrol gres ince bir tabaka sürün.
  6. Mikroskop sahnede görüntüleme plaka koyun.
    NOT: Özel görüntüleme plakası (Company Şekil 3) 1/8 bir sayfadır "kalın alüminyum hem de sahne eklemek alana sığacak ve görüntüleme penceresini tutmak için merkezi bir delik ile karşı işlenmiş.
  7. aşağı lamel ile görüntüleme plakasına vakum penceresini yerleştirin.
  8. Sterilize tüm yüzeyleri ve aletleri görüntüleme sahne plakası dahil ve görüntüleme kazanmak% 70 etanol ile Dow.
  9. Vakum penceresine pipet kesilen ucunu ve görüntüleme plakasına hortum aşağı bantlayın.
  10. görüntüleme penceresine objektif yakın getirin ve objektif ve lamel arasındaki su büyük damla yerleştirin.
  11. Vakum penceresinin merkez açılmasını engelliyor ve objektif ve lamel arasındaki su damlası aspire almaz doğrulayarak lamel hiçbir sızıntı olmadığından emin olun.
    NOT: penceresinin üzerine yerleştirilen bir eski stil bilgisayar faresi top merkezi açılmasını engelliyor için yararlıdır.

4. Cerrahi

  1. Steril cerrahi zemin hazırlayın.
    1. kolayca ulaşılabilecek tüm enstrümanları yerleştirin. Cerrahi alan ve% 70 etanol ile cerrahi aletler dahil tüm yüzeyleri ve aletleri sterilize edin.
  2. Bir çift düğüm ile burç üzerinde, kateter ¼ inç 2-0 sütür 3 inç uzunluğunda kravat.
  3. Kuyruk ven kateter fol hazırlayınHarney ark. 46 tarafından yayınlanan protokolü lowing.
  4. ~ 5 dakika sonra kuyruk damarından kan akımını arttırmak için kateter yardımı için bir enfraruj (IR) bir ısı lambası kullanılarak kafesine hayvan ısıtın. Bir ısı lambası veya bir ısınma pad kullanarak cerrahi prosedür boyunca fizyolojik sıcaklıklarda ısıtılan hayvan tutmak için tavsiye edilir.
  5. % 5 izofluran ile hayvan anestezisi ve bir ayak tutam yanıt olduğunu doğrulayın.
  6. hayvanın gözleri oftalmik merhem sürün.
  7. hayvanın sol kanattan gelen saç kaldırmak için 10-30 saniye tüy dökücü losyonu uygulayın; arka ¼ için göğüs orta hat ve sadece göğüs kafesi altında aksilladan.
  8. herhangi bir aşırı losyon temizleyin ve% 70 alkol ile maruz kalan deri sterilize edin.
  9. Kuyruk veni kateteri için PBS ile doldurulmuş steril bir şırınga takın ve Harney et at tarafından yayınlanmıştır protokol izlenerek yerine yerleştirin ve bant. 46. bantla sıkıca iğne kendisine yapıştırılır ve kuyruk ve bant arasındaki boşlukta serbest değildir emin olun.
  10. Das et al. 47 veya DuPage ve arkadaşları tarafından yayınlanan protokolünü takip etmek için fare entübe. 48
  11. ventilatör açın ve min başına 135 nefes ve izofluran-oksijen karışımının 200 ul tedarik ayarlayın.
  12. ventilatöre trakeal kateter bağlayın.
  13. Cerrahi alana fareyi hareket ettirin. Kateter çıkarmak için değil aşırı özen gösterin.
  14. Ön dişlerin altında fare burun etrafında 2-0 dikiş kravat.
  15. burnu kateteri bantlayın.
  16. Cerrahi alanın dışında tutmak için kateter sol ön ayakları bantlayın.
  17. % 2.5 bakım seviyesine izofluran anestezisi indirin ve bir ayak tutam yanıt olduğunu doğrulayın.
  18. Keskin bir makas kullanarak, sol göğüs duvarı üzerinde derinin 1 cm 2 çıkarın.
  19. Kaldırma tO yağ yastığı meme ve koter kalemle açıkta kan damarları dağlamak.
  20. keskin bir makas ile keserek yağ yastığı rezeke.
  21. keskin bir makas ile keserek göğüs kafesi kas tabakası aşağı kaldırın. ön ayakları dibinde aksiller ven çalışan kesmemeye özen gösterin.
  22. Yakala ve 6. kaburga kaldırmak için forseps kullanabilir. sığ bir açıda keskin bir makas kullanarak (~ 5 °) deride açılma kenarına yakın kaburga kesti. maruz akciğer dokusunun dokunmamaya aşırı özen gösterin.
  23. Arka arkaya dört kaburga kaldırarak tüm akciğer lobun maruz göğüs duvarından açıklığı genişletmek.
    Not: kalbi önlemek için sternum en az 5 mm uzakta açılış tutun.
  24. Dikkatle kuyruk ve trakeal kateter tutarak fareyi kaldırın ve mikroskop görüntüleme aşamasına fareyi hareket ettirin.
  25. Vakum off ile PBS ile vakum pencerenin odasını doldurun.
  26. fareyi ters çevirin ve maruz pozisyonVakum görüntüleme penceresi üzerine akciğer.
  27. Yavaş yavaş küresel vanası kullanılarak cıva yaklaşık 3-5 inç vakum açın.
  28. Yan Şekil 2'de gösterilen aşamada plaka fare ve bandın göğüs iki kez ikiye katlanmış dokuma kağıdından yapılmış bir yasaklama demetini yerleştirin.
  29. Hayvanın üst uyluk pulse oksimetre uyluk sensörünü Klip ve yazılımını başlatın.
  30. Sahnede çevre odasına yerleştirin ve fizyolojik bir sıcaklıkta fare tutmak için ısı açmak.
  31. anestezi korumak ve kan akışını korumak için 1-1.5% izofluran düzeyini azaltır.

5. Intravital Görüntüleme

  1. lamel yakın 25 x 0.95 Sayısal açıklık (NA) objektif lens getirmek ve aralarındaki su büyük damla ekleyin.
  2. Epifloresans modunu kullanarak, FITC kanalı görüntüleyebilir ve odak noktası haline akciğer dokusunun getirmek.
  3. ameliyat öncesi yapılan değilse, benKuyruk veni kateteri vasıtasıyla nject tümör hücreleri.
    1. Kuyruk ven kateter PBS şırınga ayırın.
    2. Tümör hücresi süspansiyonu (PBS en fazla 2 x 10 7 hücre / ml) 100 ul steril bir şırınga yerleştirin.
      NOT: Bu adım farklı zaman noktalarında akciğer kanser hücresi varış incelemek için önceden yapılabilir.
    3. Kuyruk ven kateter üzerine tümör hücreleri ile şırınga bağlayın.
    4. Yavaş yavaş kuyruk damar içine tümör hücrelerini enjekte edilir.
    5. Kuyruk ven kateter tümör hücreleri şırınga ayırın.
    6. Kuyruk ven kateteri PBS şırınga bağlayın.
      NOT: enjeksiyonundan sonra oküler üzerinden dekstran sinyalden tümör hücrelerini ayırt etmek zorlaşır olarak dekstran enjekte etmeden önce tümör hücrelerinin tüm yerleri belirleyin.
  4. görüntü tümör hücrelerinin bulun
    1. Bireysel tümör hücrelerini görüntülenmesi için, tüm tümör hücrelerini bulmak ve inci ile konumlarını kayıtYazılımın e çoklu paneli.
      1. mikroskop oküler tümör hücrelerini gözlemleyerek görüntünün bakış tüm alanları bulun.
      2. Yazılımda, Multi-Nokta butonuna tıklayarak çoklu paneline geçiş ve Add pozisyonu butonuna tıklayarak hücrenin konumunu saklamak.
    2. mozaik görüntüleme için, mozaik kaynağını bulmak ve görüntüleme koordinatlarını ayarlamak
      1. yapının sol üst köşesinde bir pozisyon bulmak Çekilecek.
      2. sahne denetleyicisi "Sıfır" düğmesine basarak sahneye Sıfır x, y ve z koordinatlarını.
      3. "Load" butonuna tıklayıp listeyi seçerek mozaik koordinatların uygun listesini yükleyin.
        NOT: görünümünün 500 mikron alanının% 20 örtüşme ile 2 x 2 mozaik için bir örnek liste olur: Poz.1 = (0,0), Pos. 2 = (400,0), Poz. 3 = (0400), Poz. 4 = (400.400).
  5. şırıngayı w kaldırve kuyruk ven kateteri PBS i dekstran içeren şırınga ile değiştirin.
  6. Yavaş yavaş çizgiyi temizlemek için steril PBS 50 ul enjekte ardından 20 mg kuyruk ven kateter yoluyla fare içine PBS içinde çözünmüş / ml 155 kDa rodamin-dekstran 100 ul kadar enjekte edilir. hattına herhangi bir kabarcıkları tanıtmak etmeyin. fareye uygulanan toplam hacmi 4 ml / kg / saat aşmayacak şekilde gerektiğinde dekstran kanseri hücre enjeksiyonundan sonra en az bir saat enjekte edilir.
  7. görüntüleme parametrelerini ayarlayın.
    1. multiphoton moduna mikroskop geçin.
    2. Zamanlama Sinyaller düğmesini tıklayarak ve Zoom Faktörü alanını güncelleyerek 2X faktöre zoom ayarlayın.
    3. Lazer gücü ayarlamak için ~% 10 (~ numune 10-15 mW) 10 Tsunami Güç kaydırıcısını ayarlayarak sonra Dedektörler ve Lazer düğmesini tıklayarak ve.
  8. Resim Her bir yer tümör hücrelerinin varlığını tespit etmek ve vascu akışını ve bütünlüğünü görselleştirmeklature.
    NOT: Gemiler tamamen akan eritrositler ile perfüze görünmelidir ve floresan dekstran ekstravasküler alanlara sızıntı olmadan gemilerin içinde bulunan edilmelidir. Yaklaşık 10-20 tümör hücreleri vakum penceresinin açık diyafram içinde olması beklenir.
  9. Her yerin başlangıç ​​derinliğini ayarlayın yansıması.
    1. Her konum için, görüntü tümör hücresinin üst dilim sahne denetleyicisi odak düğmesini çevirerek z konumunu ayarlayın.
    2. görüş alanının merkezinde hücreyi yerleştirin.
    3. , Çoklu butonuna tıklayın vurgulayın ve çoklu listesinde hücrenin depolanan konumunu değiştirmek için Sil düğmesine, ardından Ekle tıklayın görüş alanının pozisyona tıklayınız.
    4. Görsel her pozisyonda tümör hücresinin göreceli parlaklığı gözlemlemek.
  10. Çoklu paneli Kaydet düğmesine tıklayarak hücrelerin her yeni konumları kaydetBir dosya adı belirtmek d.
  11. Bireysel tümör hücrelerinin görüntüleme için, yaklaşık eşdeğer parlaklık üç hücreleri almak ve Sil düğmesine tıklayarak ardından listede bulundukları yere tıklayarak ve çoklu listeden tüm diğer konumları silin.
  12. Dedektörler ve Lazer butonuna tıklayın ve sinyaller doygunluk altında olduğu yeşil ve kırmızı kanalları 45 yani PMT kazancı sürgü ayarlayın.
  13. Makrofajlar camgöbeği görünmesi böylece mavi kanal 45 için kaydırma çubuğunu ayarlayın.
    NOT: Herhangi bir ikinci harmonik sinyali sadece mavi kanalda görünecektir ve kanal çıkarma prosedürünü takip ederek mavi makrofajlar ayrılabilir önce 45 nitelendirdi.
  14. 0 mikron z-yığın başlangıç ​​derinliği ve sırasıyla yere z sahne hareketli ve Başlat tıklayıp Bitiş düğmeleri ile 24 mikron son derinliğini ayarlayın.
    NOT: Bu derinliği içinde hücreler en iyi sinyale ile görüntülendi olacakGürültü ve çözünürlük.
  15. 3 mikron z adım boyutunu ayarlayın.
  16. Parametreleri aşağıdaki görüntüleme parametreleri daha önce 45,49 tarif ayarlayın.
    1. Bireysel tümör hücrelerinin görüntüleme için, Zamanlama Sinyalleri düğmesini tıklatın ve sonra (1.5x yakınlaştırma faktörüne eşdeğeri) zum faktörü alanında, çerçeve ortalama alanına 3 giriniz ve Time-Lapse düğmesine tıklayın ve 10 girin içine 4 V girmek Time-lapse alanına.
      NOT: Bu ayarlar 1 çerçeve her 3 saniyede kazanacaklardır.
    2. mozaik görüntüleme için, Zamanlama Sinyalleri düğmesini tıklatın ve (4X yakınlaştırma faktörüne eşdeğer) 1,5 V yakınlaştırma faktörünü girin, çerçeve ortalamalar sayısında 3 girin ve Time-Lapse düğmesine tıklayın ve zaman-içine 10 girin zaman gecikmesi alanını lapse.
      NOT: Bu ayarlar 1 çerçeve her 3 saniyede kazanacaklardır.
  17. kendi düğmeleri tıklayarak çoklu, z-yığını ve t-lapse görüntüleme modları etkinleştirin.
  18. görüntüler elde etmek için kayıt düğmesine basın.
    DEĞİLE: Akciğer dokusu çok hassas ve foto-karşı duyarlıdır. diğer alanlarda zaman atlamalı görüntüleme kan akımı görüntülü alanda durduktan sonra, lazer büyük olasılıkla ise çok yüksek ve sonraki görüntüleme daha düşük güçte yapılmalıdır.
  19. Her 30-45 dk, yavaş yavaş hayvanın hidrasyon korumak için PBS veya serum fizyolojik 50 ul enjekte edilir.

6. Ötenazi

  1. % 5 izofluran artırın.
  2. nefes ve sahne hayvan kaldırmak çözüldükten sonra 30 saniye kadar% 5 izofluran altında hayvan tutun.
  3. tam ötenazi sağlamak için servikal dislokasyon gerçekleştirin.

7. Görüntü Analizi

  1. Tek hücre görüntüleme deneyleri için:
    1. Fiji içine görüntüleri yüklemek ve bir hyperstack olarak biçimlendirmek.
    2. Hyperstack her z-dilim için, zaman atlamalı film oynatmaya ve artık xy hareketi arayın. Artık xy hareket bulunursa, için yığına StackReg 36 denilen eklentiyi uygulamakhareketi ortadan kaldırır.
  2. mozaik görüntüleme deneyleri için:
  3. Fiji içine görüntüleri yüklemek ve dizin dosya baz adı, mozaik x ve y alanların sayısı ve sayısı gibi görüntüleri hakkında Mozaik Dikiş makro (Company kod dosyası Mozaik Dikiş) ve Bilgi girmeyi açarak onları bir araya dikiş dilimleri ve zaman noktalarının.
    NOT: Java dizinleri nasıl yorumladığını nedeniyle, klasör adları alt ayırıcı olarak iki ters eğik çizgi olması gerekir. Yerleşik eklentisi İkili Dikiş sınırlamalardan dolayı, taban dosya adları herhangi bir tire içermemelidir.
  4. damarsal sınırları net bir görünüm elde etmek için, tek bir görüntü halinde bir araya kan kanalı için zaman noktalarında tüm ortalama ve daha sonra diğer kanalların filmin her kare için arka plan olarak bu görseli çoğaltırlar.
    Not: Bu sadece Kan ortalama gerçekleştirin makro çalıştırarak yapılır (İlave kod dosyası Kan ortalama gerçekleştirin).

    5. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu yöntem ile elde edilebilir sonuçlar tipini göstermek için, ameliyat öncesi zaman noktaları değişen MacBlue fareler 44 kuyruk venine floresan protein yonca ile etiketlenmiş E0771-LG, tümör hücreleri enjekte ettik. Ameliyattan sonra, 155 kD rodamin etiketli dekstran damarlar ve zaman atlamalı görüntüleme yapıldı işaretlemek için IV enjekte edildi.

Fareler 24 saat sonrası enjeksiyon görüntüleme yaparken, tek hücre makrofajlar ve monositler ile etkileşim, damarsal içinde görebilir. Bunun bir örneği, Şekil 2A (Ek Film 1) 'de gösterilmiştir. bu geçici bir ikamet makrofaj (camgöbeği) ile etkileşime burada 12 mikron derin akciğer damar sisteminde açılmış yalnız tümör hücresinin (yeşil) tek bir optik bölüm 5 saat ve 20 dakika boyunca görüntülü. Damar, yüksek molekül ağırlıklı dekstran ile etiketlenir. stabilitesigörüntüleme alanının sıralı z yığın görüntüleme elde edilebilir ve bir 3 boyutlu rekonstrüksiyon (Şekil 2B, Ek Film 2) yapılabilir şekildedir.

mozaik görüntüleme için protokol açıklanan mikroskop ayarlarının kullanımı görüntüsü tek bir alanda daha büyük yapıların görüntüleme sağlar. Örneğin, Şekil 3, tek bir metastatik lezyonların edinimi gösteren, 12 gün enjeksiyondan. Akciğer yüzeyinin altında ve 25 mikron (Şekil 3A, sağ panel), bu 5 x 5 mozaik bir (Ek Film 3 Panel sol Şekil 3A) 15 205 dakika manzaralı 890 mikron alanını gösterir. Kromozomal ayırma (Şekil 3B, Ek Sonuçlar kanıtladığı gibi büyük görüş alanına rağmen, mozaik oluşturan temel çerçeveleri yüksek çözünürlüklü böyle tek bir hücrenin mitoz olarak hücre içi olayların yakalama sağlarFilm 4).

Yüksek bir molekül ağırlığına sahip damar içi enjeksiyonu floresan Ancak eritrosit ve lökosit dekstran tıkayan dolaşımdaki Etiketsiz, vasküler lümeni etiketlenmesinde dekstran etiketli sonuçlar. Akciğerin küçük kılcal, tıkanma tam dekstran sinyal yanıp sönen sonuçlanan ve damar sınırlarının tanımı kaybı (; Ek Film 5 sol Şekil 4,) 'dir. Bu protokol ile sağlanan yüksek uzaysal kararlılık ve böylece geçici Oklüzyonları geri, bulanıklık olmadan, kan kanalının zaman ortalamasını verir. Diğer sinyal kanalları daha sonra damar sınırları (; Ek Film 6 Şekil 4, sağda) net bir görüş sağlamak için damarsal üstüne eklenebilir.

Şekil 1
Şekil 1:. Vakum Sistemi Düzen Evi vakum kullanılan ve bir vakum regülatörü ile tanımlanan seviyeye ayarlanır. Bir yakalama şişesi vücut sıvıları ile regülatör ve vakum sisteminin kirlenmesini önler. Ince esnek tüp görüntüleme penceresinin vakum portuna uygun bir pipet kesim vakum aktarıyor. Görüntüleme penceresi mikroskop objektif lens ile ilgili olarak konumsal istikrarın sağlanması görüntüleme plakasında bir gömme oluğa uygundur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: Akciğer Tek Hücre Görüntüleme (A) Yine akciğer kılcal yatakta tek bir tümör hücresinin bir zaman atlamalı film 24 saat kuyruk damarından sonra.enjeksiyon. (Kırmızı = Kan damarları, Yeşil = Tümör Hücreleri, Mavi = makrofajlar) (B) Durağan görüntü zamanla görüntüleme verileri üç boyutlu rekonstrüksiyon sağlar. Kan damarları zaman netlik için ortalama olmuştur. (Kırmızı = Kan damarları, Yeşil = Tümör Hücreleri, Mavi = makrofajlar). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: Akciğer İstikrar Birlikte Çoklu Düşük Büyütme Fields Sıralı Toplama ve Dikiş tarafından Akciğer Yüksek çözünürlük, Manzara Görüntüleme Geniş alanı sağlar (A) bakış bir 890 mikron alanı gösteren 5 x 5 mozaik. 12 gün akciğer yüzeyinin altında 15 um alındığı tümör hücrelerinin kuyruk damarından enjeksiyon sonrası akciğerde sıçrayan bir lezyondan(Sol Panel). Sağ panel, akciğer yüzeyden 25 um aynı metastatik lezyon gösterir. (B) Bireysel yüksek çözünürlüklü alanları gibi kromozomal hizalama (sarı oklar) ve hücre bölünmesi sırasında ayırma (kırmızı oklar) olarak hücre içi süreçleri ortaya koyuyor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4:. Yüksek Moleküler Ağırlıklı Dekstran Marks damarsal Lumen Etiketli floresan İntravasküler Enjeksiyon Etiketsiz eritrosit ve diğer Sirkülasyon Hücreler yanıp sönen bir etkisi obscuring sonuçlanan zamanında hareket tamamlanmamış bir etiketleme Floresan Sinyal (A) Tıkanıklığı sonuçları tıkamaktadır zamanlar hariç damar sınırları. (B) yüksekVakum penceresinin mekansal istikrar kan kanal süresi geçici tıkanıklığı doldurarak ve açıkça damar sınırlarını tanımlayan, ortalama olmasını sağlar. Diğer kanallar sonra ortalama olmadan üst üste. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yıl İlk Yazar / Son Yazar Hayvan cerrahlık Görüntüleme tipi notlar
1926 Wearn & Almanca Kediler Göğüs duvarı plevra tabakasına kısmak. Ikinci açıklık aşağı aydınlatma için plevra diyafragmadan yaptı. Parlak alan mikroskobisi. plevra duvarından ilk "pencere".
1939 havlu kumaş Kediler Kaburga in., 1 ayrı pencere implante edilir, hava vakum ile toraks kaldırıldı. Polarize aydınlatma kullanarak binoküler ve cilt mikroskop. İlk optik pencere implante. İkinci vakum penceresine doku çizmek için.
1963 de Alva & Rainer Tavşanlar ve Köpekler Bir ya da iki kaburga rezeke ve 1. Pencere yerleştirilir ve göğüs duvarına dikilir. Cilt pencere ve iyileşmek için izin hayvanın üzerine kapatıldı. görüntüleme önce, cilt penceresini göstermek için disseke edildi. Düşük mag (11X) objektif yoluyla el yüksek hızlı Stroboskopik yönetmenliği. İlk yaşam penceresi.
1965 Wagner & Filley Köpekler Sağ ön ayakları, tek kaburga kesim çıkarıldı ve pencere yerleştirilir ve dikilir. 22X amacı ile yansıma mikroskopi. vakum olmadan ilk nispeten hareket ücretsiz pencere.
Wagner Köpekler Bir Kaburga içinde, 3 rezeke edilir. Pencere implante. penceresinde Dişli flanş vidaları göğüs duvarına mühür formu. yüksek büyütme 100X immersiyon yağı amacı ile aydınlık mikroskopi. İlk pencere doku hareketini stabilize etmek için vakum kullanın.
1992 Groh & Goetz Tavşanlar Bir kaburga içinde, 1.2 rezeke. Pencere implante. penceresinde Dişli flanş vidaları göğüs duvarına mühür formu. Vakum tatbik. 25X amacı ile epifluorescent mikroskopi. Epifloresans ile bir vakum penceresinin ilk kullanımı.
1994 Fingar'ın ve Wieman sıçanlar 2 kaburga in., 1 rezeke pencere implante ve göğüs duvarı ve cilde dikilir. 40X amacı ile epifluorescent mikroskopi. sıçanlarda ilk yaşam penceresi.
2000 FunakOshi & Mitsui fareler Tüm göğüs duvarı kaldırıldı. Vakum emme halkası sağ akciğere bağlı. 20X amacı ile mikroskopisi. Farelerde vakum pencerenin ilk kullanımı.
2005 Lamm & Glenny sıçanlar Tüm göğüs duvarı içinde, 1 kaldırıldı. Pencere akciğere bağlı. 20X amacı ile Yansıma ve epifluorescent mikroskopi. Sıçanlarda vakum pencerenin ilk kullanımı.
2008 Tabuchi ve Keubler fareler 3 kaburga rezeke edilir, plastik film göğüs duvarında delik mühür açılış başvurdu. Hava intraplevral kateter yoluyla kaldırıldı. 20X amacı ile epifluorescent mikroskopi. İlk göğüs duvarına açıklığı kapatmak için plastik film kullanın.

Tablo 1: Devel tarihsel AnketiIntravital Akciğer Görüntüleme Windows opment. Birçok roman intravital akciğer görüntüleme pencereleri En son doku stabilizasyonu için vakum istihdam ve hücre içi detay ortaya çıkarmaya muktedir olması için yeterince yüksek çözünürlük elde, farelerde kullanılmak üzere minyatürize olma ile yılda geliştirildi.

Yan Şekil 1: Vakum Görüntüleme Penceresi Çizim Tasarım Bu rakam indirmek için tıklayınız.

Yan Şekil 2: Vakum Kur'un fotoğraflar bu rakamı indirmek için tıklayınız.

Yan Şekil 3: Tasarım DrawiSahne Plaka takın ng bu rakamı indirmek için tıklayınız.

Yan Şekil 1
Ek Film 1:. Şekil 2A hareketsiz Film (Sağ indirmek için tıklayın).

Yan Şekil 2
Yan Taşı 2:. Farklı görüş açıları ve zamanla ilerlemesi gösteren Şekil 2B'de gösterilen 3 boyutlu rekonstrüksiyon Film (Sağ indirmek için tıklayın).


Ek Film 3:. Akciğer yüzeyinin altında 15 mikron de Şekil 3A'da gösterilen 5x5 mozaik Film (Sağ indirmek için tıklayın).

Yan Şekil 4
Ek Film 4:. Akciğerde mitoz geçiren Şekil 3B tasvir tek bir hücrenin Film (Sağ indirmek için tıklayın).

Yan Şekil 5
Ek Film 5: Şekil 4'ün Film, tıkanıklık ve f gösteren sol panelibağlama. (Sağ indirmek için tıklayın).

Yan Şekil 6
Ek Film 6:. Şekil 4 Film, kan ortalamaya sonra damar tanımı kurtarma gösteren sağ panel (Sağ indirmek için tıklayın).

Yan kod dosyası:. Mozaik Dikiş bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Yan kod dosyası:. Kan ortalamasını gerçekleştirin bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu tür proteinler ve antikorlar gibi floresan etiketli fonksiyonel etiketleri ile kombine in vivo optik görüntüleme Yüksek çözünürlüklü metastatik kaskad anlayışımızı büyük oranda arttırmıştır. Bu, doğrudan görselleştirme ve tek hücreli ve tümör hücrelerinde alt-hücresel parametrelerin, konakçı hücreler ve bunların mikro-ölçümünü sağladı. Primer tümörün içindeki bu görüntüleme büyüme işgali ya da yayma 6,7 birinin destekleyici ayrık mikroçevrelerde keşfine, örneğin, yol açmıştır. Işgali durumunda, in vivo görüntüleme intravasation 7,50 makrofajlar ve tümör hücrelerinin ko-Göçmen akışının tercih edilen bir rol ortaya çıkarmıştır.

akciğer gibi ikincil siteler, tümör hücrelerinin tek ve küçük gruplar geldiğinde, metastaz erken aşamalarında tümör hücre davranış dinamiklerini anlamak öncesi mikrometastaz tohumlama sahne de dahil olmak üzere veKan damarı endotel ile etkileşim sadece yüksek çözünürlüklü optik görüntüleme kullanılarak gerçekleştirilecektir. Standart klinik görüntüleme yöntemleri kapiller yatakta ince yapısı veya tek hücre çözünürlükte hücre morfolojisi ve etkileşim ya görselleştirmek için gerekli çözünürlüğe sahip değilsiniz. Bu protokol sunulan görüntüleme teknikleri bu zorlu görevi başarmak.

Böyle perfüzyon dahil olmak üzere uygun akciğer fizyolojisi, bağışıklık sistemine bağlantıyı sürdürmek ve hücresel dinamikleri sadece statik bir görünüm daha sunarak ex vivo akciğer hazırlıkları üzerinde Tablo 1 teklif önemli bir avantaj listelenenler gibi Intravital görüntüleme pencereleri. Vakum özellikle teklifi üç boyutlu rekonstrüksiyon (Şekil 2B) ve görünümü mozaik görüntüleme büyük alan için yeteneği sağlayan son derece kayıtlı görüntülerin elde edilmesine izin verir doku istikrar düzeyi, (Res pencereleri stabilizeure 3A). Birlikte bu bile kromozom ayrımı ortaya koymak ve uykuda ve bölünen tümör hücrelerinin (Şekil 3B) ayırt edebilir bir alt hücresel görünüme, doku morfolojisi veren bir histolojik tip düşük büyütme görünümünden, akciğer görüşlerini sunuyoruz. Birden fazla alıcı kanalları çeşitli hücre tipleri ve bunların etkileşimlerinin eş zamanlı olarak görselleştirildi (Şekil 2A) izin verir.

protokolü için 12 saat prosedürü ve görüntüleme kez başarı oranını artıracak bazı kritik adımlar ve puan için bazı teknik beceri, uygulama ve dikkatini çekmek yapar iken beklenebilir. Akciğer dokusu iyi pencerenin (adım 4.25) üzerinde ortalanmış olduğundan emin olmak için önemlidir. Bu vakum akciğer dokusunda (adım 4.27) arasında eşit ve tamamen tatbik edilmesini sağlar. doku merkezi hatası dokusunun hareket neden olur. Yasaklama koşum (İlave Şekil 2) t kullanılıro hayvan alır, doğal nefesler sırasında interkostal kasların daralması tarafından uyarılan hareketi azaltmak. Bu fare üzerinde oturduğundan, ancak göğüs sıkıştırmak değil edilmelidir. Çok fazla sıkıştırma fare azaltılmış canlılığı akciğerlerin lob yanı sıra kalp ve tüm sonuçları üzerinde baskı koyar. dekstran enjeksiyonu (adım 5.8) sonra akciğer damar sisteminde akan gözlenmez ise, akciğer dokusunda ameliyat sırasında yanlış kullanımdan kaynaklanan hasarlı veya vakum seviyesi çok yüksek, ya. 0,5-1 inç Hg vakum düşürülmesi akış restore olup olmadığını görmek için teşebbüs edilebilir. Akış geri değilse orada akış, ancak dekstran extravascularly gözlenmesi halinde, ya da akciğer dokusunda o bölgede hasar görmüş ve görüntü görünümü farklı bir alan gerekli olacaktır. Görüntüleme bölgesinde uygun bir kan akışı düzgün fizyolojisi ölçülen sağlamak için önemlidir. Oksijen VAS ile alveoller içinden dokuya sağlanan ve olmadığındannçl iskemik hipoksi mümkün değildir. Yine, unperfused damar potansiyel değişmiş oksijen / CO 2 seviyeleri yol açabilir ve ayrıca ilgi doku ulaşmasını lökosit dolaşan önleyecektir. akan eritrositlerin Görselleştirme düzgün akciğer fonksiyonunun bir göstergesi olarak kullanılabilir. Akciğer dokusu çok hassas ve foto-hasarı da hassastır. diğer alanlarda zaman atlamalı görüntüleme kan akımı görüntülü alanda durduktan sonra, lazer büyük olasılıkla ise çok yüksek ve sonraki görüntüleme daha düşük güçte yapılmalıdır. transfekte hücreler (dört kez ortalama parlaklık vardır) GFP veya Clover ya kullanırken Biz fotohasar olmadan yeterince parlak görüntüler üretmek için numune de ~ 10-15 mW bulduk. floresan proteinleri için minimum parlaklık seviyesi mikroskop parametreleri ve hücrelerde ifade seviyeleri yüksek ölçüde bağlıdır ve ampirik olarak test edilmelidir.

Bu protokol, tümör hücrelerinin parlak sıtoplazmı etiketlenmiştirHücre gövdesi ve protein (yani çekirdek) hariç hücre içi alanlarda net bir görünüm sunuyor mikrofon floresan protein. Makrofajlar, tümör hücrelerine karşı bir fare modeli singeneik kullanılarak etiketlenmiştir. Her iki hücre tipleri etiketleme gerçek zamanlı olarak doğrudan etkileşim görselleştirme sağlar. görüntüleme uzun süre kanser hücrelerinin fizyolojik ilgili bağlamda makrofajlar ile etkileşim sıklığı, süresi ve kapsamı ölçümü sağlar.

Doğru yapıldığında, bu işlem en fazla 12 saat süreler için sağlam akciğer hareket ücretsiz, çoklu-kanal, yüksek çözünürlüklü, tek hücreli görüntüleme sağlar. Bu tür elektronik zoom 25X 0.95NA ve multiphoton yeteneklerinin gibi yüksek sayısal açıklık objektif lens kullanımı bugüne kadar görülen akciğer yüksek çözünürlüklü optik görüntüleme sağlar.

Intravasküler enjekte floresan, yüksek molekül ağırlıklı dekstran PEvasküler alan etiketleme ve bütünlüğünü doğrulama ikili bir rol rforms. 155 kDa dekstran interendothelial boşluklar sayesinde difüzyonunu önlemek için kullanılır. vasküler akış veya ekstravasküler boşluğa damar sızıntı eksikliği herhangi bir işaret nedeniyle yanlış kullanım veya aşırı vakum dokuya zarar gösterir.

Son olarak, benzersiz görüntü işleme teknikleri Bu protokolün yüksek uzaysal istikrar yararlanmak olduğu istihdam edilebilir. Onlar kılcal damarlar geçerken etiketsiz eritrosit ve diğer lökositler floresan dekstran hariç beri, bu sinyal yarattıkları o yanıp sönen kaldırmak için zamanla ortalama edilebilir. Bu damar iyi tanımlanmış bir görünüm olup başka türlü olarak sunmaktadır.

Bu tekniğin sınırlamaları (örneğin geç evre metastatik kanser potansiyel hayvan zayıflatmak hastalıkların çalışma için kullanımını zorlaştırmaktadır cerrahi, invaziv doğası ikisini deAkut orak hücreli anemi), ve uzun olsa (12 saat kadar bir tek kullanmak sınırlar ameliyat terminali olması), görüntüleme oturumu. Ayrıca, görüntüleme oturumu ve farelerin 51 düşük hepatik glikojen rezervinin uzun süreli göz önüne alındığında, glikoz takviyesi deneylerinde yanlılık potansiyel kaynakları önlemek için verilebilir.

Bu protokol, potansiyel ya da gerçek zamanlı olarak diğer yapılar veya hücre tipleri etiketlemek için dekstran ilave olarak yerine ya da enjekte edilebilir floresan etiketli antikorlar ile modifiye edilebilir. Bu analiz ve doğrudan gerçek zamanlı olarak tümör hücre-konak hücre etkileşimleri ve dinamikleri görselleştirerek tümör mikro diseksiyon için yeteneklerini genişletmek olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 - 20" Hg Vacuum McMaster Carr 4172K12  Vacuum Regulator
Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe McMaster Carr 5346K13 Vacuum Regulator Hose Adapter
Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50 ml Corning Life Sciences Glass 5360-50 Vacuum Flask
Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm dia.  Ted Pella, Inc. 260368 Cover slips
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22 g x 1 in.  Exel International 26746 Tracheal Catheter
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0 VWR 95056-992 String
Liquid Super Glue, Clear, 0.14 oz Hendel Corp. LOC1647358 Cyano-acrylate Glue
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran Sigma-Aldrich T1287-500MG 155 kD Dextran
Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length McMaster Carr 5155T12 Thin Tubing & Tubing for Luer
Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length  McMaster Carr 5181K24  Thick Tubing
Depillatory Lotion Nair -
Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/1 Tubing for tail vein catheter
30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle BD 305128 Needles for tail vein catheter
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs  Fisher Scientific 867WCNOGLUE
Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID McMaster Carr 5117k51 Connectors between tubes
One-Hole Rubber Stoppers Fisher Scientific 14-135F Stopper for Vacuum Flask
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µl Denville Scientific Inc. P1125 Pipette Tip
Laboratory tape Fisher Scientific 159015R
Puralube Henry Schein Animal Health 008897 Opthalmic Ointment
Gemini Cautery Kit Harvard Apparatus 726067 Cautery Pen
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length Roboz Surgical RS-5135  Forceps
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm Roboz Surgical RS-5912 Sharp Scissors
Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt Roboz Surgical RS-5980 Blunt Scissors
Wipes Fisher Scientific 06-666-A  Harness
PhysioSuite System Kent Scientific PhysioSuite Vitals Monitor
1 ml Syringe, Tuberculin Slip Tip BD 309659 Syringe
Cyano acrylate Staples LOC1647358 Cover Slip Adhesive
Petroleum Jelly Fisher Scientific 19-086291 Water Barrier
Adapter Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mm Harvard Apparatus 734118 Catheter Connector
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter Kent Scientific Pulse Oximeter
Isoethesia (isoflurane) Henry Schein Animal Health 50033 250 ml
Oxygen TechAir OX TM
1x PBS Life Technologies 10010-023
PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In Grainger 3CGJ7 Vacuum Valve
Small Animal Ventilator Harvard Apparatus 683 Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent
OptiMEM Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 31985062 
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice Jackson Laboratory 026051 
Multiphoton Microscope Olympus Fluoview FV1000 Alternative to custom built scope
Environmental Enclosure Precision Plastics Chamber for FV1000 Alternative to custom built enclosure
Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190136
Laser Power Meter Coherent FieldMaxIITOP
Laser Power Meter Head Coherent PM10
pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector Addgene 40259
G418 Sulfate Selective Antibiotic ThermoFisher Scientific 10131027
MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter  Beckman Coulter XDP
Trypsin EDTA 1x Corning 25-052-Cl
40 µm Mesh Falcon 352235
96 Well Plate Costar 3599
60 mm Culture Dish Corning 430196
10 cm Culture Dish Corning 353003
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4503
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Corning 21-031-CV
C57BL/6J Mouse Jackson Laboratory 000664 
Kim Wipes Fisher Scientific 06-666-A 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nat Rev Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
  2. Entenberg, D., et al. Subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. Intravital. 4 (3), 1-11 (2015).
  3. Krahl, V. E. A method of studying the living lung in the closed thorax, and some preliminary observations. Angiology. 14, 149-159 (1963).
  4. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  5. Presson, R. G. Jr, et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
  6. Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995 (2014).
  7. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
  8. Tozluoglu, M., et al. Matrix geometry determines optimal cancer cell migration strategy and modulates response to interventions. Nat Cell Biol. 15 (7), 751-762 (2013).
  9. Suetsugu, A., et al. Imaging the recruitment of cancer-associated fibroblasts by liver-metastatic colon cancer. J Cell Biochem. 112 (3), 949-953 (2011).
  10. Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
  11. Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  12. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  13. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. J Natl Cancer Inst. 106 (8), (2014).
  14. Agarwal, S., et al. Quantitative assessment of invasive mena isoforms (Menacalc) as an independent prognostic marker in breast cancer. Breast Cancer Res. 14 (5), R124 (2012).
  15. Forse, C. L., et al. Menacalc, a quantitative method of metastasis assessment, as a prognostic marker for axillary node-negative breast cancer. BMC Cancer. 15, 483 (2015).
  16. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Sci Signal. 7 (353), ra112 (2014).
  17. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
  18. Bragado, P., Sosa, M. S., Keely, P., Condeelis, J., Aguirre-Ghiso, J. A. Microenvironments dictating tumor cell dormancy. Recent Results Cancer Res. 195, 25-39 (2012).
  19. Husemann, Y., et al. Systemic spread is an early step in breast cancer. Cancer Cell. 13 (1), 58-68 (2008).
  20. St Croix, C. M., Leelavanichkul, K., Watkins, S. C. Intravital fluorescence microscopy in pulmonary research. Adv Drug Del Rev. 58 (7), 834-840 (2006).
  21. Al-Mehdi, A. B., et al. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
  22. Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), e6562 (2009).
  23. Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
  24. Wearn, J. T., Barr, J., German, W. The Behavior of the Arterioles and Capillaries of the Lung. Exp Biol Med. 24 (2), 114-115 (1926).
  25. Terry, R. J. A Thoracic Window for Observation of the Lung in a Living Animal. Science. 90 (2324), 43-44 (1939).
  26. De Alva, W. E., Rainer, W. G. A method of high speed in vivo pulmonary microcinematography under physiologic conditions. Angiology. 14, 160-164 (1963).
  27. Wagner, W. W. Jr, Filley, G. F. Microscopic observation of the lung in vivo. Vasc Dis. 2 (5), 229-241 (1965).
  28. Wagner, W. W. Jr Pulmonary microcirculatory observations in vivo under physiological conditions. J Appl Physiol. 26 (3), 375-377 (1969).
  29. Groh, J., Kuhnle, G. E., Kuebler, W. M., Goetz, A. E. An experimental model for simultaneous quantitative analysis of pulmonary micro- and macrocirculation during unilateral hypoxia in vivo. Res Exp Med. 192 (6), 431-441 (1992).
  30. Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57 (3), 385-393 (1994).
  31. Lamm, W. J., Bernard, S. L., Wagner, W. W., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-micron microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 98 (6), 2242-2248 (2005).
  32. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104 (2), 338-346 (2008).
  33. Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59 (3), 361-367 (2000).
  34. Fiole, D., Tournier, J. N. Intravital microscopy of the lung: minimizing invasiveness. J Biophotonics. , (2016).
  35. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  36. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  37. Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).
  38. Kitamura, T., et al. CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. J Exp Med. 212 (7), 1043-1059 (2015).
  39. Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).
  40. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  41. Mammalian cell biotechnology in protein production. Hauser, H., Wagner, R. , Walter de Gruyter. Berlin, New York. (1997).
  42. Lim, U. M., Yap, M. G., Lim, Y. P., Goh, L. T., Ng, S. K. Identification of autocrine growth factors secreted by CHO cells for applications in single-cell cloning media. J Proteome Res. 12 (7), 3496-3510 (2013).
  43. Nielsen, B. S., et al. A precise and efficient stereological method for determining murine lung metastasis volumes. Am J Pathol. 158 (6), 1997-2003 (2001).
  44. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
  45. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protoc. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  46. Harney, A. S., Condeelis, J., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. J Vis Exp. (112), e54042 (2016).
  47. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318 (2013).
  48. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4 (7), 1064-1072 (2009).
  49. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 19, Unit 19.7 (2013).
  50. Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294 (2013).
  51. Rao, S., Verkman, A. S. Analysis of organ physiology in transgenic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279 (1), C1-C18 (2000).

Tags

Cancer Research Sayı 116 Intravital görüntüleme vakum pencere multiphoton mikroskopi akciğer time-lapse kanser biyolojisi
Bir Vakum Stabilize Görüntüleme Penceresi ile Akciğer uzun vadeli Yüksek Çözünürlüklü Intravital Mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodriguez-Tirado, C., Kitamura, T.,… More

Rodriguez-Tirado, C., Kitamura, T., Kato, Y., Pollard, J. W., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. J. Vis. Exp. (116), e54603, doi:10.3791/54603 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter