<em> 체외</em쥐의 추간판의> 장기 문화 모델
Summary
척추 디스크 (IVD)의 전체 기관 배양 물은 세포 외 기질 원시 세포 표현형, 및 세포 – 기질 상호 작용을 보존한다. 여기에서 우리는 마우스 요추 및 기능적 척추 단위 꼬리, 사후 관리 및이 시스템을 이용한 여러 응용 프로그램을 사용하여 체외 배양 시스템을 설명합니다.
Abstract
척추 디스크 (IVD)의 변성은 요통에 크게 기여. IVD는 전송 및 척추에 부하를 저해하는 역할을하는 섬유 연골 관절이다. IVD는 프로테오글리칸 풍부한 수핵 (NP) 및 연골 단부 플레이트에 의해 협지 된 콜라겐이 풍부한 고리 섬유증 (AF)로 구성된다. 서로 인접 척추와 척추-IVD 구조는 기능 척추 유닛 (FSU)을 형성한다. 이 미세 고유 세포 유형뿐만 아니라 고유의 세포 외 매트릭스를 포함한다. 구소련의 전체 기관 문화는 원시 세포 외 기질, 세포 분화 표현형 및 세포 – 기질 상호 작용을 유지합니다. 따라서, 기관 배양 기술은 IVD의 복잡한 생물학적 메커니즘을 조사하는 데 특히 유용하다. 여기, 우리는 IVD에 대한 질병 메커니즘과 치료법을 연구하기위한 이상적인 플랫폼을 제공합니다 전체 요추 마우스 Fsus를 배양을위한 높은 처리량 방법을 설명합니다. 또한, 우리는의를 설명조영 증강 microCT 이미징 및 IVD 입체 고해상도 유한 요소 모델링을 포함하여 추가 연구를 수행이 장기 배양 방법을 이용하는 애플리케이션 everal.
Introduction
요통 (LBP)는 직장에서의 글로벌 장애에 대한 주요 요인 및 생산성 손실, 그리고 미국인들은 혼자 LBP 치료 한 50 억 달러의 초과 지출. 유행이지만, LBP의 원인은 복잡하고 다원적 남아있다. 그러나 척추 디스크 (IVD)의 변성은 LBP 2의 가장 중요한 위험 인자 중 하나입니다.
IVD 세 마이크로 제조된다 : 외부 환형 섬유증 (AF), 내부 수핵 (NP), 및 근위부와 원위부 (3) 전체의 구조를 끼우는 두 연골 종판. 노화와 퇴행으로, IVD 구성 요소는 구성 적, 구조적 변화, 기계적 4. 이러한 변화가 NP의 프로테오글리칸 및 수분의 손실을 포함하는, 디스크 높이의 감소, 및 기계적 능력을 저하 5. 이러한 변화는종종 LBP 현상 6 이어질 사건 캐스케이드 절정 공동 공간으로 염증 반응뿐만 아니라, 호중구 및 후근 신경절 침입을 촉진 사이토킨 수반.
이 요통의 발생 전에 변성의 원인을 분리하는 것이 불가능하기 때문 IVD 변성의 메커니즘을 공부하는 것은 인간의 도전이다. 따라서, IVD 기관에 이르기까지 실험 시스템을 단순화의 환원 주의적 접근 방식은 인과 변수의 기계적 미세 조정을 할 수 있으며 자신의 다운 스트림 효과 (5) 검사. 이 시스템은 따라서 IVD 퇴화에 외부 자극 효과의 직접적인 해석을 가능하게 만 원시 세포 집단 및 세포 외 기질을 둘러싸는 감소된다. 또한, 낮은 비용과 생쥐 모델의 확장 성뿐만 아니라, 유전자 변형 동물 (7)의 많은 수의, t 허용IVD 퇴행성 메커니즘과 잠재적 치료의 그는 빠른 대상으로 심사. 여기서는 IVD 세포 및 조직 안정성, 사후 관리가 '항상성 기계적 구조, 및 염증성 패턴 주어진 특정 포커스 21 일 이상 유지되는 뮤린 기관 배양 시스템을 설명한다. 이 방법을 사용하여, 우리는 디스크의 변성 뒤에 메커니즘을 이해하는 자상에 의한 손상 모델 (8)에서, 사후 관리 '기능의 변화를 모니터링 할 수 있습니다. 더욱이, 우리는 조영 증강 microCT 이미징 및 IVD 입체 고해상도 모델링 포함한 추가 연구를 수행하는 기관이 배양 방법의 여러 애플리케이션을 설명한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 IVD의 생물학적 변화를 모니터링에 중점을두고 쥐의 FSU의 장기 문화를 설명합니다. 이러한 문화의 성공적인 유지 보수주의 멸균 기술을 필요로한다. 특히, 박리는 2.1-2.6 단계 배양은 3.1-3.6 무균 상태가 유지되도록하기 위해 특별한주의를 필요로 단계,이 단계는 오염을 최소화하는 HEPA 공기 흐름과 격리 절차 방에서 바람직하게 수행되어야한다. 절개 과정 조…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 워싱턴 대학 근골격계 연구 센터 (NIH의 P30의 AR057235), 분자 이미징 센터 (NIH의 P50의 CA094056), 제어 공학 교육 그랜트 (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804, 및 NIH K01AR069116에 의해 지원되었다. 저자는 데이터 수집에서 그의 공헌 패트릭 웡에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| 96 well plate | Midwest Scientific | TP92096 | Used for biochemical assays |
| 24 well plate | Midwest Scientific | TP92024 | Used for organ culture |
| 25 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94024 | Used for organ culture |
| 10 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94010 | Used for organ culture |
| 5 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94005 | Used for organ culture |
| 500 ml bottle top filters, 22um | Midwest Scientific | TP99505 | Used for filter media |
| 10 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140098 | Used for biochemical assays |
| 200 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140900 | Used for biochemical assays |
| 1000 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140920 | Used for biochemical assays |
| DMEM /F-12 | Invitrogen | 11330032 | Used for culture media |
| Optiray 350 | Guebert | 19133341 | Used for contrast enhanced microCT |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F2442 | Used for culture media |
| Penicillin Streptomycin | Sigma | P4333 | Used for culture media |
| Tetrazolium Blue Chloride | Sigma | T4375 | Used for biochemical assays |
| D-Luciferin | Sigma | L6152 | Used for bioluminescence imaging |
| Chondroitin Sulfate | Sigma | C9819 | Used for biochemical assays |
| 10% Phosphomolybdic Acid Solution | Sigma | HT152 | Used for contrast enhanced microCT |
| Safranin O | Sigma | S8884 | diluted to .1% concentration (in water) |
| Fast Green FCF | Sigma | F7258 | .001% concentration |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | Used for biochemical assays |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleic acid staining |
| Cyanoacrylate Glue | Loctite | 234790 | Adhesive |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fischer Scientific | S348903 | Used for biochemical assays |
| Big Equipment | |||
| BioDent | ActiveLife | For mechanical testing | |
| Cytation 5 | Biotek | Spectrophotometer | |
| AxioCam503 | Carl Zeiss AG | Microscope | |
| VivaCT40 | Scanco | MicroCT | |
| Analytical balance | Denver Instrument Company | A-200DS | Analytical balance |
| Incubator HERAcell 150i | Thermo Scientific | Organ Culture | |
| Dissection Scope | VistaVision | Used during dissection | |
| Laser Micrometer | Keyence | LK-081 | Measuring disc height |
| Microcentrifuge 5810 R | Eppendorf | Used for biochemical assays | |
| Microtome | Leica | RM2255 | Used for histology |
| Software | |||
| Prism 7 | GraphPad | For statistics | |
| MATLAB R2014a | Mathworks | For modeling | |
| Osiri-LXIV | Pixmeo | Open Source | |
| MeshLab v1.3.3 | Visual Computing Lab – ISTI – CNR | Open Source | |
| PreView/FEBio 2.3 | Utah MRL & Columbia MBL | Open Source | |
| ImageJ | NIH | ||
| Microsoft Excel | Windows | ||
| Dissection Tools | |||
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | Or any nice pair of spring scissors |
| Fine Scissors – Sharp (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors – Sharp (larger) | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-40 | At least 2; can also use #3 |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | Fine Science Tools | 11150-10 | At least 2 |
| Micro-Adson Forceps, serrated | World Precision Instruments | 503719-12 | |
| Micro-Adson Forceps, teeth | World Precision Instruments | 501244 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel Blades – #23 | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Insect Pins , size 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| 27G Needle | BD PrecisionGlide Needles | BD305109 |
Riferimenti
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