<em> In Vitro</em> Орган культуры Модель мышиной межпозвонкового диска
Summary
Всего органной культура межпозвонкового диска (МПД) сохраняет нативный внеклеточный матрикс, клеточные фенотипы и клеточно-матрица. Здесь мы опишем систему IVD культуры с использованием поясничных мышей и хвостовые IVDs в их функциональных спинальных узлах и несколько приложений, использующих эту систему.
Abstract
Межпозвоночный диск (IVD) дегенерация является существенным фактором низкой боли в спине. IVD является соединение, которое относящийся к волокнистой хрящевой ткани служит для передачи и смочить нагрузок в позвоночнике. IVD состоит из протеогликанов богатых студенистого ядра (НП) и богатый коллаген пульпозного (AF), зажатого с помощью хрящевых концевых панелей. Вместе со смежными позвонками, структура позвонков-IVD образует функциональный блок позвоночника (БСС). Эти микроструктур содержат уникальные типы клеток, а также уникальные внеклеточный матрикс. Всего органной культура БССА сохраняет нативный внеклеточный матрикс, дифференциации клеток фенотипов и клеточно-матрица. Таким образом, методы органной культуры являются особенно полезными для исследования сложных биологических механизмов IVD. Здесь мы описываем с высокой пропускной подход для культивирования весь поясничный пох мыши, которая обеспечивает идеальную платформу для изучения механизмов болезни и терапии для IVD. Кроме того, мы опишем Several приложения, которые используют этот метод органной культуры для проведения дальнейших исследований, включая контрастированием microCT визуализации и трехмерного высокого разрешения моделирования конечных элементов в IVD.
Introduction
Боль в пояснице (LBP) является ведущим фактором глобальной инвалидности и потери производительности на рабочем месте, и только американцы тратят свыше 50 миллиардов долларов на лечении LBP 1. Хотя распространены, этиология LBP остается сложной и многофакторной. Тем не менее, межпозвоночного диска (IVD) дегенерация является одним из наиболее значимых факторов риска для LBP 2.
IVD состоит из трех микроструктур: внешняя кольцевая фиброз (АФ), внутренние студенистое ядра (НП), и два хрящевых концевых шайб , что сэндвич – вся структура проксимально и дистально 3. Со старением и дегенерацией, компоненты IVD изменить структурно, композиционно, и механически 4. Эти изменения включают в себя потерю протеогликанов и гидратации в НП, уменьшение высоты диска, а также ухудшение механической компетентности 5. Эти изменения являютсячасто сопровождаются цитокин , которые способствуют воспалительную реакцию, а также нейтрофилы и заднекорешкового вторжение ганглия в суставное пространство , кульминации в каскаде событий , которые приводят к появлению симптомов LBP 6.
Изучение механизмов дегенерации МПД является сложной задачей для человека, потому что это часто не представляется возможным, чтобы изолировать причину дегенерации до появления боли в пояснице. Таким образом, редукционистом подход упрощает экспериментальную систему вплоть до IVD органа позволяет механистической тонкую настройку причинных переменных и изучение их вниз по течению 5. Система сводится только к родной популяции клеток и окружающих внеклеточного матрикса, что позволяет прямую интерпретацию воздействия внешних раздражителей на IVD дегенерации. Кроме того, более низкая стоимость и масштабируемость мышиных моделях, а также большое количество генетически модифицированных животных 7, позволяют тон быстрый целевой скрининг дегенеративных механизмов IVD и потенциальных методов лечения. Здесь мы описываем мышиную систему органной культуры, в которой IVD клеточная и тканевая стабильность сохраняется в течение 21 дней, с особым вниманием к данному гомеостазу, механическим, структурным и воспалительным СТРУКТУРАМ IVDs. Используя этот метод, мы контролируем функциональные изменения , которые IVDs' в колотой модели индуцированной травмы 8 , чтобы понять механизмы , лежащие дегенерациями диска. Кроме того, мы опишем несколько применений этого способа культивирования органа для проведения дальнейших исследований, включая контрастированием microCT визуализации и трехмерного моделирования с высокой разрешающей способностью в IVD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол очерчивает органную культуру мышиного БССА с акцентом на мониторинг биологических изменений в IVD. Успешное содержание этих культур требует тщательной стерильной техники. В частности, рассечение шаги 2,1-2,6 и культура шаги 3,1-3,6 требуют особого ухода, чтобы…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Университета Musculoskeletal исследовательского центра в Вашингтоне (NIH P30 AR057235), молекулярной визуализации Центр (NIH P50 CA094056), Mechanobiology Training Грант (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804 и NIH K01AR069116. Авторы хотели бы поблагодарить Патрик Вонг за его вклад в сбор данных.
Materials
| 96 well plate | Midwest Scientific | TP92096 | Used for biochemical assays |
| 24 well plate | Midwest Scientific | TP92024 | Used for organ culture |
| 25 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94024 | Used for organ culture |
| 10 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94010 | Used for organ culture |
| 5 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94005 | Used for organ culture |
| 500 ml bottle top filters, 22um | Midwest Scientific | TP99505 | Used for filter media |
| 10 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140098 | Used for biochemical assays |
| 200 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140900 | Used for biochemical assays |
| 1000 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140920 | Used for biochemical assays |
| DMEM /F-12 | Invitrogen | 11330032 | Used for culture media |
| Optiray 350 | Guebert | 19133341 | Used for contrast enhanced microCT |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F2442 | Used for culture media |
| Penicillin Streptomycin | Sigma | P4333 | Used for culture media |
| Tetrazolium Blue Chloride | Sigma | T4375 | Used for biochemical assays |
| D-Luciferin | Sigma | L6152 | Used for bioluminescence imaging |
| Chondroitin Sulfate | Sigma | C9819 | Used for biochemical assays |
| 10% Phosphomolybdic Acid Solution | Sigma | HT152 | Used for contrast enhanced microCT |
| Safranin O | Sigma | S8884 | diluted to .1% concentration (in water) |
| Fast Green FCF | Sigma | F7258 | .001% concentration |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | Used for biochemical assays |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleic acid staining |
| Cyanoacrylate Glue | Loctite | 234790 | Adhesive |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fischer Scientific | S348903 | Used for biochemical assays |
| Big Equipment | |||
| BioDent | ActiveLife | For mechanical testing | |
| Cytation 5 | Biotek | Spectrophotometer | |
| AxioCam503 | Carl Zeiss AG | Microscope | |
| VivaCT40 | Scanco | MicroCT | |
| Analytical balance | Denver Instrument Company | A-200DS | Analytical balance |
| Incubator HERAcell 150i | Thermo Scientific | Organ Culture | |
| Dissection Scope | VistaVision | Used during dissection | |
| Laser Micrometer | Keyence | LK-081 | Measuring disc height |
| Microcentrifuge 5810 R | Eppendorf | Used for biochemical assays | |
| Microtome | Leica | RM2255 | Used for histology |
| Software | |||
| Prism 7 | GraphPad | For statistics | |
| MATLAB R2014a | Mathworks | For modeling | |
| Osiri-LXIV | Pixmeo | Open Source | |
| MeshLab v1.3.3 | Visual Computing Lab – ISTI – CNR | Open Source | |
| PreView/FEBio 2.3 | Utah MRL & Columbia MBL | Open Source | |
| ImageJ | NIH | ||
| Microsoft Excel | Windows | ||
| Dissection Tools | |||
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | Or any nice pair of spring scissors |
| Fine Scissors – Sharp (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors – Sharp (larger) | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-40 | At least 2; can also use #3 |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | Fine Science Tools | 11150-10 | At least 2 |
| Micro-Adson Forceps, serrated | World Precision Instruments | 503719-12 | |
| Micro-Adson Forceps, teeth | World Precision Instruments | 501244 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel Blades – #23 | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Insect Pins , size 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| 27G Needle | BD PrecisionGlide Needles | BD305109 |
Riferimenti
- Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J. 8 (1), 8-20 (2008).
- Urban, J., Roberts, S. Degeneration of the intervertbral disc. Arthritis Res Ther. 5 (6), 1-48 (2003).
- Mirza, S. K., White, A. A. Anatomy of intervertebral disc and pathophysiology of herniated disc disease. J Clin Laser Med Surg. 13 (3), 131-142 (1995).
- Acaroglu, E. R., et al. Degeneration and aging affect the tensile behavior of human lumbar anulus fibrosus. Spine. 20 (24), 2690-2701 (1995).
- Abraham, A. C., Liu, J. W., Tang, S. Y. Longitudinal changes in the structure and inflammatory response of the intervertebral disc due to stab injury in a murine organ culture model. J Orthop Res. 34 (8), 1431-1438 (2016).
- Ohtori, S., Inoue, G., Miyagi, M., Takahashi, K. Pathomechanisms of discogenic low back pain in humans and animal models. Spine J. 15 (6), 1347-1355 (2015).
- Pelle, D. W., et al. Genetic and functional studies of the intervertebral disc: A novel murine intervertebral disc model. PLoS ONE. 9 (12), (2014).
- Zhang, H., et al. Time course investigation of intervertebral disc degeneration produced by needle-stab injury of the rat caudal spine. J Neurosurg: Spine. 15 (4), 404-413 (2011).
- Liu, J. W., Abraham, A. C., Tang, S. Y. The high-throughput phenotyping of the viscoelastic behavior of whole mouse intervertebral discs using a novel method of dynamic mechanical testing. J Biomech. 48 (10), 2189-2194 (2015).
- Lin, K. H., Wu, Q., Leib, D. J., Tang, S. Y. A novel technique for the contrast-enhanced microCT imaging of murine intervertebral discs. J Mech Behav Biomed Mater. 63, (2016).
- Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev: Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
- O’Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of animals used in disc research to human lumbar disc geometry. Spine. 32 (3), 328-333 (2007).
- Lee, C. R., et al. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine. 31, 515-522 (2006).
- Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture. J. Vis. Exp. (60), e3490 (2012).
- Holguin, N., Aguilar, R., Harland, R. A., Bomar, B. A., Silva, M. J. The aging mouse partially models the aging human spine: lumbar and coccygeal disc height, composition, mechanical properties, and Wnt signaling in young and old mice. J Appl Physiol. 116 (12), (2014).
