<em> במבחנה</em> דגם תרבות איברים של הדיסק הבין חולייתי Murine
Summary
תרבות איבר שלם של הדיסק הבין חולייתי (IVD) משמר את מטריקס מקומיים, פנוטיפים התא, ואינטראקציות-מטריצה הסלולר. כאן אנו מתארים מערכת תרבות IVD באמצעות המותני עכבר IVDs זנב ביחידות השדרה התפקודית שלהם וכמה יישומים ניצול מערכת זו.
Abstract
הדיסק הבין חולייתי (IVD) ניוון הוא תורם משמעותי כאבי גב תחתונים. IVD היא משותפת fibrocartilaginous המשמש להעברה ויחליש עומסים על עמוד השדרה. IVD מורכב pulposus גרעין proteoglycan העשירי (NP) ו סיסטיק כטבעת עשיר קולגן (AF) דחוק ידי-צלחים סוף סחוסים. יחד עם החוליות, במבנה החוליות-IVD מהווה יחידת עמוד שדרה תפקודית (חמ"ע). microstructures אלה מכילים סוגי תאים ייחודיים כמו גם מטריצות תאיות ייחודיות. תרבות איבר שלמה של בריה"מ לשעבר משמרת את מטריקס המקומי, פנוטיפים התמיינות תאים, ואינטראקציות-מטריצה הסלולר. לפיכך, טכניקות תרבות איבר שימושיים במיוחד עבור חוקרת את המנגנונים הביולוגיים המורכבים של IVD. כאן, אנו מתארים גישה תפוקה גבוהה עבור culturing FSUs העכבר המותני שלם המספק פלטפורמה אידיאלית לחקר מנגנוני מחלות וטיפולים עבור IVD. יתר על כן, אנו מתארים יםיישומי everal כי לנצל שיטת תרבות איבר זה לערוך מחקרים נוספים כולל הדמית microCT משופרת ניגודיות דוגמנות אלמנטים סופיים תלת ממדים ברזולוציה גבוהה של IVD.
Introduction
כאב גב תחתון (LBP) הוא הגורם המוביל נכות העולמי אובדן פרודוקטיביות במקום העבודה, ואת האמריקאים לבדם לבלות העולה על 50 מיליארד דולרים על הטיפול LBP 1. למרות הרווח, על האטיולוגיה של LBP נשאר מורכב מולטיפקטוריאלית. עם זאת, הדיסק הבין חולייתי (IVD) ניוון הוא בין גורמי הסיכון המשמעותיים ביותר עבור LBP 2.
IVD עשוי שלושה microstructures: את סיסטיק annulus החיצוני (AF), את pulposus הגרעין הפנימי (NP), ושני endplates סחוסי כי כריך המבנה כולו proximally ו distally 3. עם הזדקנות וניוון, רכיבי IVD לשנות מבני, בעלי רכב, ו 4 מכאני. שינויים אלה כוללים אובדן proteoglycans הידרציה של NP, ירד גובה דיסק, והידרדר יכולת 5 מכנים. שינויים אלהלעתים קרובות מלווה ציטוקינים המעודדים תגובה דלקתית, כמו גם חדירת גנגליון נויטרופילים שורש הגבה לחלל המשותף ששיאו מפל של אירועים שהובילו סימפטומי LBP 6.
חקר המנגנונים של ניוון IVD הוא מאתגר בבני אדם משום שהוא לעתים קרובות לא ניתן לבודד את הגורם לניוון לפני קרות כאבי גב תחתון. לפיכך, גישה הרדוקציוניסטית של פישוט המערכת הניסיונית עד איבר IVD מאפשרת כוונון עדין המכניסטי של משתנים סיבתי ובחינת השפעות הזרם שלהם 5. המערכת מצטמצמת לאוכלוסיית תא הילידים רק וסביבת מטריקס, ובכך לאפשר את הפרשנות הישירה של ההשפעות של גירויים חיצוניים על ניוון IVD. יתר על כן, העלות נמוכה יותר ויכולת הרחבה של מודלים בעכברים, כמו גם מספר רב של בעלי חיים מהונדסים גנטית 7, לאפשר tהוא הקרנה ממוקדת מהירה של מנגנוני ניוונית IVD וטיפולים פוטנציאליים. כאן, אנו מתארים מערכת תרבות איבר בעכברים בם יציבות הסלולר רקמות IVD נשמרו לאורך 21 ימים, עם דגש ספציפי שניתן ההומיאוסטטית, מכנים IVDs, מבניים, ודפוסים דלקתיים. באמצעות שיטה זו, אנו עוקבים אחר השינויים התפקודיים IVDs במודל פציעה נגרם דקירה 8 כדי להבין את המנגנונים מאחורי ניוון הדיסק. יתר על כן, אנו מתארים מספר יישומים של שיטת תרבות איבר זה לערוך מחקרים נוספים כולל הדמית microCT משופרת ניגודיות תלת ממד דוגמנות ברזולוציה גבוהה של IVD.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר תרבות איבר חמ"ע בעכברים עם דגש על ניטור השינויים הביולוגיים של IVD. התחזוקה המוצלחת של תרבויות אלה דורשת טכניקות סטרילי זהירות. בפרט, לנתיחת צעדי 2.1-2.6 ואת תרבות צעדים 3.1-3.6 דורשים טיפול מיוחד כדי להבטיח נשמרים בתנאים סטריליים, וצעדי?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מרכז המחקר השלד והשרירים אוניברסיטת וושינגטון (AR057235 P30 NIH), מרכז הדמיה מולקולרית (CA094056 P50 NIH), Mechanobiology הדרכה גרנט (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804, ו- NIH K01AR069116. המחברים מבקשים להודות פטריק וונג על תרומתו באיסוף הנתונים.
Materials
| 96 well plate | Midwest Scientific | TP92096 | Used for biochemical assays |
| 24 well plate | Midwest Scientific | TP92024 | Used for organ culture |
| 25 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94024 | Used for organ culture |
| 10 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94010 | Used for organ culture |
| 5 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94005 | Used for organ culture |
| 500 ml bottle top filters, 22um | Midwest Scientific | TP99505 | Used for filter media |
| 10 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140098 | Used for biochemical assays |
| 200 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140900 | Used for biochemical assays |
| 1000 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140920 | Used for biochemical assays |
| DMEM /F-12 | Invitrogen | 11330032 | Used for culture media |
| Optiray 350 | Guebert | 19133341 | Used for contrast enhanced microCT |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F2442 | Used for culture media |
| Penicillin Streptomycin | Sigma | P4333 | Used for culture media |
| Tetrazolium Blue Chloride | Sigma | T4375 | Used for biochemical assays |
| D-Luciferin | Sigma | L6152 | Used for bioluminescence imaging |
| Chondroitin Sulfate | Sigma | C9819 | Used for biochemical assays |
| 10% Phosphomolybdic Acid Solution | Sigma | HT152 | Used for contrast enhanced microCT |
| Safranin O | Sigma | S8884 | diluted to .1% concentration (in water) |
| Fast Green FCF | Sigma | F7258 | .001% concentration |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | Used for biochemical assays |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleic acid staining |
| Cyanoacrylate Glue | Loctite | 234790 | Adhesive |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fischer Scientific | S348903 | Used for biochemical assays |
| Big Equipment | |||
| BioDent | ActiveLife | For mechanical testing | |
| Cytation 5 | Biotek | Spectrophotometer | |
| AxioCam503 | Carl Zeiss AG | Microscope | |
| VivaCT40 | Scanco | MicroCT | |
| Analytical balance | Denver Instrument Company | A-200DS | Analytical balance |
| Incubator HERAcell 150i | Thermo Scientific | Organ Culture | |
| Dissection Scope | VistaVision | Used during dissection | |
| Laser Micrometer | Keyence | LK-081 | Measuring disc height |
| Microcentrifuge 5810 R | Eppendorf | Used for biochemical assays | |
| Microtome | Leica | RM2255 | Used for histology |
| Software | |||
| Prism 7 | GraphPad | For statistics | |
| MATLAB R2014a | Mathworks | For modeling | |
| Osiri-LXIV | Pixmeo | Open Source | |
| MeshLab v1.3.3 | Visual Computing Lab – ISTI – CNR | Open Source | |
| PreView/FEBio 2.3 | Utah MRL & Columbia MBL | Open Source | |
| ImageJ | NIH | ||
| Microsoft Excel | Windows | ||
| Dissection Tools | |||
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | Or any nice pair of spring scissors |
| Fine Scissors – Sharp (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors – Sharp (larger) | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-40 | At least 2; can also use #3 |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | Fine Science Tools | 11150-10 | At least 2 |
| Micro-Adson Forceps, serrated | World Precision Instruments | 503719-12 | |
| Micro-Adson Forceps, teeth | World Precision Instruments | 501244 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel Blades – #23 | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Insect Pins , size 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| 27G Needle | BD PrecisionGlide Needles | BD305109 |
Riferimenti
- Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J. 8 (1), 8-20 (2008).
- Urban, J., Roberts, S. Degeneration of the intervertbral disc. Arthritis Res Ther. 5 (6), 1-48 (2003).
- Mirza, S. K., White, A. A. Anatomy of intervertebral disc and pathophysiology of herniated disc disease. J Clin Laser Med Surg. 13 (3), 131-142 (1995).
- Acaroglu, E. R., et al. Degeneration and aging affect the tensile behavior of human lumbar anulus fibrosus. Spine. 20 (24), 2690-2701 (1995).
- Abraham, A. C., Liu, J. W., Tang, S. Y. Longitudinal changes in the structure and inflammatory response of the intervertebral disc due to stab injury in a murine organ culture model. J Orthop Res. 34 (8), 1431-1438 (2016).
- Ohtori, S., Inoue, G., Miyagi, M., Takahashi, K. Pathomechanisms of discogenic low back pain in humans and animal models. Spine J. 15 (6), 1347-1355 (2015).
- Pelle, D. W., et al. Genetic and functional studies of the intervertebral disc: A novel murine intervertebral disc model. PLoS ONE. 9 (12), (2014).
- Zhang, H., et al. Time course investigation of intervertebral disc degeneration produced by needle-stab injury of the rat caudal spine. J Neurosurg: Spine. 15 (4), 404-413 (2011).
- Liu, J. W., Abraham, A. C., Tang, S. Y. The high-throughput phenotyping of the viscoelastic behavior of whole mouse intervertebral discs using a novel method of dynamic mechanical testing. J Biomech. 48 (10), 2189-2194 (2015).
- Lin, K. H., Wu, Q., Leib, D. J., Tang, S. Y. A novel technique for the contrast-enhanced microCT imaging of murine intervertebral discs. J Mech Behav Biomed Mater. 63, (2016).
- Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev: Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
- O’Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of animals used in disc research to human lumbar disc geometry. Spine. 32 (3), 328-333 (2007).
- Lee, C. R., et al. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine. 31, 515-522 (2006).
- Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture. J. Vis. Exp. (60), e3490 (2012).
- Holguin, N., Aguilar, R., Harland, R. A., Bomar, B. A., Silva, M. J. The aging mouse partially models the aging human spine: lumbar and coccygeal disc height, composition, mechanical properties, and Wnt signaling in young and old mice. J Appl Physiol. 116 (12), (2014).
