Nouveau test pour froid dans nociception<em> drosophile</em> larves

Summary

Ici , nous démontrons un essai de roman pour étudier nociception froid chez les larves de drosophile. Ce test utilise une sonde à effet Peltier sur mesure intégrée capable d'appliquer un stimulus froid délétère focale et se traduit par des comportements quantifiables à froid spécifiques. Cette technique permettra en outre la dissection moléculaire et cellulaire de nociception froid.

Abstract

Comment les organismes réagissent sens et à des températures nocives est encore mal comprise. En outre, les mécanismes sous-jacents sensibilisation des mécanismes sensoriels, comme chez les patients présentant une neuropathie périphérique ou la sensibilisation induite par blessure, ne sont pas bien caractérisées. Le modèle de Drosophila génétiquement traitable a été utilisé pour étudier les cellules et les gènes requis pour la détection de la chaleur nocive, qui a donné plusieurs gènes conservés d'intérêt. On sait peu cependant sur les cellules et les récepteurs importants pour la détection du froid délétère. Bien que, la drosophile ne survit pas à une exposition prolongée à des températures froides (≤10 ºC), et évitera frais, préférant des températures plus chaudes dans des essais de préférence du comportement, la façon dont ils détectent et peut – être éviter les stimuli nocifs froid n'a été étudié récemment.

Ici, nous décrivons et caractérisons le premier froid délétère (≤10 ºC) test de comportement enDrosophile. En utilisant cet outil et analyse, nous montrons un enquêteur comment évaluer qualitativement et quantitativement les comportements nociceptifs froids. Cela peut se faire dans des conditions normales de culture / santé, ou probablement dans le contexte de la maladie, d'une blessure ou d'une sensibilisation. De plus, ce dosage peut être appliqué à des larves sélectionnés pour les génotypes souhaités, ce qui pourrait avoir un impact sur thermosensation, la douleur, ou la sensibilisation nociceptive. Étant donné que la douleur est un processus hautement conservée, en utilisant cet essai pour étudier plus nociception thermique glanera probablement importante compréhension des processus de la douleur dans d'autres espèces, y compris les vertébrés.

Introduction

Drosophile est avéré être très utile pour l'identification de nouveaux gènes conservés et des circuits neuronaux qui sous – tendent les comportements complexes. Mouche de fournir une boîte à outils génétique sophistiqué et un système nerveux simplifié qui permettent la manipulation génétique et neuronale précise ^{1, 2, 3, 4} pour disséquer les bases cellulaires et moléculaires de la nociception ^{5, 6, 7.} Les larves sont particulièrement utiles pour ces analyses, étant donné que les tests comportementaux pour toucher doux ^{8, 9, 10,} de la chaleur nocive ^{11, 12, 13} et de la sensation mécanique de stimuli nocifs ^4, </sup> ¹¹ ont déjà été mis en place, et la cuticule des larves transparent permet une imagerie en temps réel ou fixe de l'épiderme et les neurones sensoriels sous – jacents. Récemment, un essai de froid délétère a également été mis au point ^7, que nous décrivons plus en détail ici.

Utilisation d' une fine sonde froide conique à pointe, nous montrons que les larves de Drosophila présentent un ensemble de comportements réactifs spécifiques à froid, distincte de comportements observés pendant la locomotion normale, après toucher doux, ou après stimuli de température mécanique ou secondaire dure ^{7, 8, 11} . Les comportements spécifiques à froid comprennent une contraction robuste de tout le corps (CT), une augmentation de 45-90º les segments postérieurs (PR) et une augmentation simultanée de la partie antérieure et postérieure des segments en forme de U (US). La prévalence de ces comportements augmente avec des températures décroissantes mais chacun des pics à slégèrement différentes températures froides. Des travaux récents suggèrent que les réponses CT sont médiées par différents neurones sensoriels périphériques que ceux qui répondent à la chaleur nocive ou stimuli mécaniques sévères ^7.

Tout comme les nocicepteurs vertébrés, Drosophila dendritique multiple (DM) les neurones sensoriels périphériques ont des structures dendritiques complexes qui arborisent sur l'épiderme ^1. md neurones sont présents dans tous les segments du corps de la larve, faisant saillie de leurs axones à la moelle épinière ventrale ^14. md neurones sensoriels sont séparés en quatre classes différentes (I-IV) sur la base de la morphologie dendritique et ont différentes fonctions sensorielles ^{4, 9, 10, 15, 16, 17.} Alors que les neurones de classe IV sont nécessaires pour les réponses des rouleaux du corps latéral larvairesà des températures élevées ou à des stimuli mécaniques sévères ^4, classe III neurones sont nécessaires pour des réponses tactiles doux ^{9, 10} et ne sont pas seulement activées par le froid, mais aussi sont nécessaires pour les réactions comportementales évoqués froides ^7. Les deux classes III et de classe IV canaux neurones utilisent des récepteurs potentiels discrets transitoire (TRP) pour faciliter les réponses comportementales aux nuisibles ^{7, 11, 18} et stimuli non nocifs ^{9, 10, 17, 19.} En outre, les larves nociception est sensibilisée après une blessure, au niveau cellulaire ²⁰ et comportementaux ^{12, 21.}

L'essai décrit ici permet de quantification soit normal ou potentiellement altéré réponses comportementales à des températures froides allant de froid nocive (≤ 10 ° C), refroidir inoffensif (11-17 ° C), à des températures ambiantes (18 à 22 ºC). Les températures froides utilisées dans ce test sont capables d'activer directement la classe III neurones sensoriels, provoquant une augmentation de calcium solides, reproductibles et les réactions comportementales évoqués à froid, qui peuvent être analysées qualitativement et quantitativement ^7. Cet essai peut être appliqué à des larves de pratiquement tous les génotypes, ainsi que pour les larves exposées à diverses conditions environnementales (modifié nutrition, des blessures, des agents pharmacologiques) pour déterminer les deux facteurs génétiques et environnementaux qui ont un impact nociception froid, la sensibilisation nociceptive ou plasticité nociceptive. Étant donné que thermosensation est omniprésente dans de nombreuses espèces, ce test constitue un outil précieux pour l'étude de la nociception et peut découvrir des gènes cibles nouvelles ou des interactions neuronales qui améliorerontnotre compréhension de nociception vertébrés.

La sonde froide intégré personnalisé (voir sonde froide, Table des matières) utilise un dispositif à effet Peltier température en boucle fermée contrôlé, qui refroidit l'arbre d'aluminium et pointe conique par conduction thermique. Une thermistance est noyée à l'intérieur de la pointe conique d'aluminium rapports de la température en temps réel sur l'unité de commande. Un dissipateur de chaleur et le ventilateur sont fixés sur le module thermoélectrique pour réguler la charge thermique de l' effet Peltier (Qc) de sorte que la plage de température désirée de (22-0 ° C) peut être obtenue (voir Unité de contrôle thermique, Table des Matières). Le stimulus nocif à froid de la pointe de sonde froide est appliquée à la main à la ligne médiane dorsale, à segment (s) à égale distance des extrémités antérieure et postérieure ( à peu près le segment A4, voir la figure 1A) de la larve. En réponse à des stimuli froids, les larves produisent généralement l'un des trois comportements évoqués à froid à l'intérieur de la coupure d'un 10: un corps pleincontraction (CT), une augmentation de 45-90º segments antérieur et postérieur en forme de U (US), ou une augmentation des segments postérieurs (PR) (décrits dans les résultats). Aucun de ces comportements sont effectués lors de la locomotion normale ou péristaltiques comportement alimentaire. Ces comportements se distinguent également des réponses tactiles douces et la réponse au roulement aversif à des températures élevées ou des stimuli mécaniques nocifs.

Protocol

1. Préparation de Larves Soulever des actions ou des croisements génétiques dans un incubateur à 25 ° C. Si la culture d'une croix, utilisez 20-25 femelles vierges et 15-20 mâles par flacon contenant la semoule de maïs régulier mouche médias. Permettre aux femelles de pondre des œufs pendant environ 48 h avant de les transférer dans un nouveau flacon de nourriture. 4-5 jours après la ponte d'oeufs, de recueillir 3 ème stade larves du génotype dési…

Representative Results

Les larves de Drosophila se déplacent avec un mouvement péristaltique qui comprend des pauses occasionnelles, tour à tour de tête, et des changements de direction 22. En réponse à l'application focale d'un stimulus froid délétère cependant, les larves présentent un ensemble de comportements uniques, contrairement au rouleau latéral aversif à la chaleur nocive et des stimuli mécaniques. Ces comportements sont également différents de …

Discussion

L'essai décrit ici peut être utilisé pour évaluer qualitativement et quantitativement nociception ou une sensibilisation nociceptive chez les larves de diverses origines génétiques, aux influences environnementales et / ou des conditions de dommages induits. Etant donné que ce dosage permet une application focale d'un stimulus froid, avec cet outil, on peut évaluer la fonction d'un sous-ensemble de neurones sensoriels périphériques spécifiquement pour répondre à des températures froides. Fait i…

Materials

Cold Probe	Pro-Dev Engineering	Custom-built on demand	Part numbers and construction details can be provided on request
Thermal Control Unit	TE Technology	Custom Built enclosure	Part numbers and construction details can be provided on request
Zeiss Stemi 2000 microscope	Zeiss	NT55-605
Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator	Dolan-Jenner Industries.	A20500
Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide	Schott North America, Inc.	Schott A08575
Forceps	FST	FS-1670	Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae
Paintbrush	Dick Blick Art Materials	06762-1002	Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use.
35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish	Falcon	351008
60 X 10 mm Polystyrene Petri Dish				Falcon	351007
Piece of black vinyl (at least 2 x 2 inches)			Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe
Fisherbrand Scoopula Spatula	Fisher Scientific	14-357Q	Used to move food
Kimtech Science Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture