アン<em>インビトロ</emマウス椎間板の>器官培養モデル
Summary
椎間板（IVD）の全体の器官培養は、天然の細胞外マトリックス、細胞表現型、および細胞 – マトリックス相互作用を保存します。ここでは、マウスの腰椎とその機能脊髄単位で尾したIVDと、このシステムを利用する複数のアプリケーションを使用してIVD培養系を説明します。
Abstract
椎間板（IVD）変性が腰痛に多大な貢献です。 IVDは、脊椎の荷重を伝達し、減衰させる働きを線維軟骨関節です。 IVDは、プロテオグリカンが豊富な髄核（NP）と軟骨終板に挟まれたコラーゲンが豊富な線維輪（AF）から成ります。一緒に隣接する椎骨と椎骨-IVDの構造は、機能的脊椎ユニット（FSU）を形成します。これらの微細構造はユニークな細胞型だけでなく、ユニークな細胞外基質が含まれています。 FSUの全体の器官培養は、天然の細胞外マトリックス、細胞分化表現型、および細胞 – マトリックス相互作用を保存します。これにより、器官培養技術は、IVDの複雑な生物学的メカニズムを調査するために特に有用です。ここでは、IVDのための病気のメカニズムや治療法を研究するための理想的なプラットフォームを提供し、全体腰椎マウスFSUsを培養するためのハイスループットアプローチを説明します。さらに、我々はSを記述する造影マイクロCTイメージングおよびIVDの三次元高解像度の有限要素モデリングを含む、さらなる研究を行うために、この器官培養法を利用everalアプリケーション。
Introduction
腰痛（LBP）は、職場での世界的な障害や生産性の損失のための主要な因子であり、そして一人のアメリカ人は、LBP処理1に500億ドルを超えると過ごします。流行が、LBPの病因は複雑かつ多因子のまま。しかし、椎間板（IVD）の変性は、LBP 2のための最も重要な危険因子の一つです。
外側線維輪（AF）、内部の髄核（NP）、及び近位および遠位3全体構造を挟む2つの軟骨終板：IVDは、三の微細構造で形成されています。加齢および変性に、IVD成分は、組成、構造的変化、および機械4。これらの変化は、NPにおけるプロテオグリカン及び水和の損失を含む、椎間板の高さを減少し、機械能力5を悪化。これらの変化はあります多くの場合、炎症反応だけでなく、LBP症状6につながる事象のカスケードで最高潮に達する関節腔への好中球および後根神経節の侵入を促進するサイトカインを伴います。
腰痛の発生前に、変性の原因を特定できないことが多いので、IVD変性のメカニズムを研究することは、ヒトでの挑戦です。このように、IVDの臓器まで実験システムを簡素化するの還元主義的アプローチは因果変数のメカニズムの微調整を可能にし、その下流効果5を調べます。システムは、このようにIVDの変性に対する外部刺激の影響の直接的な解釈を可能にする、唯一のネイティブ細胞集団と細胞外マトリックスを周囲に縮小されます。また、低コスト及びマウスモデルのスケーラビリティ、ならびに遺伝子改変動物7の多数は、Tを可能にします彼IVD変性のメカニズムと潜在的な治療法の迅速な目標スクリーニング。ここでは、IVD細胞および組織安定性たIVD、恒常的、機械的、構造的、および炎症性パターンに与えられる特定の焦点で、21日間にわたって維持されたマウス器官培養系を記載しています。この方法を使用して、我々は、椎間板変性の背後にあるメカニズムを理解するために刺し誘発性損傷モデル8でしたIVD機能の変更を監視します。さらに、我々は造影マイクロCTイメージングおよびIVDの三次元高解像度モデリングを含むさらなる研究を行うために、この器官培養法のいくつかのアプリケーションを記載しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、IVDにおける生物学的変化を監視することに重点を置いて、マウスFSUの器官培養の概要を説明します。これらの培養の成功メンテナンスは慎重な無菌技術を必要とします。具体的には、切開は、2.1から2.6ステップと培養物を3.1から3.6の無菌状態が維持されることを保証するために特別な注意を必要とするステップ、及びこれらの手順は、汚染物質を?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ワシントン大学の筋骨格系研究センター（NIHのP30のAR057235）、分子イメージングセンター（NIHのP50のCA094056）、メカノトレーニンググラント（NIH 5T32EB018266）、NIH R21AR069804、およびNIH K01AR069116によってサポートされていました。著者は、データ収集の彼の貢献のためのパトリック・ウォン感謝したいと思います。
Materials
| 96 well plate | Midwest Scientific | TP92096 | Used for biochemical assays |
| 24 well plate | Midwest Scientific | TP92024 | Used for organ culture |
| 25 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94024 | Used for organ culture |
| 10 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94010 | Used for organ culture |
| 5 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94005 | Used for organ culture |
| 500 ml bottle top filters, 22um | Midwest Scientific | TP99505 | Used for filter media |
| 10 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140098 | Used for biochemical assays |
| 200 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140900 | Used for biochemical assays |
| 1000 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140920 | Used for biochemical assays |
| DMEM /F-12 | Invitrogen | 11330032 | Used for culture media |
| Optiray 350 | Guebert | 19133341 | Used for contrast enhanced microCT |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F2442 | Used for culture media |
| Penicillin Streptomycin | Sigma | P4333 | Used for culture media |
| Tetrazolium Blue Chloride | Sigma | T4375 | Used for biochemical assays |
| D-Luciferin | Sigma | L6152 | Used for bioluminescence imaging |
| Chondroitin Sulfate | Sigma | C9819 | Used for biochemical assays |
| 10% Phosphomolybdic Acid Solution | Sigma | HT152 | Used for contrast enhanced microCT |
| Safranin O | Sigma | S8884 | diluted to .1% concentration (in water) |
| Fast Green FCF | Sigma | F7258 | .001% concentration |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | Used for biochemical assays |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleic acid staining |
| Cyanoacrylate Glue | Loctite | 234790 | Adhesive |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fischer Scientific | S348903 | Used for biochemical assays |
| Big Equipment | |||
| BioDent | ActiveLife | For mechanical testing | |
| Cytation 5 | Biotek | Spectrophotometer | |
| AxioCam503 | Carl Zeiss AG | Microscope | |
| VivaCT40 | Scanco | MicroCT | |
| Analytical balance | Denver Instrument Company | A-200DS | Analytical balance |
| Incubator HERAcell 150i | Thermo Scientific | Organ Culture | |
| Dissection Scope | VistaVision | Used during dissection | |
| Laser Micrometer | Keyence | LK-081 | Measuring disc height |
| Microcentrifuge 5810 R | Eppendorf | Used for biochemical assays | |
| Microtome | Leica | RM2255 | Used for histology |
| Software | |||
| Prism 7 | GraphPad | For statistics | |
| MATLAB R2014a | Mathworks | For modeling | |
| Osiri-LXIV | Pixmeo | Open Source | |
| MeshLab v1.3.3 | Visual Computing Lab – ISTI – CNR | Open Source | |
| PreView/FEBio 2.3 | Utah MRL & Columbia MBL | Open Source | |
| ImageJ | NIH | ||
| Microsoft Excel | Windows | ||
| Dissection Tools | |||
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | Or any nice pair of spring scissors |
| Fine Scissors – Sharp (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors – Sharp (larger) | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-40 | At least 2; can also use #3 |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | Fine Science Tools | 11150-10 | At least 2 |
| Micro-Adson Forceps, serrated | World Precision Instruments | 503719-12 | |
| Micro-Adson Forceps, teeth | World Precision Instruments | 501244 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel Blades – #23 | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Insect Pins , size 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| 27G Needle | BD PrecisionGlide Needles | BD305109 |
Riferimenti
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