A<em> In Vitro</em> Modelo Cultura Órgão da Murino Intervertebral Disc
Summary
cultura de órgão inteiro do disco intervertebral (IVD) preserva a matriz extracelular nativa, fenótipos celulares, e interacções de matriz celular. Aqui nós descrevemos um sistema de cultura IVD utilizando lombar do mouse e IVDs caudal em suas unidades da coluna vertebral funcionais e várias aplicações que utilizam este sistema.
Abstract
degeneração do disco intervertebral (IVD) é um contribuinte significativo para a dor lombar. O IVD é uma joint fibrocartilaginous que serve para transmitir e amortecer cargas na coluna vertebral. O IVD consiste de um pulposo rica em proteoglicanos núcleo (NP) e um anel fibrose rico em colagénio (AF) ensanduichado por placas terminais cartilaginosas. Juntamente com as vértebras adjacentes, a estrutura vértebras-IVD forma uma unidade funcional coluna (FSU). Estas microestruturas contêm tipos de células únicas, bem como matrizes extracelulares únicas. cultura de órgão inteiro do FSU preserva a matriz extracelular nativa, fenótipos de diferenciação celular, e interacções de matriz celular. Assim, as técnicas de cultura de órgãos são particularmente úteis para a investigação dos mecanismos biológicos complexos da IVD. Aqui, descrevemos uma abordagem de alto rendimento para a cultura FSUs rato lombar inteiro que fornece uma plataforma ideal para estudar os mecanismos da doença e terapias para o IVD. Além disso, descrevemos several aplicações que utilizam este processo de cultura de órgão para conduzir mais estudos de imagiologia incluindo microCT com contraste e tridimensional de alta resolução de modelagem de elemento finito da IVD.
Introduction
Dor lombar (LBP) é o principal fator para a deficiência global e perda de produtividade no local de trabalho, e os americanos sozinho gastar em excesso de 50 bilhões de dólares em tratamento LBP 1. Embora prevalente, a etiologia da LBP permanece complexa e multifatorial. No entanto, disco intervertebral (IVD) degeneração está entre os factores de risco mais importantes para a LBP 2.
O IVD é feito de três microestruturas: a fibrose exterior do anel (FA), o interior do núcleo pulposo (NP), e duas placas extremas cartilaginosos que sanduíche toda a estrutura proximal e distalmente 3. Com o envelhecimento ea degeneração, os componentes IVD mudar estruturalmente, de composição, e mecanicamente 4. Estas alterações incluem a perda de proteoglicanos e hidratação da NP, diminuição da altura do disco, e deteriorou competência mecânico 5. Estas alterações sãomuitas vezes acompanhada de citoquinas que promovem uma resposta inflamatória, bem como de neutrófilos e gânglio da raiz dorsal de intrusão no espaço da articulação culminando numa cascata de eventos que levam à sintomas LBP 6.
O estudo dos mecanismos de degeneração IVD é um desafio em seres humanos, porque muitas vezes não é possível isolar a causa da degeneração antes da ocorrência de dor lombar. Assim, uma abordagem redutora de simplificar o sistema experimental para baixo para o órgão IVD permite o ajuste fino mecanicista de variáveis causais e examinando os seus efeitos a jusante 5. O sistema é reduzida para apenas a população celular nativo e matriz extracelular circundante, permitindo assim que a interpretação directa dos efeitos de estulos externos sobre a degeneração IVD. Além disso, o custo mais baixo e escalabilidade de modelos de murino, bem como o grande número de animais geneticamente modificados 7, para permitir que tele triagem direcionada rápida de mecanismos degenerativas IVD e terapias potenciais. Aqui, descrevemos um sistema de cultura de órgãos de murino em que IVD estabilidade celular e do tecido é mantida ao longo de 21 dias, com foco específico dado de padrões homeostáticos, mecânicas, estruturais e inflamatórias dos IVDs. Usando esse método, podemos monitorar as mudanças funcionais dos IVDs em um modelo de lesão induzida por facada 8 de compreender os mecanismos por trás degeneração do disco. Além disso, nós descrevemos várias aplicações deste processo de cultura de órgão para conduzir mais estudos de imagiologia incluindo microCT com contraste e modelação tridimensional de alta resolução da IVD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve uma cultura de órgão do FSU murino com ênfase sobre o controlo das alterações biológicas no IVD. A manutenção bem-sucedida dessas culturas requer técnicas estéreis cuidadosos. Em particular, a dissecção passos 2,1-2,6 e a cultura passos 3,1-3,6 requerem um cuidado especial para garantir condições estéreis são mantidas, e estes passos deverá ser realizada preferencialmente numa sala de procedimentos isolado com um fluxo de ar HEPA para minimizar co…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Universidade Musculoskeletal Research Center Washington (NIH P30 AR057235), Molecular Imaging Center (NIH P50 CA094056), mechanobiology Formação Grant (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804, e NIH K01AR069116. Os autores gostariam de agradecer a Patrick Wong por suas contribuições na coleta de dados.
Materials
| 96 well plate | Midwest Scientific | TP92096 | Used for biochemical assays |
| 24 well plate | Midwest Scientific | TP92024 | Used for organ culture |
| 25 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94024 | Used for organ culture |
| 10 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94010 | Used for organ culture |
| 5 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94005 | Used for organ culture |
| 500 ml bottle top filters, 22um | Midwest Scientific | TP99505 | Used for filter media |
| 10 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140098 | Used for biochemical assays |
| 200 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140900 | Used for biochemical assays |
| 1000 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140920 | Used for biochemical assays |
| DMEM /F-12 | Invitrogen | 11330032 | Used for culture media |
| Optiray 350 | Guebert | 19133341 | Used for contrast enhanced microCT |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F2442 | Used for culture media |
| Penicillin Streptomycin | Sigma | P4333 | Used for culture media |
| Tetrazolium Blue Chloride | Sigma | T4375 | Used for biochemical assays |
| D-Luciferin | Sigma | L6152 | Used for bioluminescence imaging |
| Chondroitin Sulfate | Sigma | C9819 | Used for biochemical assays |
| 10% Phosphomolybdic Acid Solution | Sigma | HT152 | Used for contrast enhanced microCT |
| Safranin O | Sigma | S8884 | diluted to .1% concentration (in water) |
| Fast Green FCF | Sigma | F7258 | .001% concentration |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | Used for biochemical assays |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleic acid staining |
| Cyanoacrylate Glue | Loctite | 234790 | Adhesive |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fischer Scientific | S348903 | Used for biochemical assays |
| Big Equipment | |||
| BioDent | ActiveLife | For mechanical testing | |
| Cytation 5 | Biotek | Spectrophotometer | |
| AxioCam503 | Carl Zeiss AG | Microscope | |
| VivaCT40 | Scanco | MicroCT | |
| Analytical balance | Denver Instrument Company | A-200DS | Analytical balance |
| Incubator HERAcell 150i | Thermo Scientific | Organ Culture | |
| Dissection Scope | VistaVision | Used during dissection | |
| Laser Micrometer | Keyence | LK-081 | Measuring disc height |
| Microcentrifuge 5810 R | Eppendorf | Used for biochemical assays | |
| Microtome | Leica | RM2255 | Used for histology |
| Software | |||
| Prism 7 | GraphPad | For statistics | |
| MATLAB R2014a | Mathworks | For modeling | |
| Osiri-LXIV | Pixmeo | Open Source | |
| MeshLab v1.3.3 | Visual Computing Lab – ISTI – CNR | Open Source | |
| PreView/FEBio 2.3 | Utah MRL & Columbia MBL | Open Source | |
| ImageJ | NIH | ||
| Microsoft Excel | Windows | ||
| Dissection Tools | |||
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | Or any nice pair of spring scissors |
| Fine Scissors – Sharp (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors – Sharp (larger) | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-40 | At least 2; can also use #3 |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | Fine Science Tools | 11150-10 | At least 2 |
| Micro-Adson Forceps, serrated | World Precision Instruments | 503719-12 | |
| Micro-Adson Forceps, teeth | World Precision Instruments | 501244 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel Blades – #23 | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Insect Pins , size 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| 27G Needle | BD PrecisionGlide Needles | BD305109 |
Riferimenti
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