Nieuwe test voor Cold Nociceptie in<em> Drosophila</em> Larven
Summary
Hier laten we zien een nieuwe test om koude nociceptie in Drosophila larven te bestuderen. Deze test maakt gebruik van een op maat gemaakte Peltier probe kunnen toepassen middelpunt schadelijke stimulus koude en resulteert in meetbare koud-specifiek gedrag. Deze techniek zal verder cellulaire en moleculaire dissectie van koude nociceptie mogelijk te maken.
Abstract
Hoe organismen voelen en te reageren op schadelijke temperaturen is nog steeds slecht begrepen. Verder zijn de onderliggende mechanismen sensibilisatie van de sensorische machines, zoals bij patiënten met perifere neuropathie of letsel geïnduceerde sensibilisatie, zijn niet goed gekarakteriseerd. De genetisch handelbaar Drosophila model is gebruikt om de cellen en genen die nodig zijn voor schadelijke tochtdetectie bestuderen die meerdere geconserveerde genen van belang heeft opgeleverd. Weinig is echter bekend over de cellen en receptoren belangrijk voor schadelijke koud detectie. Hoewel, Drosophila langdurige blootstelling aan koude temperaturen (≤10 ºC) niet overleeft, en wordt voorkomen dat cool, liever warmere temperaturen in behavioral voorkeur assays, hoe ze aanvoelen en eventueel te voorkomen schadelijke koude stimuli is pas sinds kort onderzocht.
Hier beschrijven wij en karakteriseren de eerste schadelijke koud (≤10 ºC) behavioral test inDrosophila. Met behulp van deze tool en assay tonen we een onderzoeker hoe koud nociceptieve gedrag kwalitatief en kwantitatief te beoordelen. Dit kan gedaan worden onder normale / gezonde kweekomstandigheden, of vermoedelijk in het kader van ziekte, verwonding of sensibilisatie. Verder kan deze bepaling worden toegepast op larven geselecteerd voor gewenste genotypes, wat kan beïnvloeden thermosensation, pijn of nociceptieve sensibilisatie. Aangezien pijn een sterk behouden proces met behulp van deze bepaling voor verdere studie thermische nociceptie waarschijnlijk vergaren belangrijke inzicht pijn processen in andere soorten, waaronder vertebraten.
Introduction
Drosophila heeft bewezen zeer nuttig voor de identificatie van nieuwe geconserveerde genen en neuronale circuits die complexe gedrag ten grondslag liggen zijn. Vliegen te verfijnde genetische toolkit en een vereenvoudigd zenuwstelsel waarmee nauwkeurige genetische manipulatie en neuronale 1, 2, 3, 4 om de cellulaire en moleculaire basis van nociceptie 5, 6, 7 ontleden. Larven zijn bijzonder bruikbaar voor deze analyses, aangezien behavioral tests voor zachte aanraking 8, 9, 10, schadelijke warmte 11, 12, 13 en mechanische sensatie van schadelijke stimuli 4, </sup> 11 zijn reeds vastgesteld, en de transparante larvale cuticula maakt levende of vaste beeldvorming van de onderliggende epidermis en sensorische neuronen. Onlangs is een test voor schadelijke koud is ook ontwikkeld 7, die we in meer detail beschrijven hier.
Met een fijne, conisch getipt koude probe wordt aangetoond dat vertonen Drosophila larven een aantal koude-specifieke reactieve gedrag, verschillend van gedragingen die tijdens normaal voortbewegen, na zachte aanraking, of na zware mechanische of hoge temperatuur stimuli 7, 8, 11 . De koude-specifieke gedragingen, zoals een robuust full-body contractie (CT), een 45-90º verhoging van de achterste segmenten (PR) en een gelijktijdige verhoging van de voorste en achterste segmenten in een U-vorm (US). De prevalentie van deze gedragingen toeneemt met afnemende temperatuur, maar elke pieken bij slichtjes verschillende koude temperaturen. Recent onderzoek suggereert dat CT responsen gemedieerd door verschillende perifere sensorische neuronen dan die reageren op schadelijke warmte of agressieve mechanische stimuli 7.
Net als nociceptoren vertebraat, Drosophila meerdere dendritische (md) perifere sensorische neuronen complexe dendritische structuren die arborize via epidermis 1. md neuronen aanwezig in alle larvale lichaamssegment, projecteren de axonen op de ventrale zenuwkoord 14. md sensorische neuronen worden gescheiden in vier verschillende klassen (I-IV) op basis van dendritische morfologie en hebben verschillende gevoelsfuncties 4, 9, 10, 15, 16, 17. En klasse IV neuronen vereist larven zijdelingse rolbewegingen reactieshoge temperaturen of zware mechanische stimuli 4, klasse III neuronen vereist voor zachte aanraking reacties 9, 10 en worden niet alleen geactiveerd door koude, maar ook vereist voor de koude opgewekte gedragsreacties 7. Zowel klasse III en klasse IV neuronen gebruiken discrete transient receptor potential (TRP) kanalen gedragsreacties aan schadelijke 7, 11, 18 en onschadelijke stimuli 9, 10, 17, 19 te vergemakkelijken. Verder wordt larvale nociceptie gesensibiliseerd volgende blessure, op het cellulaire 20 en gedragsmatige niveaus 12, 21.
De hier beschreven test maakt de quantification hetzij normaal of potentieel veranderd gedragsreacties op koude temperaturen van schadelijke koude (≤ 10 ° C), onschadelijke koel (11-17 ° C), bij omgevingstemperatuur (18-22 ° C). De koude temperaturen die in deze assay die direct activeren III sensorische neuronen, uitlokken robuust, reproduceerbaar calcium verhoogt en koud opgewekte gedragsreacties, die kwalitatief en kwantitatief kan worden geanalyseerd 7. Deze test kan worden toegepast op larven van vrijwel elke genotype en larven blootgesteld aan verschillende omgevingsomstandigheden (veranderde voeding, verwonding, farmacologische middelen) zowel genetische en omgevingsfactoren die invloed koude nociceptie, nociceptieve sensibilisatie of nociceptieve plasticiteit bepalen. Aangezien thermosensation alomtegenwoordig in vele soorten, deze test een waardevol hulpmiddel voor de studie van nociceptie en kunnen nieuw gen doelen of neuronale interacties verbetert ontdekkenons begrip van gewervelde nociceptie.
De op maat gemaakte koude probe (zie koude sonde, Table of Materials) gebruikt een gesloten lus geïsoleerde Peltier-inrichting, waarbij de aluminium schacht en conische punt met warmtegeleiding afkoelt. Een thermistor is ingebed in het aluminium kegelpunt meldt de real-time temperatuur op de bedieningseenheid. Een koelelement en de ventilator zijn verbonden aan de thermo-module warmtebelasting het Peltier effect is (Qc) zodat het gewenste temperatuurbereik van (22-0 ° C) worden bereikt regelen (zie Thermal regeleenheid, tabel of Materials). De schadelijke stimulus koude van de sondepunt koude wordt handmatig aangebracht op de dorsale middellijn, om segment (en) op gelijke afstand van voorste en achterste einden (ruwweg segment A4, zie Figuur 1A) van de larve. In reactie op koude stimuli, larven produceren in het algemeen een van de drie koude opgewekte gedrag binnen een 10 s cutoff: een full bodycontractie (CT), een 45-90º verhoging van voorste en achterste segmenten in een U-vorm (US) of een verhoging van het achterste segmenten (PR) (Results beschreven). Geen van deze gedragingen worden uitgevoerd tijdens de normale peristaltische beweging of foerageergedrag. Dit gedrag ook verschillend van zachte aanraking reacties en de rollen aversieve respons op hoge temperaturen of schadelijke mechanische stimuli.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven test kan worden gebruikt om nociceptie of nociceptieve sensibilisatie kwalitatief en kwantitatief beoordelen larven van verschillende genetische achtergronden, omgevingsinvloeden en / of beschadiging geïnduceerde omstandigheden. Aangezien deze test maakt voor focale toepassing van een koude stimulus, dit gereedschap kan men de functie van een subset van perifere sensorische neuronen evalueren specifiek reageren op lage temperaturen. Interessant is dat deze koud opgewekte gedrag lijken verschillende k…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Sarah Wu en Camille Graham voor de ontwikkeling van de vroege stadia van de koude probe assay, de Bloomington Drosophila Stock Center for fly voorraden en Galko lab leden voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door NIH NRSA (NIH F31NS083306) naar HNT, en door het NIH R01NS069828, R21NS087360 en een Universiteit van Texas MD Anderson Clark Fellowship in Basic Research naar MJG.
Materials
| Cold Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Thermal Control Unit | TE Technology | Custom Built enclosure | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | |
| Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Forceps | FST | FS-1670 | Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae |
| Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use. |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351008 | |
| 60 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351007 | |
| Piece of black vinyl (at least 2 x 2 inches) | Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe | ||
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | Used to move food |
| Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture |
Riferimenti
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13 (19), 2549-2561 (1999).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O’Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14 (2), 341-351 (1995).
- Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr Biol. 17 (24), 2105-2116 (2007).
- Im, S. H., Galko, M. J. Pokes, sunburn, and hot sauce: Drosophila as an emerging model for the biology of nociception. Dev Dyn. 241 (1), 16-26 (2012).
- Milinkeviciute, G., Gentile, C., Neely, G. G. Drosophila as a tool for studying the conserved genetics of pain. Clin Genet. 82 (4), 359-366 (2012).
- Turner, H. N., et al. The TRP Channels Pkd2, NompC, and Trpm Act in Cold-Sensing Neurons to Mediate Unique Aversive Behaviors to Noxious Cold in Drosophila. Curr Biol. , (2016).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12 (6), 1195-1206 (1994).
- Tsubouchi, A., Caldwell, J. C., Tracey, W. D. Dendritic filopodia, Ripped Pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch in Drosophila larvae. Curr Biol. 22 (22), 2124-2134 (2012).
- Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
- Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. J Vis Exp. (63), e3837 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Mol Cell Neurosci. 35 (2), 383-396 (2007).
- Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Curr Biol. 20 (5), 429-434 (2010).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Neely, G. G., et al. TrpA1 regulates thermal nociception in Drosophila. PLoS One. 6 (8), e24343 (2011).
- Zhou, Y., Cameron, S., Chang, W. T., Rao, Y. Control of directional change after mechanical stimulation in Drosophila. Mol Brain. 5, 39 (2012).
- Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. Elife. 4, e10735 (2015).
- Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Curr Biol. 21 (18), 1525-1533 (2011).
- Berrigan, D., Pepin, D. J. How Maggots Move – Allometry and Kinematics of Crawling in Larval Diptera. J. Insect Physiol. 41 (4), 329-337 (1995).
- Galko, M. J., Krasnow, M. A. Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae. PLoS Biol. 2 (8), E239 (2004).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
- Dar, A. C., Das, T. K., Shokat, K. M., Cagan, R. L. Chemical genetic discovery of targets and anti-targets for cancer polypharmacology. Nature. 486 (7401), 80-84 (2012).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Gill, R. D. Multistate life-tables and regression models. Math Popul Stud. 3 (4), 259-276 (1992).
- Mantel, N. Ranking procedures for arbitrarily restricted observation. Biometrics. 23 (1), 65-78 (1967).
- Breslow, N. A generalized Kruskal-Wallis test for comparing K samples subject to unequal patterns of censorship. Biometrika. 57 (3), 579-594 (1970).
- Gehan, E. A. A generalized wilcoxon test for comparing arbitrarily singly-censored samples. Biometrika. 52, 203-223 (1965).
