Een<em> In Vitro</em> Organ Culture Model van het Muizen tussenwervelschijf
Summary
Hele orgelcultuur van de tussenwervelschijf (IVD) behoudt het natieve extracellulaire matrix, celfenotypen en cellulaire-matrix interacties. Hier beschrijven we een IVD cultuur systeem met behulp van de muis lumbale en caudale IVD's in hun functionele spinale-eenheden en een aantal applicaties door middel van dit systeem.
Abstract
Tussenwervelschijf (IVD) degeneratie is een belangrijke bijdrage aan lage rugpijn. De IVD is een fibrocartilagineus gewricht dat dient voor het verzenden en temperen lasten in de ruggengraat. De IVD bestaat uit een proteoglycan-rijke nucleus pulposus (NP) en een collageenrijke annulus fibrosis (AF) kern met kraakbeenachtige eindplaten. Samen met de aangrenzende wervels, de wervels IVD-structuur vormt een functionele ruggengraatgedeelte (FSU). Deze microstructuren bevatten unieke celtypes evenals unieke extracellulaire matrices. Hele orgelcultuur van de FSU behoudt de natieve extracellulaire matrix, celdifferentiatie fenotypes en cellulaire-matrix interacties. Zo orgelcultuur technieken zijn bijzonder nuttig voor het onderzoeken van de complexe biologische mechanismen van het IVD. Hier beschrijven we een high-throughput benadering voor het kweken van hele lumbale muis FSU dat een ideaal platform voor het bestuderen van de ziekte mechanismen en therapieën voor de IVD biedt. Verder beschrijven we several toepassingen die dit orgelcultuur methode om verdere studies met inbegrip van contrast-versterkte microCT imaging en drie-dimensionale high-resolution eindige elementen modellering van de IVD voeren benutten.
Introduction
Lage rugpijn (LBP) is de belangrijkste factor voor de wereldwijde invaliditeit en verlies van productiviteit op de werkplek, en de Amerikanen alleen door te brengen van meer dan 50 miljard dollar op LBP behandeling 1. Hoewel voorkomende, de etiologie van LBP blijft complexe en multifactoriële. Echter, tussenwervelschijf (IVD) degeneratie is een van de belangrijkste risicofactoren voor LBP 2.
De IVD bestaat uit drie microstructuren: het uitwendige annulus fibrosis (AF), het binnenste nucleus pulposus (NP), en twee kraakbeenachtige eindplaten die de hele structuur proximaal en distaal 3 sandwich. Ouderdomsgebonden degeneratie, de IVD componenten te vervangen structuur, samenstelling en mechanisch 4. Deze wijzigingen omvatten het verlies van proteoglycanen en vocht bij de NP, verminderde schijfhoogte en verslechterde mechanische competentie 5. Deze wijzigingen zijnvaak vergezeld van cytokines die een ontstekingsreactie, en neutrofielen en dorsale wortel ganglion binnendringing in de gewrichtsruimte afgesloten met een cascade van gebeurtenissen die leiden tot symptomen LBP 6 bevorderen.
Het bestuderen van de mechanismen van IVD-degeneratie is een uitdaging in de mens, omdat het vaak niet mogelijk om de oorzaak van de degeneratie te isoleren vóór het optreden van lage rugpijn. Aldus is een reductionistische benadering van vereenvoudiging van het experimentele systeem naar het IVD orgaan maakt mechanistische afstemming van causale variabelen en behandeling van hun downstream effecten 5. Het systeem wordt verminderd tot de natieve celpopulatie en de omliggende extracellulaire matrix, waardoor de directe interpretatie van de effecten van externe stimuli op IVD degeneratie. Bovendien zijn de lagere kosten en schaalbaarheid van knaagdiermodellen, alsmede het grote aantal genetisch gemodificeerde dieren 7, mogelijk maken thij snelle en gerichte screening van IVD degeneratieve mechanismen en mogelijke therapieën. We beschrijven hier een murine orgaan kweeksysteem waarin IVD cellulaire en weefselstabiliteit wordt gedurende 21 dagen, met bijzondere aandacht geschonken aan homeostatische, mechanische, structurele en inflammatoire patronen het IVD. Met behulp van deze methode, monitoren we functionele veranderingen van de IVD's in een stab geïnduceerd letsel model 8 tot en met de mechanismen achter disc degeneratie te begrijpen. Verder beschrijven we een aantal toepassingen van deze orgelcultuur methode om verdere studies met inbegrip van contrast-versterkte microCT imaging en drie-dimensionale high-resolution modellering van de IVD te voeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een orgaan cultuur van de muizen FSU met de nadruk op het toezicht op de biologische veranderingen in het IVD. De succesvolle onderhoud van deze culturen vereist een zorgvuldige steriele technieken. Vooral de dissectie stappen 2,1-2,6 en 3,1-3,6 cultuur stappen vereisen bijzonder toe steriele omstandigheden worden gehandhaafd en deze stappen wordt bij voorkeur uitgevoerd in een geïsoleerde procedure kamer met een HEPA luchtstroom om verontreinigingen te minimalis…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Washington University Musculoskeletal Research Center (NIH P30 AR057235), Molecular Imaging Center (NIH P50 CA094056), Mechanobiology Training Grant (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804 en NIH K01AR069116. De auteurs willen graag Patrick Wong bedanken voor zijn bijdrage in het verzamelen van gegevens.
Materials
| 96 well plate | Midwest Scientific | TP92096 | Used for biochemical assays |
| 24 well plate | Midwest Scientific | TP92024 | Used for organ culture |
| 25 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94024 | Used for organ culture |
| 10 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94010 | Used for organ culture |
| 5 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94005 | Used for organ culture |
| 500 ml bottle top filters, 22um | Midwest Scientific | TP99505 | Used for filter media |
| 10 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140098 | Used for biochemical assays |
| 200 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140900 | Used for biochemical assays |
| 1000 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140920 | Used for biochemical assays |
| DMEM /F-12 | Invitrogen | 11330032 | Used for culture media |
| Optiray 350 | Guebert | 19133341 | Used for contrast enhanced microCT |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F2442 | Used for culture media |
| Penicillin Streptomycin | Sigma | P4333 | Used for culture media |
| Tetrazolium Blue Chloride | Sigma | T4375 | Used for biochemical assays |
| D-Luciferin | Sigma | L6152 | Used for bioluminescence imaging |
| Chondroitin Sulfate | Sigma | C9819 | Used for biochemical assays |
| 10% Phosphomolybdic Acid Solution | Sigma | HT152 | Used for contrast enhanced microCT |
| Safranin O | Sigma | S8884 | diluted to .1% concentration (in water) |
| Fast Green FCF | Sigma | F7258 | .001% concentration |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | Used for biochemical assays |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleic acid staining |
| Cyanoacrylate Glue | Loctite | 234790 | Adhesive |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fischer Scientific | S348903 | Used for biochemical assays |
| Big Equipment | |||
| BioDent | ActiveLife | For mechanical testing | |
| Cytation 5 | Biotek | Spectrophotometer | |
| AxioCam503 | Carl Zeiss AG | Microscope | |
| VivaCT40 | Scanco | MicroCT | |
| Analytical balance | Denver Instrument Company | A-200DS | Analytical balance |
| Incubator HERAcell 150i | Thermo Scientific | Organ Culture | |
| Dissection Scope | VistaVision | Used during dissection | |
| Laser Micrometer | Keyence | LK-081 | Measuring disc height |
| Microcentrifuge 5810 R | Eppendorf | Used for biochemical assays | |
| Microtome | Leica | RM2255 | Used for histology |
| Software | |||
| Prism 7 | GraphPad | For statistics | |
| MATLAB R2014a | Mathworks | For modeling | |
| Osiri-LXIV | Pixmeo | Open Source | |
| MeshLab v1.3.3 | Visual Computing Lab – ISTI – CNR | Open Source | |
| PreView/FEBio 2.3 | Utah MRL & Columbia MBL | Open Source | |
| ImageJ | NIH | ||
| Microsoft Excel | Windows | ||
| Dissection Tools | |||
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | Or any nice pair of spring scissors |
| Fine Scissors – Sharp (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors – Sharp (larger) | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-40 | At least 2; can also use #3 |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | Fine Science Tools | 11150-10 | At least 2 |
| Micro-Adson Forceps, serrated | World Precision Instruments | 503719-12 | |
| Micro-Adson Forceps, teeth | World Precision Instruments | 501244 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel Blades – #23 | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Insect Pins , size 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| 27G Needle | BD PrecisionGlide Needles | BD305109 |
Riferimenti
- Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J. 8 (1), 8-20 (2008).
- Urban, J., Roberts, S. Degeneration of the intervertbral disc. Arthritis Res Ther. 5 (6), 1-48 (2003).
- Mirza, S. K., White, A. A. Anatomy of intervertebral disc and pathophysiology of herniated disc disease. J Clin Laser Med Surg. 13 (3), 131-142 (1995).
- Acaroglu, E. R., et al. Degeneration and aging affect the tensile behavior of human lumbar anulus fibrosus. Spine. 20 (24), 2690-2701 (1995).
- Abraham, A. C., Liu, J. W., Tang, S. Y. Longitudinal changes in the structure and inflammatory response of the intervertebral disc due to stab injury in a murine organ culture model. J Orthop Res. 34 (8), 1431-1438 (2016).
- Ohtori, S., Inoue, G., Miyagi, M., Takahashi, K. Pathomechanisms of discogenic low back pain in humans and animal models. Spine J. 15 (6), 1347-1355 (2015).
- Pelle, D. W., et al. Genetic and functional studies of the intervertebral disc: A novel murine intervertebral disc model. PLoS ONE. 9 (12), (2014).
- Zhang, H., et al. Time course investigation of intervertebral disc degeneration produced by needle-stab injury of the rat caudal spine. J Neurosurg: Spine. 15 (4), 404-413 (2011).
- Liu, J. W., Abraham, A. C., Tang, S. Y. The high-throughput phenotyping of the viscoelastic behavior of whole mouse intervertebral discs using a novel method of dynamic mechanical testing. J Biomech. 48 (10), 2189-2194 (2015).
- Lin, K. H., Wu, Q., Leib, D. J., Tang, S. Y. A novel technique for the contrast-enhanced microCT imaging of murine intervertebral discs. J Mech Behav Biomed Mater. 63, (2016).
- Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev: Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
- O’Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of animals used in disc research to human lumbar disc geometry. Spine. 32 (3), 328-333 (2007).
- Lee, C. R., et al. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine. 31, 515-522 (2006).
- Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture. J. Vis. Exp. (60), e3490 (2012).
- Holguin, N., Aguilar, R., Harland, R. A., Bomar, B. A., Silva, M. J. The aging mouse partially models the aging human spine: lumbar and coccygeal disc height, composition, mechanical properties, and Wnt signaling in young and old mice. J Appl Physiol. 116 (12), (2014).
