Ein<em> In Vitro</em> Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben
Summary
Ganz Organkultur der Bandscheibe (IVD) bewahrt die native extrazelluläre Matrix, Zellphänotypen und zelluläre-Matrix-Wechselwirkungen. Hier beschreiben wir ein IVD-Kultursystem mit Maus Lenden- und Schwanz IVDs in ihren funktionalen Wirbelsäuleneinheiten und mehrere Anwendungen, die dieses System nutzen.
Abstract
Bandscheibe (IVD) Degeneration ist ein wichtiger Faktor für Schmerzen im unteren Rücken. Der IVD ist ein fibrocartilagineum Gelenk, das in der Wirbelsäule Lasten zu übertragen und dämpfen dient. Der IVD besteht aus einem Proteoglycan reichen Nukleus pulposus (NP) und einem kollagenreichen Anulus fibrosus (AF) von knorpeligen Endplatten sandwichartig angeordnet. Zusammen mit den benachbarten Wirbeln, bildet die Wirbel-IVD-Struktur mit einer funktionellen Wirbelsäuleneinheit (FSU). Diese Mikrostrukturen enthalten einzigartige Zelltypen sowie einzigartige extrazellulären Matrix. Ganz Organkultur der FSU bewahrt die native extrazellulären Matrix, Zelldifferenzierung Phänotypen und zelluläre-Matrix-Interaktionen. Somit sind Organkultur-Techniken besonders nützlich für die komplexen biologischen Mechanismen des IVD zu untersuchen. Hier beschreiben wir einen High-Throughput-Ansatz zur Kultivierung gesamte Lendenwirbel Maus FSU, die für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen und Therapien für die IVD eine ideale Plattform zur Verfügung stellt. Darüber hinaus beschreiben wir siele Anwendungen, die diese Organkulturverfahren nutzen weitere Studien einschließlich kontrastverstärkte microCT Bildgebung und dreidimensionale hochaufgelöste Finite-Elemente-Modellierung des IVD zu leiten.
Introduction
Schmerzen im unteren Rücken (LBP) ist der führende Faktor für die globale Behinderung und verlorene Produktivität am Arbeitsplatz, und die Amerikaner allein verbringen mehr als 50 Milliarden Dollar für LBP Behandlung 1. Obwohl weit verbreitet, bleibt die Ätiologie von LBP komplex und multifaktoriell. Allerdings ist Bandscheibe (IVD) Degeneration zu den bedeutendsten Risikofaktoren für LBP 2.
Der IVD ist aus drei Mikrostrukturen: die äußere Anulus fibrosus (AF), der Innenraum Nucleus pulposus (NP) und zwei knorpeligen Endplatten, die die gesamte Struktur proximal und distal 3 – Sandwich. Mit dem Altern und Degeneration, ändern sich die Komponenten IVD Strukturell kompositionell und mechanisch 4. Diese Änderungen umfassen den Verlust von Proteoglykanen und Feuchtigkeit in der NP, verringerte Scheibenhöhe und verschlechterte mechanische Kompetenz 5. Diese Veränderungen sindoft durch Cytokine begleitet , die eine Entzündungsreaktion, sowie Neutrophilen und Spinalganglien Eindringen in den Gelenkraum kulminiert in einer Kaskade von Ereignissen zu fördern , die 6 bis LBP Symptomen führen.
Die Untersuchung der Mechanismen der IVD-Degeneration ist eine Herausforderung beim Menschen, weil es oft nicht möglich ist, die Ursache für die Degeneration vor dem Auftreten von Schmerzen im unteren Rücken zu isolieren. Somit wurde ein reduktionistischen Ansatz , um das experimentelle System zu vereinfachen , bis auf die IVD Organ ermöglicht mechanistische Feinabstimmung der kausalen Variablen und Prüfung ihre nachgelagerten Effekte 5. Das System wird nur die nativen Zellpopulation reduziert und extrazelluläre Matrix umgibt, wodurch die direkte Interpretation der Auswirkungen von äußeren Reizen auf IVD-Degeneration zu ermöglichen. Darüber hinaus ermöglichen die niedriger Kosten und die Skalierbarkeit von murinen Modellen, sowie die große Anzahl von gentechnisch veränderten Tieren 7, für ter rasch gezielte Screening von IVD degenerative Mechanismen und mögliche Therapien. Hier beschreiben wir ein Maus-Organkultursystem, in der IVD Zell- und Gewebestabilität über 21 Tage gehalten wird, mit besonderem Schwerpunkt auf den IVDs gegeben homeostatic, mechanische, strukturelle und entzündliche Muster. Mit dieser Methode überwachen wir die funktionellen Veränderungen IVDs in einem Stich induziertes Verletzungsmodell 8 , die Mechanismen hinter Scheibendegeneration zu verstehen. Weiterhin beschreiben wir mehrere Anwendungen dieser Organkulturverfahren weitere Studien einschließlich kontrastverstärkte microCT Bildgebung und dreidimensionale hochaufgelöste Modellierung des IVD zu leiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine Organkultur des murinen FSU mit dem Schwerpunkt auf die biologischen Veränderungen in der IVD-Überwachung. Die erfolgreiche Aufrechterhaltung dieser Kulturen erfordert eine sorgfältige sterile Techniken. Insbesondere werden die Schritte der Präparation 2,1-2,6 und die Kultur Schritte 3,1-3,6 besondere Sorgfalt erfordern sterilen Bedingungen, um sicherzustellen, werden beibehalten, und diese Schritte sollten vorzugsweise in einem isolierten Behandlungs…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Washington University Musculoskeletal Research Center (NIH P30 AR057235), Molecular Imaging Center (NIH P50 CA094056), Mechanobiology Ausbildung Grant (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804 und NIH K01AR069116 unterstützt. Die Autoren möchten sich Patrick Wong für seine Beiträge in der Datenerhebung danken.
Materials
| 96 well plate | Midwest Scientific | TP92096 | Used for biochemical assays |
| 24 well plate | Midwest Scientific | TP92024 | Used for organ culture |
| 25 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94024 | Used for organ culture |
| 10 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94010 | Used for organ culture |
| 5 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94005 | Used for organ culture |
| 500 ml bottle top filters, 22um | Midwest Scientific | TP99505 | Used for filter media |
| 10 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140098 | Used for biochemical assays |
| 200 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140900 | Used for biochemical assays |
| 1000 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140920 | Used for biochemical assays |
| DMEM /F-12 | Invitrogen | 11330032 | Used for culture media |
| Optiray 350 | Guebert | 19133341 | Used for contrast enhanced microCT |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F2442 | Used for culture media |
| Penicillin Streptomycin | Sigma | P4333 | Used for culture media |
| Tetrazolium Blue Chloride | Sigma | T4375 | Used for biochemical assays |
| D-Luciferin | Sigma | L6152 | Used for bioluminescence imaging |
| Chondroitin Sulfate | Sigma | C9819 | Used for biochemical assays |
| 10% Phosphomolybdic Acid Solution | Sigma | HT152 | Used for contrast enhanced microCT |
| Safranin O | Sigma | S8884 | diluted to .1% concentration (in water) |
| Fast Green FCF | Sigma | F7258 | .001% concentration |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | Used for biochemical assays |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleic acid staining |
| Cyanoacrylate Glue | Loctite | 234790 | Adhesive |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fischer Scientific | S348903 | Used for biochemical assays |
| Big Equipment | |||
| BioDent | ActiveLife | For mechanical testing | |
| Cytation 5 | Biotek | Spectrophotometer | |
| AxioCam503 | Carl Zeiss AG | Microscope | |
| VivaCT40 | Scanco | MicroCT | |
| Analytical balance | Denver Instrument Company | A-200DS | Analytical balance |
| Incubator HERAcell 150i | Thermo Scientific | Organ Culture | |
| Dissection Scope | VistaVision | Used during dissection | |
| Laser Micrometer | Keyence | LK-081 | Measuring disc height |
| Microcentrifuge 5810 R | Eppendorf | Used for biochemical assays | |
| Microtome | Leica | RM2255 | Used for histology |
| Software | |||
| Prism 7 | GraphPad | For statistics | |
| MATLAB R2014a | Mathworks | For modeling | |
| Osiri-LXIV | Pixmeo | Open Source | |
| MeshLab v1.3.3 | Visual Computing Lab – ISTI – CNR | Open Source | |
| PreView/FEBio 2.3 | Utah MRL & Columbia MBL | Open Source | |
| ImageJ | NIH | ||
| Microsoft Excel | Windows | ||
| Dissection Tools | |||
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | Or any nice pair of spring scissors |
| Fine Scissors – Sharp (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors – Sharp (larger) | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-40 | At least 2; can also use #3 |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | Fine Science Tools | 11150-10 | At least 2 |
| Micro-Adson Forceps, serrated | World Precision Instruments | 503719-12 | |
| Micro-Adson Forceps, teeth | World Precision Instruments | 501244 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel Blades – #23 | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Insect Pins , size 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| 27G Needle | BD PrecisionGlide Needles | BD305109 |
Riferimenti
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