رواية الفحص لالباردة حس الألم في<em> ذبابة الفاكهة</em> يرقات
Summary
نحن هنا لشرح فحص رواية لدراسة حس الألم البارد في يرقات ذبابة الفاكهة. هذا الاختبار يستخدم لبلتيير التحقيق مبنية خصيصا قادرة على تطبيق حافز البارد الضارة التنسيق والنتائج القابلة للقياس في السلوكيات الباردة محددة. وهذه التقنية تسمح مزيد من تشريح الخلوية والجزيئية من حس الألم البارد.
Abstract
كيف الكائنات العقل والاستجابة لدرجات الحرارة الضارة لا تزال غير مفهومة. وعلاوة على ذلك، فإن الآليات الكامنة للتوعية الآلية الحسية، كما هو الحال في مرضى الذين يعانون من اعتلال الأعصاب المحيطية أو توعية الإصابة التي يسببها، لا يتميز أيضا. تم استخدام نموذج ذبابة الفاكهة لين العريكة وراثيا لدراسة الخلايا والجينات اللازمة لكشف الحرارة الضارة، التي أسفرت عن الجينات الحفاظ متعددة من الفائدة. لا يعرف إلا القليل عن ذلك الخلايا ومستقبلات مهمة للاستشعار البارد الضارة. وعلى الرغم من ذبابة الفاكهة لا البقاء على قيد الحياة التعرض لفترات طويلة لدرجات الحرارة الباردة (≤10 درجة مئوية)، وسوف تجنب بارد، مفضلا ارتفاع درجات الحرارة في المقايسات تفضيل السلوكية، وكيف تشعر وربما تجنب المحفزات الباردة الضارة في الآونة الأخيرة تم التحقيق فقط.
نحن هنا وصف وتوصيف أول البرد الضارة (≤10 درجة مئوية) الفحص السلوكي فيذبابة الفاكهة. استخدام هذه الأداة وفحص، وتبين لنا محقق كيفية تقييم نوعيا وكميا السلوكيات مسبب للألم الباردة. ويمكن القيام بذلك في ظل ظروف طبيعية ثقافة / صحية، أو يفترض في سياق المرض أو الإصابة أو التوعية. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذا الاختبار على اليرقات التي اختيرت لالمورثات المرغوبة، والتي قد تؤثر thermosensation، والألم، أو التوعية مسبب للألم. وبالنظر إلى أن الألم هو عملية الحفظ جدا، وذلك باستخدام هذا الاختبار إلى مزيد من الدراسة حس الألم الحراري ومن المرجح أن جمع التفاهم مهم من العمليات الألم في الأنواع الأخرى، بما في ذلك الفقاريات.
Introduction
وقد ثبت ذبابة الفاكهة أن تكون مفيدة للغاية لتحديد الجينات رواية حفظها والدوائر العصبية التي تكمن وراء السلوك المعقد. توفر الذباب مجموعة أدوات الجينية المتطورة والجهاز العصبي مبسطة التي تتيح دقة الجيني والخلايا العصبية التلاعب 1، 2، 3، 4 لتشريح الأسس الخلوية والجزيئية من حس الألم 5 و 6 و 7. اليرقات هي مفيدة بشكل خاص لهذه التحليلات، بالنظر إلى أن فحوصات السلوكية لمسة رقيقة 8 و 9 و 10 و الحرارة الضارة 11 و 12 و 13 و الإحساس الميكانيكية من المحفزات الضارة 4، </sup> وقد تم بالفعل إنشاء 11، وإهاب اليرقات شفافة يسمح للتصوير الحية أو ثابت من البشرة والخلايا العصبية الحسية الأساسية. في الآونة الأخيرة، كما تم تطوير مقايسة لالباردة الضارة 7، والذي وصفنا في المزيد من التفاصيل هنا.
باستخدام ما يرام، والمخروطية ذات الرؤوس التحقيق البارد، وتبين لنا أن يرقات ذبابة الفاكهة المعرض مجموعة من السلوكيات رد الفعل الباردة محددة، تختلف عن السلوكيات التي لوحظت خلال الحركة العادية، وبعد لمسة رقيقة، أو بعد القاسية الميكانيكية أو ارتفاع في درجة الحرارة المحفزات 7 و 8 و 11 . وتشمل السلوكيات الباردة محددة انكماش قوي لكامل الجسم (CT)، ورفع 45-90º للقطاعات الخلفي (PR) ورفع في وقت واحد الأمامية والخلفية قطاعات في U-الشكل (US). انتشار هذه السلوكيات يزداد مع انخفاض درجات الحرارة ولكن في كل القمم في الصورةمختلفة طفيفة درجات الحرارة الباردة. الأعمال الأخيرة تشير إلى أن الردود CT وتوسط من قبل مختلف الخلايا العصبية الحسية المحيطية من تلك التي تستجيب للحرارة الضارة أو المنبهات الميكانيكية القاسية 7.
مثل الكثير من nociceptors الفقاريات، ذبابة الفاكهة شجيري متعددة (MD) الخلايا العصبية الحسية المحيطية وجود هياكل شجيري المعقدة التي arborize على البشرة 1. الخلايا العصبية MD موجودة في كل شريحة هيئة اليرقات، وإسقاط محاور لالحبل العصبي البطني 14. يتم فصل الخلايا العصبية الحسية MD إلى أربع فئات مختلفة (I-IV) على أساس التشكل شجيري ووتتراوح الوظائف الحسية 4، 9، 10، 15، 16، 17. في حين أن الخلايا العصبية في الصف الرابع اللازمة لردود لفة الجسم الجانبي اليرقاتلدرجات حرارة عالية أو المنبهات الميكانيكية قاسية 4، والطبقة يطلب III الخلايا العصبية للاستجابة لمسة رقيقة 9 و 10 و لا يتم تفعيلها إلا من خلال الباردة، ولكن أيضا مطلوبة لالاستجابات السلوكية أثار الباردة-7. كل من الدرجة الثالثة والدرجة IV الخلايا العصبية تستخدم منفصلة مستقبلات عابرة المحتملة (TRP) قنوات لتسهيل الاستجابات السلوكية لالضارة 7 و 11 و 18 و المحفزات 9، 10، 17، 19 غير الضارة. وعلاوة على ذلك، وتوعية حس الألم اليرقات إصابة التالية، على الصعيدين الخلوية 20 و السلوكية 12، 21.
مقايسة الموصوفة هنا يسمح للquantificatioن أي من المعتاد، أو يحتمل أن تغير الاستجابات السلوكية لدرجات الحرارة الباردة التي تتراوح بين البرد الضارة (≤ 10 درجة مئوية)، بارد حميدة (11-17 درجة مئوية)، ودرجات الحرارة المحيطة (18-22 درجة مئوية). درجات الحرارة الباردة المستخدمة في هذا الاختبار هي قادرة على تفعيل مباشرة من الطبقة الثالثة الخلايا العصبية الحسية، انتزاع قوية، وزيادة الكالسيوم استنساخه والاستجابات السلوكية أثار الباردة، والتي يمكن أن يكون نوعيا وكميا تحليلها 7. هذا الاختبار يمكن تطبيقها على يرقات أي الوراثي تقريبا فضلا عن اليرقات تتعرض لظروف بيئية مختلفة (التغذية تتغير الإصابة، وكلاء الدوائية) لتحديد العوامل الوراثية والبيئية على حد سواء التي تؤثر على حس الألم البارد، والتوعية مسبب للألم أو ليونة مسبب للألم. وبالنظر إلى أن thermosensation في كل مكان عبر العديد من الأنواع، يوفر هذا الاختبار أداة قيمة لدراسة حس الألم وقد كشف أهداف الجينات رواية أو التفاعلات العصبية التي من شأنها تحسينفهمنا من حس الألم الفقاريات.
التحقيق البارد مبنية خصيصا (انظر التحقيق البارد، جدول المواد) يستخدم في درجة الحرارة حلقة مغلقة تسيطر عليها الجهاز بلتيير، الذي يبرد رمح الألومنيوم ورأس مخروطي الشكل من خلال التوصيل الحراري. تم تضمين الثرمستور داخل غيض الألومنيوم المخروطية تقارير درجة الحرارة في الوقت الحقيقي على وحدة التحكم. وترد بالوعة الحرارة ومروحة وحدة حرارية لتنظيم الحمل تأثير بلتيير في الحرارة (مراقبة الجودة) حتى مدى درجة الحرارة المطلوبة من (22-0 ° C) لا يمكن أن يتحقق (انظر وحدة تحكم الحرارية، جدول المواد). يتم تطبيق التحفيز البارد الضارة من تلميح التحقيق البارد من جهة، إلى خط الوسط ظهري، إلى شريحة (ق) على مسافة واحدة من طرفي الأمامية والخلفية (تقريبا شريحة A4، انظر الشكل 1A) من اليرقة. وردا على المحفزات الباردة، اليرقات تنتج عادة واحد من ثلاثة السلوكيات أثار الباردة ضمن 10 ثانية قطع: كامل الجسمانكماش (CT)، ورفع 45-90º من الأمامية والخلفية قطاعات في U-الشكل (US)، أو رفع للقطاعات الخلفي (PR) (الموصوفة في نتائج). يتم تنفيذ أيا من هذه السلوكيات أثناء الحركة تحوي العادي أو السلوك تستخدم علفا. هذه السلوكيات هي أيضا متميزة من ردود مسة لطيفة واستجابة المتداول مكره لدرجات الحرارة العالية أو المنبهات الميكانيكية الضارة.
Protocol
Representative Results
Discussion
مقايسة الموصوفة هنا يمكن استخدامها لنوعيا وكميا تقييم حس الألم أو توعية مسبب للألم في يرقات مختلف الخلفيات الوراثية والتأثيرات البيئية، و / أو الظروف الناجمة عن الضرر. منذ هذا الاختبار يسمح لتطبيق التنسيق من التحفيز الباردة، مع هذه الأداة يمكن للمرء أن تقييم وظيفة م…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر سارة وو وكميل غراهام لتطوير المراحل المبكرة من فحص البارد التحقيق، ومركز بلومينغتون ذبابة الفاكهة المالية للأسهم ذبابة، وأعضاء المختبر Galko لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة NRSA (NIH F31NS083306) لHNT، والمعاهد الوطنية للصحة R01NS069828، R21NS087360 وجامعة تكساس MD اندرسون كلارك زمالة في البحوث الأساسية لMJG.
Materials
| Cold Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Thermal Control Unit | TE Technology | Custom Built enclosure | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | |
| Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Forceps | FST | FS-1670 | Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae |
| Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use. |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351008 | |
| 60 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351007 | |
| Piece of black vinyl (at least 2 x 2 inches) | Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe | ||
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | Used to move food |
| Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture |
Riferimenti
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13 (19), 2549-2561 (1999).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O’Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14 (2), 341-351 (1995).
- Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr Biol. 17 (24), 2105-2116 (2007).
- Im, S. H., Galko, M. J. Pokes, sunburn, and hot sauce: Drosophila as an emerging model for the biology of nociception. Dev Dyn. 241 (1), 16-26 (2012).
- Milinkeviciute, G., Gentile, C., Neely, G. G. Drosophila as a tool for studying the conserved genetics of pain. Clin Genet. 82 (4), 359-366 (2012).
- Turner, H. N., et al. The TRP Channels Pkd2, NompC, and Trpm Act in Cold-Sensing Neurons to Mediate Unique Aversive Behaviors to Noxious Cold in Drosophila. Curr Biol. , (2016).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12 (6), 1195-1206 (1994).
- Tsubouchi, A., Caldwell, J. C., Tracey, W. D. Dendritic filopodia, Ripped Pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch in Drosophila larvae. Curr Biol. 22 (22), 2124-2134 (2012).
- Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
- Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. J Vis Exp. (63), e3837 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Mol Cell Neurosci. 35 (2), 383-396 (2007).
- Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Curr Biol. 20 (5), 429-434 (2010).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Neely, G. G., et al. TrpA1 regulates thermal nociception in Drosophila. PLoS One. 6 (8), e24343 (2011).
- Zhou, Y., Cameron, S., Chang, W. T., Rao, Y. Control of directional change after mechanical stimulation in Drosophila. Mol Brain. 5, 39 (2012).
- Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. Elife. 4, e10735 (2015).
- Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Curr Biol. 21 (18), 1525-1533 (2011).
- Berrigan, D., Pepin, D. J. How Maggots Move – Allometry and Kinematics of Crawling in Larval Diptera. J. Insect Physiol. 41 (4), 329-337 (1995).
- Galko, M. J., Krasnow, M. A. Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae. PLoS Biol. 2 (8), E239 (2004).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
- Dar, A. C., Das, T. K., Shokat, K. M., Cagan, R. L. Chemical genetic discovery of targets and anti-targets for cancer polypharmacology. Nature. 486 (7401), 80-84 (2012).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Gill, R. D. Multistate life-tables and regression models. Math Popul Stud. 3 (4), 259-276 (1992).
- Mantel, N. Ranking procedures for arbitrarily restricted observation. Biometrics. 23 (1), 65-78 (1967).
- Breslow, N. A generalized Kruskal-Wallis test for comparing K samples subject to unequal patterns of censorship. Biometrika. 57 (3), 579-594 (1970).
- Gehan, E. A. A generalized wilcoxon test for comparing arbitrarily singly-censored samples. Biometrika. 52, 203-223 (1965).
