Un<em> In vitro</em> Orgue Culture Modèle de la murine disque intervertébral
Summary
culture d'organe total du disque intervertébral (DIV) conserve la matrice extracellulaire native, les phénotypes cellulaires, et les interactions entre la matrice cellulaire. Nous décrivons ici un système de culture à l'aide IVD IVD lombaire de la souris et caudale dans leurs unités fonctionnelles de la colonne vertébrale et plusieurs applications utilisant ce système.
Abstract
La dégénérescence du disque intervertébral (IVD) est un facteur important de la lombalgie. L'IVD est un joint fibrocartilagineux qui sert à transmettre et à amortir les charges de la colonne vertébrale. Le IVD se compose d'un noyau riche en protéoglycanes-pulposus (NP) et un anneau fibreux riche en collagène (AF) prise en sandwich par cartilagineux plaques d'extrémité. Ensemble avec les vertèbres adjacentes, la structure des vertèbres-IVD forme une unité de colonne vertébrale fonctionnelle (FSU). Ces microstructures contiennent des types de cellules uniques ainsi que des matrices extracellulaires uniques. culture d'organe plénier de l'ex-URSS conserve la matrice extracellulaire native, phénotypes de différenciation cellulaire, et les interactions à matrice cellulaire. Ainsi, les techniques de culture d'organes sont particulièrement utiles pour étudier les mécanismes biologiques complexes du IVD. Nous décrivons ici une approche à haut débit pour la culture de l'ensemble de la souris FSU lombaire qui offre une plate-forme idéale pour l'étude des mécanismes et des thérapies pour la maladie du IVD. De plus, nous décrivons slusieurs applications qui utilisent ce procédé de culture d'organe de procéder à d'autres études, y compris l'imagerie par microCT contraste amélioré et en trois dimensions à haute résolution modélisation par éléments finis de la IVD.
Introduction
La lombalgie (LBP) est le principal facteur d'invalidité globale et la perte de productivité en milieu de travail, et les Américains dépensent à eux seuls plus de 50 milliards de dollars sur le traitement de la lombalgie 1. Bien que répandue, l'étiologie de la lombalgie reste complexe et multifactorielle. Cependant, la dégénérescence des disques intervertébraux (IVD) est parmi les facteurs de risque les plus importants pour LBP 2.
L'IVD est composé de trois microstructures: l'anneau fibreux extérieur (AF), le noyau pulpeux intérieur (NP), et deux plaques d' extrémité cartilagineux qui prennent en sandwich l'ensemble de la structure proximale et distale 3. Avec l' âge et la dégénérescence, les composants IVD changent de structure, de composition et mécaniquement 4. Ces changements incluent la perte de protéoglycanes et de l' hydratation de la NP, une diminution de la hauteur du disque, et détériorée compétence mécanique 5. Ces modifications sontsouvent accompagnée de cytokines qui favorisent une réponse inflammatoire, ainsi que neutrophile et intrusion ganglionnaires racine dorsale dans l'espace articulaire aboutissant à une cascade d'événements qui conduisent à des symptômes de lombalgie 6.
L'étude des mécanismes de la dégénérescence IVD est difficile chez les humains, car il est souvent impossible d'isoler la cause de la dégénérescence avant l'apparition de la lombalgie. Ainsi, une approche réductionniste de la simplification du système expérimental jusqu'à l'organe IVD permet peaufinage mécaniste des variables de cause à effet et d' examiner leurs effets en aval 5. Le système est réduit à la seule population de cellules native et entourant la matrice extracellulaire, permettant ainsi l'interprétation directe des effets des stimuli externes sur la dégénérescence IVD. De plus, le coût plus faible et l' évolutivité des modèles murins, ainsi que le grand nombre d'animaux génétiquement modifiés 7, permettent til rapide dépistage ciblé des mécanismes dégénératifs IVD et des thérapies potentielles. Ici, nous décrivons un système murin de culture d'organe dans lequel IVD stabilité cellulaire et tissulaire est maintenue pendant 21 jours, avec une attention particulière accordée aux IVDS de motifs homéostatique, mécaniques, structurelles et inflammatoires. En utilisant cette méthode, nous surveillons les changements fonctionnels de IVDS dans un modèle de lésion induite par poignarder 8 à comprendre les mécanismes de la dégénérescence du disque. De plus, nous décrivons plusieurs applications de cette méthode de culture d'organes pour mener d'autres études, y compris l'imagerie par microtomographie contraste amélioré et trois dimensions de modélisation à haute résolution de l'IVD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit une culture d'organes de l'ex-URSS de souris en mettant l'accent sur le suivi des changements biologiques dans le diagnostic in vitro. Le maintien de succès de ces cultures nécessite une étude minutieuse des techniques stériles. En particulier, la dissection étapes et 2/1 à 2/6 la culture étapes 03.01 à 03.06 ont besoin de soins spéciaux pour assurer des conditions de stérilité soient maintenues, et ces étapes doit être effectuée de préfér…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le (AR057235 P30 NIH) Centre de recherche musculo-squelettique Washington University, Centre d'imagerie moléculaire (NIH P50 CA094056), mécanobiologie subvention de formation (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804 et NIH K01AR069116. Les auteurs tiennent à remercier Patrick Wong pour sa contribution à la collecte des données.
Materials
| 96 well plate | Midwest Scientific | TP92096 | Used for biochemical assays |
| 24 well plate | Midwest Scientific | TP92024 | Used for organ culture |
| 25 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94024 | Used for organ culture |
| 10 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94010 | Used for organ culture |
| 5 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94005 | Used for organ culture |
| 500 ml bottle top filters, 22um | Midwest Scientific | TP99505 | Used for filter media |
| 10 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140098 | Used for biochemical assays |
| 200 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140900 | Used for biochemical assays |
| 1000 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140920 | Used for biochemical assays |
| DMEM /F-12 | Invitrogen | 11330032 | Used for culture media |
| Optiray 350 | Guebert | 19133341 | Used for contrast enhanced microCT |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F2442 | Used for culture media |
| Penicillin Streptomycin | Sigma | P4333 | Used for culture media |
| Tetrazolium Blue Chloride | Sigma | T4375 | Used for biochemical assays |
| D-Luciferin | Sigma | L6152 | Used for bioluminescence imaging |
| Chondroitin Sulfate | Sigma | C9819 | Used for biochemical assays |
| 10% Phosphomolybdic Acid Solution | Sigma | HT152 | Used for contrast enhanced microCT |
| Safranin O | Sigma | S8884 | diluted to .1% concentration (in water) |
| Fast Green FCF | Sigma | F7258 | .001% concentration |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | Used for biochemical assays |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleic acid staining |
| Cyanoacrylate Glue | Loctite | 234790 | Adhesive |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fischer Scientific | S348903 | Used for biochemical assays |
| Big Equipment | |||
| BioDent | ActiveLife | For mechanical testing | |
| Cytation 5 | Biotek | Spectrophotometer | |
| AxioCam503 | Carl Zeiss AG | Microscope | |
| VivaCT40 | Scanco | MicroCT | |
| Analytical balance | Denver Instrument Company | A-200DS | Analytical balance |
| Incubator HERAcell 150i | Thermo Scientific | Organ Culture | |
| Dissection Scope | VistaVision | Used during dissection | |
| Laser Micrometer | Keyence | LK-081 | Measuring disc height |
| Microcentrifuge 5810 R | Eppendorf | Used for biochemical assays | |
| Microtome | Leica | RM2255 | Used for histology |
| Software | |||
| Prism 7 | GraphPad | For statistics | |
| MATLAB R2014a | Mathworks | For modeling | |
| Osiri-LXIV | Pixmeo | Open Source | |
| MeshLab v1.3.3 | Visual Computing Lab – ISTI – CNR | Open Source | |
| PreView/FEBio 2.3 | Utah MRL & Columbia MBL | Open Source | |
| ImageJ | NIH | ||
| Microsoft Excel | Windows | ||
| Dissection Tools | |||
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | Or any nice pair of spring scissors |
| Fine Scissors – Sharp (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors – Sharp (larger) | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-40 | At least 2; can also use #3 |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | Fine Science Tools | 11150-10 | At least 2 |
| Micro-Adson Forceps, serrated | World Precision Instruments | 503719-12 | |
| Micro-Adson Forceps, teeth | World Precision Instruments | 501244 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel Blades – #23 | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Insect Pins , size 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| 27G Needle | BD PrecisionGlide Needles | BD305109 |
Riferimenti
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